一种穗花杉双黄酮的制备方法.pdf

本发明属于医药技术领域，提供了一种从中药卷柏中制备含量在95％以上的穗花杉双黄酮(amentoflavone)的制备方法。该化合物具有如下式(I)的结构。本发明中所述的穗花杉双黄酮(amentoflavone)是采用卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草原料为起始原料，用有机溶剂和/或水进行提取并且采用柱层析分离法进行分离得到的。本发明具有工艺操作简单、重复性好，产率高，适合于工业化生产的优点，且本产品的纯度较高，其含量采用HPLC法检测在95％以上。

1、  一种穗花杉双黄酮，具有如下式(I)的结构：其特征在于：其含量在95％以上。


2、  根据权利要求1所述的穗花杉双黄酮，其特征在于：所述穗花杉双黄酮的英文名为：amentoflavone；分子式为C₃₀H₁₈O₁₀；分子量为538.47。

3、  一种如权利要求1所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：该方法采用中药卷柏为原料，用有机溶剂和/或水进行提取或采用柱层析进行分离。

4、  根据权利要求3所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：所述的中药卷柏为：卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草原料。

5、  根据权利要求3所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：所述的提取方法中，所述溶剂包括乙醇、甲醇、水中的一种，乙醇、甲醇中的一种与水按比例1∶10～10∶1混合的混合溶剂。

6、  根据权利要求3所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：所述的柱层析分离方法中，所用柱层析吸附剂为硅胶、Sephadex LH-20。

7、  根据权利要求3所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：所述的柱层析分离方法中，所用柱层析洗脱剂为石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或任意两种按比例10∶1～1∶10混合的混合有机溶剂。

8、  根据权利要求3所述的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于：所述具体方法包括以下步骤：
a)将卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草原料切成寸段；
b)用乙醇、甲醇、水中的一种或乙醇和甲醇中的一种与水按比例1∶10～10∶1混合的混合溶剂回流提取，加入相当于药材重量的2-16倍溶剂，回流提取1-5次，每次0.5至6小时，合并提取液，滤过，得提取液；
c)将提取液回收溶剂并浓缩至60℃下相对密度为1.05-1.40的清膏或稠膏，放置0.5-24小时，滤过，得固体沉淀物；
d)固体沉淀物用2-100倍量(重量/体积比)的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或任意两种按比例1∶10～10∶1混合的混合溶剂溶解；
e)将固体沉淀物的有机溶剂或混合有机溶剂加入以硅胶为吸附剂的层析柱上吸附；
f)将吸附固体沉淀物的硅胶层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一种或任意两种按比例1∶10～10∶1混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇10∶1～1∶1的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，以三氯甲烷∶甲醇10∶1～1∶1为展开剂采用TLC检查斑点，合并相同的黄色斑点洗脱流份；
g)将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末；
h)将黄色固体粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或任意两种按比例1∶10～10∶1混合的混合有机溶剂溶解；
i)将黄色固体粉末的有机溶剂或混合有机溶剂加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附；
j)将吸附黄色固体粉末的Sephadex LH-20层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一种或任意两种按比例1∶10～10∶1混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇10∶1～1∶1的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全；以三氯甲烷∶甲醇10∶1～1∶1为展开剂采用TLC跟踪检查斑点，合并相同的黄色斑点洗脱流份；
k)将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮精制品，其含量采用HPLC法检测应在95％以上。

9、  根据权利要求1所述的穗花杉双黄酮，其特征在于：所述的穗花杉双黄酮可以和药学上可接受的载体或赋形剂结合制备成临床上可接受的各种制剂。

10、  根据权利要求8所述的穗花杉双黄酮，其特征在于：所述的制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、滴丸。

一种穗花杉双黄酮的制备方法
技术领域：
本发明涉及卷柏中穗花杉双黄酮(amentoflavone)的制备方法，其含量采用HPLC法检测应在95％以上。属于中药提取分离、纯化领域。
背景技术：
中国药典2005年版中规定卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草。全年均可采收，除去须根及泥沙，晒干。辛，平。归肝、心经。具有活血通经。用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤。卷柏炭化瘀止血。用于吐血，崩漏，便血，脱肛。卷柏中含有多种化学成分，如黄酮类，现已发现卷柏中含有芹菜素(apigenin)、穗花杉双黄酮(amentoflavone)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)、异柳杉素(isocryptomerin)及阿曼托黄色(amentoflavone)等；苯丙素类、生物碱类、酚类、有机酸类等化合物。药理作用显示具有：免疫及抗肿瘤作用、对血液系统的作用、抗病毒、抑菌与抗炎作用、镇痛镇静等作用。本发明提供了一种方便、简便、快速的制备高纯度穗花杉双黄酮的方法。目前现有技术中未见此穗花杉双黄酮的提取方法。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从中药卷柏中提取一种含量在95％以上的穗花杉双黄酮(amentoflavone)的制备方法，目的是通过简单的工艺过程得到含量较高(含量大于95％)的穗花杉双黄酮(amentoflavone)。
本发明的技术方案是：从中药卷柏中提取一种含量在95％以上的穗花杉双黄酮(amentoflavone)的制备方法，其具体方法步骤为：
a)将卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草原料切成寸段；
b)用乙醇、甲醇、水中的一种或乙醇和甲醇中的一种与水按比例(1∶10～10∶1)混合和/或与水混合的混合溶剂回流提取，加入相当于药材重量的2-16倍溶剂，回流提取1-5次，每次0.5至6小时，合并提取液，滤过，得提取液；
c)将提取液回收溶剂并浓缩至相对密度为1.05-1.40(60℃)的清膏或稠膏，放置0.5-24小时，滤过，得固体沉淀物。
d)固体沉淀物用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或任意两种按比例(1∶10～10∶1)混合的混合溶剂溶解。
e)将固体沉淀物的有机溶剂或混合有机溶剂加入以硅胶为吸附剂的层析柱上吸附。
f)将吸附固体沉淀物的硅胶层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一种或任意两种按比例(1∶10～10∶1)混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇(10∶1～1∶1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，以三氯甲烷∶甲醇(10∶1～1∶1)为展开剂采用TLC检查斑点，合并相同的黄色斑点洗脱流份。
g)将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末。
h)将黄色固体粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或几种按比例(1∶10～10∶1)混合的混合有机溶剂溶解。
i)将黄色固体粉末的有机溶剂或混合有机溶剂加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。
j)将吸附黄色固体粉末的Sephadex LH-20层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一种或任意两种按比例(1∶10～10∶1)混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇(10∶1～1∶1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全。以三氯甲烷∶甲醇(10∶1～1∶1)为展开剂采用TLC跟踪检查斑点，合并相同的黄色斑点洗脱流份。
k)将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法检测应在95％以上。

穗花杉双黄酮
穗花杉双黄酮结构解析：

Figure    The structure of amentoflavone
黄色粉末，FeCL₃反应，盐酸-镁粉反应均呈阳性，提示其可能为黄酮类化合物。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)谱与单一黄酮氢谱图比较发现δ6.78(1H，s，H-II3)，6.82(1H，s，H-I3)为双黄酮两个3位质子信号；并且在氢谱低场区有6个羟基质子信号：分别为δ13.09(1H，s，H-I5)，12.96(1H，s，H-II5)为两个黄酮的5-羟基；δ10.55(2H，brs，4″-OH和H-4″′-OH)；10.82(1H，s，7-OH)，10.28(1H，s，7″-OH)，结合¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)谱中给出的30个碳信号，进一步提示该化合物可能为双黄酮。氢谱中δ6.45(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.18(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)提示为黄酮A环间位偶合质子，说明某一个黄酮A环为5，7-二羟基取代；氢谱中唯一剩下的一个尖锐单峰信号为δ6.39(1H，s)，推测可能为另一个黄酮的6位或8位质子，说明该双黄酮化合物是由一个黄酮结构单元A环上的6位或8位与另一个黄酮B环的某个质子相连。δ7.58(2H，d，J＝8.7Hz，H-2″′，6″′)，δ6.72(2H，d，J＝8.7Hz，H-3″′，5″′)提示为其中一个黄酮B环对位取代时形成的AA′BB′偶合系统。
此时氢谱中还剩下3个氢信号，根据峰型和偶合常数，推测其中一个黄酮B环为ABX偶合系统，同时也进一步说明这两个黄酮通过其中一个B环的3′或5′位与另一个黄酮的6位或8位质子相连，具体归属如下：δ7.15(1H，d，J＝9.3Hz)，δ8.01(1H，d，J＝2.0Hz，6.9Hz)，δ7.99(1H，d，J＝2.0Hz)(以上构成ABX系统)。通过与单黄酮的¹³C NMR相比较，其中一个黄酮的C-8移向低场区，化学位移值增大约6ppm，表明确实有其它基团相连，结合氢谱中黄酮B环存在的ABX偶合系统，进一步推断两个单黄酮确实以3′-8″连接。根据以上质子分布情况，故推测该化合物为amentoflavone。结构如Figure.
Table amentoflavone ¹H NMR和¹³C NMR数据归属(300、75MHz，DMSO-d₆)


本发明的优点是：
(1)工艺操作简单、重复性好，产率高，适合于工业化生产。
(2)本产品的纯度较高，其含量采用HPLC法检测在95％以上。
穗花杉双黄酮(amentoflavone)的应用：
(1)本发明的穗花杉双黄酮(amentoflavone)适合于制备临床上使用的1类新药制剂。
(2)本发明的穗花杉双黄酮(amentoflavone)也可以与其它化合物或药物联合使用，制备临床上使用的新药制剂。
(3)本发明的穗花杉双黄酮(amentoflavone)可以制成各种临床上使用的药物剂型。
(3)本发明的穗花杉双黄酮(amentoflavone)也可以做为对照品使用。
(4)本发明的穗花杉双黄酮(amentoflavone)也可以制成各种临床上使用的保健食品以及功能性化妆品。
具体实施方式：
下面结合实施例来更详细的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1：
将干燥卷柏全草100g，切成寸段，加30％乙醇回流提取三次，每次加入11倍量，每次2小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.30(60℃)的清膏，放置12小时，滤过，得固体沉淀物。将固体沉淀物用40倍量的甲醇溶解后加入以硅胶为吸附剂的层析柱上吸附。硅胶层析柱用三氯甲烷与甲醇(10∶1～1∶1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/40总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇3∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末。将黄色固体粉末用30倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(3∶1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇4∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法检测为98.1％上。
实施例2：
将干燥卷柏全草2kg，切成寸段，加75％乙醇回流提取三次，每次加入10倍量，每次1.5小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(60℃)的清膏，放置8小时，滤过，得固体沉淀物。将固体沉淀物用30倍量的乙酸乙酯溶解后加入以硅胶为吸附剂的层析柱上吸附。硅胶层析柱用三氯甲烷与甲醇(10∶1～1∶1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇2∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末。将黄色固体粉末用20倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(4∶1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/20总量洗脱剂的体积量收集SephadexLH-20层析柱的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇2∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法检测为96.6％。
实施例3：
将干燥卷柏全草30kg，切成寸段，加50％乙醇回流提取三次，每次加入9倍量，每次1.5小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25(60℃)的清膏，放置6小时，离心，得固体沉淀物。将固体沉淀物用20倍量的丙酮溶解后加入以硅胶为吸附剂的层析柱上吸附。硅胶层析柱用三氯甲烷与甲醇(10∶1～1∶1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/20总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇3∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末。将黄色固体粉末用10倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(3∶1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷∶甲醇3∶1为展开剂)，合并相同的黄色斑点洗脱流份。将合并的相同黄色斑点洗脱流份回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法检测为95.3％。