一种测定刺参摄食偏好程度的方法 技术领域 ：
本发明涉及动物养殖技术领域，尤其涉及一种测定刺参摄食偏好程度的方法。 背景技术 ：
动物选择的食物类型受到最适性原则 (optimality principles) 的制约。 即动物在 投资最小和收益最大的情况下进行觅食。 这导致有多种食物存在时，动物对食物的偏好 程度不同，表现出偏好、无偏好或拒斥某些食物。 研究动物摄食偏好有助于研究养殖动 物的食物来源和食性，研制适口饲料 ；还有助于分析动物的取食习性、进化策略以及在 异质生境中对食物斑块的选择能力，进而研究动物的分布和群落结构，为基础生态学、 保护生物学和生态养殖相关技术提供必要的依据。
传统研究动物对食物偏好程度的方法中，包括测定饲食比、选择性指数、 Murdoch 指数、偏好系数、Manlyα 偏好系数、Rogers 偏好系数等等。 这些指数往往是通 过统计食物减少的重量或数量、动物与食物接触频率等直接指标得到的。 通常适用于研 究容易识别 ( 大型生物个体 )、容易统计 ( 不溶失、不易吸水 ) 的食物和摄食行为明显的 生物。 而对个体小和摄食行为不明显的生物，以及不易称重的食物缺乏实际应用价值。
刺参属于海参纲，是一种重要的经济动物，在我国有广阔的市场需求。 然而由 于刺参体色与栖息环境相近、所摄食的沉积物成分复杂、不易称重，对其摄食偏好程度 的研究尚处于停滞阶段，成为刺参养殖产业健康发展的瓶颈。 发明内容 ：
针对现有技术缺乏有效测定刺参摄食偏好程度的方法，为了克服上述各种现有 测定动物摄食偏好程度方法的局限，本发明的目的在于提供一种可精确测量、易于操作 的测定刺参摄食偏好程度的方法。
本发明的技术方案是 ：
一种测定刺参摄食偏好程度的方法，包括以下步骤 ：
(1) 称取占待测食物 A 质量 1-5 ％的不溶重金属氧化物或重金属盐作为指示剂 ( 含有重金属元素 a)，不溶的重金属氧化物包括但不限于 CuO、 Cr2O3 或 MnO2，重金属 盐包括但不限于 AgCl 或 BaSO4。
(2) 将称取的指示剂加入蒸馏水配制成悬浊液，悬浊液中指示剂质量占 10 ～ 30％，经超声波清洗器均匀分散 (5 ～ 10min)，与待测食物 A 充分混合 (20 ～ 30min)。 将混有指示剂的食物 A 分别放置在 6 个培养皿中。
(3) 按上述方法配制混有不同指示剂的食物 B( 含有重金属元素 b)、食物 C( 含 有重金属元素 c)、 ...... 依此类推。
(4) 将盛有食物的培养皿随机放置在实验水槽内，供受试刺参选择。每个水槽放 置 2 个盛有同种食物的培养皿，共 3 个水槽。
(5) 刺参开始摄食后，每隔 6 小时收集刺参粪便，收集 5-10g，60℃烘干。 根据《中国动物志 · 海参纲》 等专著和文献的记载，海参纲生物的消化率极低，故忽略刺参 消化率对食物组成的影响，使用粪便代替肠道内含物。
(6) 同时取培养皿中食物 A、 B、 C、 ...... 样品 5-10g，60℃烘干。
(7) 使用元素分析仪，对食物 A、B、C...... 和肠道内含物中的元素 a、b、c...... 的 含量进行测定，测定结果的单位为 mg/kg。 样品制备过程和元素分析仪操作方法因仪器 不同而不同。
(8) 计算盛有食物 A、B、C...... 的培养皿的面积 ( 即培养皿底面积 ) 占食物总面 积 ( 即水槽底面积 ) 的比例，作为食物 A、 B、 C...... 在可获得食物中所占的比例。
(9) 按下式计算 ：
Ai， Ni， αi 肠含物， αij ＞ 0
其中 ：
γj ：对第 j 种食物的偏好度 ；
Aj ：第 j 种食物在肠道内含物中所占的比例 ( 重量 ) ；
Nj ：第 j 种食物在可获得食物中所占的比例 ( 面积 ) ；
αi 肠含物 ：肠道内含物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
αij ：第 j 种食物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
γj ＞ 1 ：偏好选择 ；γj ＝ 1 ：无选择 ；γj ＜ 1 ：厌恶选择 ；
以上计算式的推导过程如下 ：
使用 i 种重金属氧化物标记 j 种食物，第 j 种食物的重金属 i 含量的测定值为 αij， 由于不能确保其他食物中不含该重金属元素，同时需测定第 i 种重金属在其他食物中的 含量 αi1 ～ αin。 由于肠道内含物由 1 ～ j 种食物组成，则肠道内含物第 i 种重金属的含 量：
αi 肠含物＝ αi1×A1+αi2×A2+......αij×Aj ＊ (1)
* 其中 Aj 表示第 j 种食物占肠道内含物的比例 ；
另有， A1+A2+......Aj ＝ 1 (2)
其中 αi 肠含物和 αij 可使用仪器测得，即 (1) 和 (2) 可联立得出一个 j 元一次方程 组，求出第 j 种食物占肠道内含物的比例。 而第 j 种食物占可获得的食物的比例也可计算 出来。 那么，动物对第 j 种食物的偏好度可以用其占肠道内含物的比例与其占可获得食物 的比例表示。
本发明的有益效果是 ：
1、本发明使用的指示剂种类多，容易获取，可同时测定多种食物存在时刺参的
摄食偏好程度，简化实验过程，降低成本。
2、本发明通过在不易区分和容易溶失的天然食物、沉积物中加入指示剂，解决 了此类食物难以观察和统计的难题。
3、本发明使用元素分析仪测定指示剂重金属元素的含量，计算刺参摄食偏好 度，减少了以往通过人为观察和简单称量计算摄食偏好度存在的误差，提高了实验的精 度和可操作性。
4、本发明考虑了食物的可获得性，比单纯计算各种食物占肠道内含物比例的方 法更为客观，有实际应用价值。
5、本发明方法有应用于测定其他生物摄食偏好度的前景。 具体实施方式 ：
下面将结合具体实施例对本发明作进步描述。
实施例 1 ：
测定刺参对叶绿素含量不同的食物的摄食选择程度，具体如下 ：
(1) 待测刺参体重为 56.34±12.26g，测试前在流水水槽中暂养，连续充气，测 试前 24h 停止进食。
(2) 分别称取占食物质量 1-5％ ( 本实施例为 3％ ) 的 CuO、 Cr2O3、 MnO2 粉末 作为指示剂，分别加入蒸馏水配制成悬浊液，悬浊液中指示剂质量占 10 ～ 30％ ( 本实施 例为 20％ )，经超声波清洗器均匀分散 (5 ～ 10min)，对应混入预设叶绿素含量高、中、 低的沉积物 ( 食物 ) 中，充分混合 (20 ～ 30min)。
本实施例中，按照 GB/T 12763.6-2007 《海洋调查规范第 6 部分 ：海洋生物调 查》 所述分光光度法测定的食物高、中、低叶绿素 a 含量分别为 ：26.12±5.35μg/g、 11.61±3.42μg/g、1.05±0.58μg/g，使用 SPSS 16.0 统计软件进行 t 检验，结果表明 3 组 食物叶绿素 a 含量有显著差异 (P ＜ 0.05)。
(3) 将混有指示剂的预设叶绿素含量高、中、低的沉积物分别放置在半径 9cm 的 大培养皿中 ( 每种食物 6 个培养皿，共 18 个培养皿 )，参照 Uthicke， S.， Karez， R.， 1999.Sediment patch selectivity in tropical sea cucumbers(Holothurioidea ：Aspidochirotida) analysed with multiple choice experiments.J Exp Mar Biol Ecol 236，69-87.( 多重选择实验分 析热带海参 ( 海参纲 ：楯手目 ) 对沉积物斑块的选择 ) 中方法，培养混合好的沉积物。
(4) 将盛有培养好的叶绿素含量高、中、低的培养皿随机放置在半径 80cm，水 深 60cm 的实验水槽内，供受试刺参选择。 水槽底部铺有 1cm 厚洁净海砂。 每个水槽 中，放置盛有同种食物的培养皿 2 个。 本实施例共有 3 种食物，故每个水槽中共放置 6 个培养皿。 本实施例共 3 个水槽。
(5) 刺参开始摄食后，每隔 6 小时收集刺参粪便，收集 5g，60℃烘干。 共收集 5 天。 根据 《中国动物志 ·海参纲》 等专著和文献的记载，海参纲生物的消化率极低， 故忽略刺参消化率对食物组成的影响，使用粪便代替肠道内含物。
(6) 同时取大培养皿中叶绿素含量高、中、低食物及海砂的样品 5g，60 ℃烘 干。
(7) 使用美国热电公司火焰 - 石墨炉原子吸收光谱仪，测定叶绿素含量高、中、低的食物、肠道内含物、海砂中元素 Cu、 Cr、 Mn 的含量，测定结果的单位为 mg/kg。
(8) 计算盛有叶绿素含量高、中、低食物的培养皿、海砂的面积占总面积的比 例，作为叶绿素含量高、中、低的食物以及海砂占可获得食物的比例。 其中盛有叶绿素 含量高、中、低食物的培养皿占食物总面积的比例分别为 (j ＝高、中、 低 ) ；其中，rj 为培养皿的半径，本实施例为 9.0cm ；r 为水槽半径，本实施例为 67.7cm ； 海砂的面积占食物总面积的比例为 N 砂＝ 1-3Nj。
本实施例中，食物和海砂上没有障碍物，刺参可在其上自由爬行。 刺参接触食 物和海砂机会仅受其占总面积的比例影响，故使用盛有叶绿素含量高、中、低食物的培 养皿、海砂的面积占总面积的比例，作为叶绿素含量高、中、低的食物以及海砂占可获 得食物的比例。 本实施例中， Nj 见表 1。
表 1 各食物占可获得食物的面积比例 Nj(％ )
(9) 按下式计算 ：
Ai， Ni， αi 肠含物， αij ＞ 0
其中 ：
γj ：对第 j 种食物的偏好度 ；
Aj ：第 j 种食物在肠道内含物中所占的比例 ( 重量 ) ；
Nj ：第 j 种食物在可获得食物中所占的比例 ( 面积 ) ；
αi 肠含物 ：肠道内含物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
αij ：第 j 种食物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
γj ＞ 1 ：偏好选择 ；γj ＝ 1 ：无选择 ；γj ＜ 1 ：厌恶选择 ；
本实施例中，肠道内含物为叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂，肠道内含 物的重金属为 Cu、 Cr、 Mn 三种，其中 ：
α1 肠含物＝ α11×A1+α12×A2+α13×A3+α14×A4 (1)
α2 肠含物＝ α21×A1+α22×A2+α23×A3+α24×A4 (2)
α3 肠含物＝ α31×A1+α32×A2+α33×A3+α34×A4 (3)
A1+A2+A3+A4 ＝ 1 (4)
α1 肠含物、α2 肠含物、α3 肠含物分别表示肠道内含物中重金属 Cu、 Cr、 Mn 的含量 ； 本实施例中， α1 肠含物、 α2 肠含物、 α3 肠含物见表 2。
表 2 肠道内含物中重金属 Cu、 Cr、 Mn 的含量 αi 肠含物 (mg/kg)
α11、 α12、 α13、 α14 分别表示叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂中重金 属 Cu 的含量 ；本实施例中，α11 ＝ 19.11mg/kg ；α12 ＝ 550.17mg/kg ；α13 ＝ 19.11mg/ kg ；α14 ＝ 14.28mg/kg。
α21、α22、α23、α24 分别表示叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂中重金属 Cr 的含量 ；本实施例中，α21 ＝ 20.71mg/kg ；α22 ＝ 20.71mg/kg ；α23 ＝ 155.83mg/kg ； α24 ＝ 1.97mg/kg。
α31、α32、α33、α34 分别表示叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂中重金属 Mn 的含量 ；本实施例中，α31 ＝ 223.12mg/kg ；α32 ＝ 126.28mg/kg ；α33 ＝ 126.31mg/ kg ；α34 ＝ 68.99mg/kg。
A1、 A2、 A3、 A4 分别表示叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂占肠道内含物 的比例。 根据以上数据，可以计算出来， A1、 A2、 A3、 A4 见表 3。
表 3 叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂占肠道内含物的比例 Aj(％ )
本实施例中，根据步骤 (9) 中的公式计算刺参摄食偏好度 γj 的结果见表 4，结 果表明刺参厌恶摄食几乎不含有机物的海砂，偏好摄食叶绿素含量低的食物，对高、中 叶绿素含量的食物无选择。
表 4 刺参对叶绿素含量不同的食物的摄食选择程度 γj
注 ：* 表示使用 SPSS 16.0 统计软件进行的 t 检验，偏好度与 1 有显著差异 (P ＜ 0.05)。
** 偏好度与 1 有极显著差异 (P ＜ 0.01)。
实施例 2 ：
与实施例 1 的不同之处在于 ：
测定刺参对有机物含量不同的食物的摄食选择程度，具体如下 ：
(1) 待测刺参体重为 56.34±12.26g，测试前在流水水槽中暂养，连续充气，测 试前 24h 停止进食。
(2) 使用鼠尾藻粉与海泥按 2 ∶ 5、1 ∶ 5 和 1 ∶ 10 重量比例配制有机物含量 高、中、低的沉积物 ( 食物 )。 分别称取占食物质量 1-5％ ( 本实施例为 4％ ) 的 CuO、 Cr2O3、 MnO2 粉末作为指示剂，分别加入蒸馏水配制成悬浊液，悬浊液中指示剂质量占 10 ～ 30％ ( 本实施例为 15％ )，经超声波清洗器均匀分散 (5 ～ 10min)，对应混入预设 有机物含量高、中、低的沉积物中，充分混合 (20-30min)。
(3) 将混有指示剂的预设有机物含量高、中、低的沉积物分别放置在半径 9cm 的 大培养皿中 ( 每种食物 6 个培养皿，共 18 个培养皿 )。
(4) 将盛有培养好的有机物含量高、中、低的培养皿随机放置在半径 80cm，水 深 60cm 的实验水槽内，供受试刺参选择。 水槽底部铺有 1cm 厚洁净海砂。 每个水槽 中，放置盛有同种食物的培养皿 2 个。 本实施例共有 3 种食物，故每个水槽中共放置 6 个培养皿。 本实施例共 3 个水槽。
(5) 刺参开始摄食后，每隔 6 小时收集刺参粪便，收集 5g，60℃烘干。 共收集 3 天。 根据 《中国动物志 ·海参纲》 等专著和文献的记载，海参纲生物的消化率极低， 故忽略刺参消化率对食物组成的影响，使用粪便代替肠道内含物。
(6) 同时取大培养皿中有机物含量高、中、低食物及海砂的样品 5g，60 ℃烘 干。
(7) 使用美国热电公司火焰 - 石墨炉原子吸收光谱仪，测定有机物含量高、中、 低的食物、肠道内含物、海砂中元素 Cu、 Cr、 Mn 的含量，测定结果的单位为 mg/kg。
(8) 计算盛有有机物含量高、中、低食物的培养皿、海砂的面积占总面积的比 例，作为有机物含量高、中、低的食物以及海砂占可获得食物的比例。 其中盛有有机物 含量高、中、低食物的培养皿占食物总面积的比例分别为 (j ＝高、中、 低 )， rj 为培养皿的半径，本实施例为 9.0cm， r 为水槽半径，本实施例为 67.7cm ；海砂 的面积占食物总面积的比例为 N 砂＝ 1-3Nj。
本实施例中，食物和海砂上没有障碍物，刺参可在其上自由爬行。 刺参接触食 物和海砂机会仅受其占总面积的比例影响，故使用盛有有机物含量高、中、低食物的培 养皿、海砂的面积占总面积的比例，作为有机物含量高、中、低的食物以及海砂占可获 得食物的比例。 本实施例中， Nj 见表 5。
表 5 各食物占可获得食物的面积比例 Nj(％ )
(9) 按下式计算 ：
Ai， Ni， αi 肠含物， αij ＞ 0
其中 ：
γj ：对第 j 种食物的偏好度 ；
Aj ：第 j 种食物在肠道内含物中所占的比例 ( 重量 ) ；
Nj ：第 j 种食物在可获得食物中所占的比例 ( 面积 ) ；
αi 肠含物 ：肠道内含物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
αij ：第 j 种食物中第 i 种重金属的含量 (mg/kg) ；
γj ＞ 1 ：偏好选择 ；γj ＝ 1 ：无选择 ；γj ＜ 1 ：厌恶选择 ；
本实施例中，肠道内含物为有机物含量高、中、低三种食物及海砂，肠道内含 物的重金属为 Cu、 Cr、 Mn 三种，其中 ：
α1 肠含物＝ α11×A1+α12×A2+α13×A3+α14×A4 (1)
α2 肠含物＝ α21×A1+α22×A2+α23×A3+α24×A4 (2)
α3 肠含物＝ α31×A1+α33×A2+α33×A3+α34×A4 (3)
A1+A2+A3+A4 ＝ 1 (4)
α1 肠含物、α2 肠含物、α3 肠含物分别表示肠道内含物中重金属 Cu、 Cr、 Mn 的含量 ； 本实施例中， α1 肠含物、 α2 肠含物、 α3 肠含物、 α4 肠含物见表 6。
表 6 肠道内含物中重金属 Cu、 Cr、 Mn 的含量 αi 肠含物 (mg/kg)
α11、α12、α13、α14 分别表示有机物含量高、中、低三种食物及海砂中重金属 Cu 的含量 ；本实施例中，α11 ＝ 19.11mg/kg ；α12 ＝ 581.7mg/kg ；α13 ＝ 19.11mg/kg ； α14 ＝ 14.28mg/kg。
α21、α22、α23、α24 分别表示有机物含量高、中、低三种食物及海砂中重金属 Cr 的含量 ；本实施例中，α21 ＝ 20.71mg/kg ；α22 ＝ 20.71mg/kg ；α23 ＝ 70.62mg/kg ； α24 ＝ 1.97mg/kg。
α31、α32、α33、α34 分别表示有机物含量高、中、低三种食物及海砂中重金属 Mn 的含量 ；本实施例中，α31 ＝ 209.21mg/kg ；α32 ＝ 126.31mg/kg ；α33 ＝ 126.31mg/ kg ；α34 ＝ 68.99mg/kg。
A1、 A2、 A3、 A4 分别表示有机物含量高、中、低三种食物及海砂占肠道内含物 的比例。 根据以上数据，可以计算出来， A1、 A2、 A3、 A4 见表 7。
表 7 叶绿素含量高、中、低三种食物及海砂占肠道内含物的比例 Aj(％ )
本实施例中，根据步骤 (9) 中的公式计算刺参摄食偏好度 γj 的结果见表 8，结 果表明刺参厌恶摄食几乎不含有机物的海砂，偏好摄食有机物含量低的食物，对高、中 有机物含量的食物无选择。
表 8 刺参对有机物含量不同的食物的摄食选择程度 γj
注 ：* 表示使用 SPSS 16.0 统计软件进行的 t 检验，偏好度与 1 有显著差异 (P ＜ 0.05)。
** 偏好度与 1 有极显著差异 (P ＜ 0.01)。
所有使用重金属氧化物或重金属盐作为指示剂标记食物，将指示剂悬浊液与食 物充分混匀供受试刺参摄食，通过测定食物、肠道内含物重金属元素含量计算刺参摄食 偏好的方法，都将落在本发明的保护范围之内。
经实施，共测定 2 批次刺参 36 头，结果表明刺参偏好摄食叶绿素和有机物含量 低的食物，厌恶摄食叶绿素和有机物含量极低的海砂，对叶绿素和有机物含量高的食物 无选择，结果与现有刺参食性研究一致，并能从生理生态学的角度加以合理解释。12