一种共表达人源谷氨酸脱羧酶和细胞因子的重组病毒.pdf

本发明描述了一种构建含表达人源GAD基因和细胞因子基因表达盒结构的重组病毒、尤其是构建一种共表达人源GAD65基因和GDNF基因的重组腺相关病毒的方法、用途和意义。此重组病毒所表达产生的人源GAD65和GDNF基因的蛋白产物对帕金森氏病和中枢神经系统的相关疾病治疗有较好协同作用，具有对相关疾病的治疗有重要价值。

1、  一种共表达人源谷氨酸脱梭酶(GAD，下同)和人细胞因子的重组病毒，尤其是共表达人源GAD65和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF，下同)的重组腺相关病毒(AAV)，其主要特征在于，重组病毒含有共表达人GAD65和人细胞因子的表达盒结构，所述表达盒结构由pCMV启动子、β-珠蛋白内含子、人源GAD、内部核糖体结合位点(IRES，下同)、人源细胞因子和人生长激素多聚腺嘌呤信号组成。

2、  根据权利要求1，所述的重组病毒，优选共表达人源GAD65和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF，下同)的重组腺相关病毒(AAV)，其特征在于，构建的表达盒结构如下：
a、pCMV启动子位于β-珠蛋白内含子的上游、β-珠蛋白内含子在其C-末端以内切酶BamH1拼接于人GAD65基因的N-末端；
b、人GAD65基因的C-末端以内切酶Xbal1拼接于IRES片段的N-末端；
c、IRES片段的C-末端以内切酶Smal1拼接于人GDNF基因的N-末端；
d、人GDNF基因的C-末端以内切酶Bgl11拼接于人生长激素多聚腺嘌呤信号片段的上游。

3、  根据权利要求1，所述的重组病毒，尤其是重组腺相关病毒所共表达的人源GAD65和GDNF基因的核苷酸及其编码氨基酸序列：
a、人源GAD65为亲本源于人的基因、为编码GAD65基因全长氨基酸的核苷酸序列；
b、人源GDNF为亲本源于人的基因、为编码成熟型GDNF氨基酸的核苷酸序列，且其N-未端融合了由人白细胞介素-2的20个氨基酸构成的分泌先导序列，替代了GDNF前蛋白的第一个氨基酸到第五十八个氨基酸序列，其C末端氨基酸序列不变。

4、  根据权利要求1，所述的重组病毒，尤其是重组腺相关病毒(AAV)含有共表达人源GAD65和人GDNF细胞因子基因组合的表达盒结构，这种表达盒结构所表达的基因组合可以是GAD和其他神经保护、促神经细胞再生、防止细胞凋亡功能的细胞因子，如转录因子Nurr1和pitx3、中脑星状细胞源性神经营养因子(MANF)、CDNG、Neurturin(NTN)和BDNF等基因中的一种所形成的基因组合；也包括了GAD和抗氧化、抗自由基的基因组合，如SOD1；还可以是GAD与多巴胺合成相关的细胞因子酪氨酸水解酶(TH)基因或GTP环水解酶基因中的一种所形成的基因组合的共表达。

5、  根据权利要求1和权利要求4，重组病毒，优选重组腺相关病毒(AAV)所共表达的基因组合，这种基因组合既可是本发明所叙述的表达盒结构，即由一个启动子驱动经内部核糖体结合位点IRES连接所述的共表达人源谷氨酸脱梭酶GAD和上述细胞因子共表达的表达盒结构、也可以是在同一重组病毒结构中由二个相同或不相同启动子分别驱动上述基因组合的基因表达，这些启动子既可以是源于病毒的启动子，也可以是源自于人的基因启动子。

6、  根据权利要求1，所述的重组病毒不仅仅限于AAV病毒，也包括了应用其他病毒，如腺病毒、慢病毒、泡疹病毒和逆转录病毒作为载体所构建的共表达GAD和上述细胞因子的重组病毒。

7、  根据权利要求1和权利要求2，克隆人GA65基因所应用的方法和引物设计，即采用的两步PCR法克隆人GA65基因以及引物设计。
具体操作如下：以人脑组织cDNA作为模板，应用人工合成的特异性引物，进行PCR反应，产生两个大小不同的PCR片段，PCR扩增产物经tailing反应后，进行克隆和测试，正确后进行拼接。
设计的引物如下：
a：产生GAD65的N-末端至C-末端内切酶Stu1位点片段的引物
5’-ccggatccgatggcatctccgggctctggcttttgg-3’
5’-tgtaaggccttgtctccagtgtcatag-3’
b.产生GAD65的内切酶Stu1位点至C-末端氨基酸合成终止子的引物
5’-gacaaggccttacagtgcggacgc-3’(stu1)
5’-gagcggccgctctagattataaatcttgtccaaggcgttctatt-3’。

8、  根据权利要求1和权利要求2，克隆和改建人GDNF基因N-末端所应用的方法和引物设计，即采用两步PCR法克隆和改建人GDNF基因N-末端的方法。
具体操作如下：应用合成的2个正向引物，即(1)、含部份编码人白细胞介素-2先导氨基酸的核苷酸引物；(2)、含部份人白细胞介素-2先导氨基酸的核苷酸序列和人GDNF的N-末端氨基酸的核苷酸序列的引物；以及1个反向引物，即人源GDNF基因C-末端核苷酸序列，以人脑cDNA为模板进行PCR扩增，采用二步PCR法克隆人源GDNF基因，并完成其N未端与人白细胞介素-2先导序列融合的改建。
两个正向引物设计如下：
a、5’-tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3’
b、5′-cctggtggaccgaatggtctcagccgaaaaaaaaacgtaaagtgtcaccagataaacaaatgg-3′
反向引物设计如下：
c、5’-tcaagcttcagatacatccacaccttt-3’
第二次PCR扩增产物经tailing反应，加上腺嘌呤(T)后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

9、  据权利要求1，所述的共表达人源谷氨酸脱梭酶GAD和细胞因子的重组病毒，优选共表达人源谷氨酸脱梭酶GAD65和GDNF的重组腺相关病毒在用于治疗中枢神经系统相关疾病，尤其是治疗帕金森氏病的基因治疗药物中的应用。

10、  根据权利要求9所述的共表达人源谷氨酸脱梭酶GAD和细胞因子的重组病毒，优选重组腺相关病毒在治疗中枢神经系统相关疾病的基因治疗药物中的应用，其特征是：其治疗中枢神经系统相关疾病的有效活性成分为人源谷氨酸脱梭酶GAD和细胞因子基因的表达蛋白质。

一种共表达人源谷氨酸脱羧酶和细胞因子的重组病毒
技术领域
本发明涉及一种共表达谷氨酸脱羧酶和细胞因子的重组病毒、尤其是重组腺相关病毒的构建及其制备方法，其所在的技术领域与生命科学和生物医药技术有关。
背景技术
研究证明哺乳类脑纹状体及纹状体投射区域的大多数神经元的神经递质为γ-氨基丁酸(GABA，下同)，GABA为哺乳类脑组织的主要抑制性神经递质，而谷氨酸脱羧酶(GAD，下同)是合成GABA限速酶，GAD有GAD 65和GAD 67两种同功酶(Lindefors N.et al：Prog.Neuropsycho.pharmacol.Biol Psychiatry.1993；17(6)：887-903)。有研究人员应用表达GAD65基因的腺相关病毒(AAV，下同)对动物模型帕金森氏病进行治疗性研究，结果显示帕金森氏症状有明显改善，电生理研究也证明增加GAD65在下丘核神经元的表达，可使下丘核神经元从兴奋性输出状态改变为抑制性输出状态(Lee B，et al：Gene Ther.2005 Aug；12(15)：1215-22；Emborg ME，et al：J Cereb Blood Flow Metab.2007 Mar；27(3)：501-9.)，这些研究为GAD治疗人帕金森氏病打下了坚实的基础。
新近报导，经批准，美国在12名晚期帕金森氏病患者应用表达GAD65基因的AAV对帕金森氏病进行了临床I期研究，结果表明帕金森氏症状有显著改善，耐受良好、安全、有效(Kaplitt MG，et al：Lancet.2007 Jun23；369(9579)：2056-8)。国内研究人员应用对人体无致病性的泡疹病毒作为表达载体在星状细胞进行表达GAD研究，但尚未在动物或人体对帕金森氏病进行治疗研究(Liu W，et al：Intervirology.2005Sep-Oct；48(5)：329-35；Liu W et al：Mol Ther.2007)。
此外，已经研究证明GABA合成酶GAD与惊厥、癫痫和小脑性共济失调症的发生有关。缺失GAD65的小鼠发生自发性癫痫，回交产生的GAD65缺失的小鼠癫痫发作易感性显著增加(Kash SF，et al：Proc Natl Acad SciUSA.1997 Dec 9；94(25)：14060-5))；而在癫痫动物模型脑相关部位移植表达GABA合成酶GAD的细胞可减少或阻断癫痫的发生(Gernert M，et al：Exp Neurol.2002 Jul；176(1)：183-92；W，et al：J NeurosciRes.1998 Jan 15；51(2)：196-209；Vulliemoz S，et al：J NeurolNeurosurg Psychiatry)。
毫无疑问，上述临床研究证实了GAD作为哺乳类脑神经细胞的主要抑制性神经递质GABA的合成限速酶用于治疗帕金森氏病是安全、有效的。不过，显然，这种治疗是一种改善帕金森氏病症状性的冶疗，并不能改变帕金森氏的病理进程以及由此产生的其他临床症状。
许多研究证明帕金森氏病的发生主要是各种原因，括遗传因素、环境因素、体内代谢产物自由基和脑血脑因素等引起纹状体及其相关投射区域神经核多巴胺神经元发生细胞凋亡所致，导致多巴胺合成，生产和分泌减少而引发帕金森氏病。因此，减缓或防止多巴胺神经元细胞凋亡是冶疗帕金森氏病的极其重要环节。
目前已知，神经细胞营养因子GDNF对减缓或防止多巴胺神经元细胞凋亡有较好作用。GDNF是大脑神经胶质细胞产生的，具有非常重要的、广泛的生物功能神经细胞因子，对中枢和外周的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作用，是目前发现的对多巴胺神经元和运动神经元作用最为显著的一类神经营养因子，有较广泛的促进神经元生长和分化的作用，尤其对多巴胺神经元作用最强(Lin LT et al.Science 1993.260(5111)：1130-2；Henderson et al.Science 1994，266(5183)：1062-4)。GDNF通过磷酸化作用活化在细胞存活中起关健作用的蛋白激酶Akt/PKB，促进神经细胞的增殖与分化，抑制神经细胞的凋亡，保护多巴胺神经细胞，能保护多巴胺神经细胞对抗有害因子，如过氧化物，自由基，缺血、缺氧造成的损害；增强多巴胺神经细胞摄取多巴胺的能力，增加多巴胺的贮存、释放；促进神经系统再生有着重要的作用。
国内外对神经营养因子GDNF的功能进行了广泛的研究，证明GDNF通过PI3K/Akt通路介导，明显缓和6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱发的染色质浓缩和DNA断裂；启动一系列抗凋亡信号途径而保护神经元，GDNF被认为是有希望的神经保护治疗药物(Do Thi NA，Saillour P，Ferrero L，DedieuJF，Mallet J，Paunio T.Gene Ther.2004 Jan 15；Patel NK et al，AnnNeurol.2005 Feb；57(2)：298-302)。
在人体帕金森氏病的治疗研究表明，直接将GDNF输入到帕金森氏病患者脑豆状核，可显著改善患者症状，一年后且无严重临床副作用；18个月后正电子扫描显示患者豆状核多巴胺贮存、摄取增加28％，表明GDNF对多巴胺神经元有直接作用(Heywood P.et al：Nat Med.2003 May；9(5)：589-95.Epub 2003 Mar 31；Slevin JT，et al：J Neurosurg.2005 Feb；102(2)：401.；Slevin JT，et al：Neurosurg Focus.2006 May 15；20(5)：E1)。
GDNF家族的另一成员Neurturin(NTN)和中脑星状细胞源性神经营养因子MANF被证明对多巴胺神经元有特异神经再生功能(Petrova P et al：JMol Neurosci.2003 Apr；20(2)：173-88；Liu WG et al：Mol Neurodegener.2007 Oct 1；2(1)：19)。而新近发现的保守多巴胺神经营养因子CDNG(conserved dopamine neurotrophic factor、CDNF)具有和GDNF相似的恢复和防止多巴胺神经元退化的作用(Lindholm P，et al：Nature.2007 Jul5；448(7149)：73-7)。
有意义的是，最近的研究表明在癫痫模型动物采用GDNF的基因冶疗能有效抑制或减少癫痫发生(Kanter-Schlifke I，et al：Mol Ther.2007Jun；15(6)：1106-13)。
同样，另一种人脑细胞源性神经营养因子(BDNF，下同)，是由脑细胞产生、分泌的一种有着重要生物功能的神经细胞营养因子。BDNF对中枢和外周的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作用，能促进某些神经群的生存和分化，调控神经突轴的轫力，并与海马的学习、记忆以及脊髓疼痛机制有关。
BDNF对多巴胺神经元的生存和生长亦有重要作用。它具有阻止凋亡细胞的死亡，增加酪氨酸水解酶阳性神经元的生存和此神经元纤维的生长(Ostergaard K，et al：Exp Neurol.1996 Dec；142(2)：340-50；Tang FI，et al：Exp Brain Res.1998 Apr；119(3)：287-96；Singh S，et al：IndianJ Exp Biol.2006 Sep；44(9)：699-704；胡旭东等.神经解剖学杂志，1998年02)。因此，BDNF作为一种强效神经保护因子，被认为是治疗某些中枢神经系统疾病的一个好的候选因子(Pezet S，et al：Expert OpinTher Targets.2004 Oct；8(5)：391-9)。
相关的研究也证明转录因子Nurr1能使胚胎干细胞分化成能分泌多巴胺的多巴胺神经元，并通过对BDNF表达的直接调控，影响中脑多巴胺神经的发育和功能(Volpicelli F，2007 Jul；102(2)：441-53；Hara K，J Neurosci Res.2007May 1；85(6)：1240-51；Park CH，FASEB J.2006 Dec；20(14)：2553-5；Sakurada K，Development.1999 Sep；126(18)：4017-26)。而转录因子Pitx3因其能调节酪氨酸水解酶(TH，下同)的表达，对中脑多巴胺神经元的发育和功能至关重要；Pitx3缺失鼠的黑质有早期多巴胺神经元发育障碍、选择性丢失多巴胺神经元(SimonHH，et al：Ann N Y Acad Sci.2003 Jun；991：36-47；Smidt MP，et al：Cell Tissue Res.2004 Oct；318(1)：35-43；Hwang DY，et al：Brain ResMol Brain Res.2003 Jun 10；114(2)：123-31；Smidt MP，et al：Development.2004 Mar；131(5)：1145-55；Maxwell SL，et al：Dev Biol.2005 Jun 15；282(2)：467-79；Messmer K，et al：Int J Dev Neurosci.2007Feb；25(1)：29-37)。新近的研究表明Pitx3有上调神经营养因子BDNF和GDNF表达的功能(Changgeng Peng，et al：FEBS Letters，2007，581(7)：1357-1361)，认为Pitx3可能是治疗帕金森氏病的一个好的靶基因。
近来，有研究证明应用转基因神经干细胞的方法，将与多巴胺合成的相关基因，如酪氨酸水解酶(TH)基因或GTP环水解酶基因导入帕金森氏病动物模型鼠脑组织中，能显著增加多巴胺的合成，并改善帕金森氏病的症状(Ryu MY，Cell Transplant.2005；14(4)：193-202)。
此外，研究发现氧化物应力是帕金森氏病多巴胺神经细胞死亡的一个重要介体，铜/锌过氧歧化酶(SOD1，下同)作为一种关健酶，在抗氧化物应力中起着十分重要的作用。研究证明，与正常人比较，帕金森氏病人脑黑质SOD1明显减少；细胞和动物实验表明腺病毒介导的SOD1有很强的神经保护作用，可有效防止methyl-4-phenylpyridiniumion(MPP，下同)和1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP，下同)诱导的神经退行性过程(Peng J et al：J Biol Chem.2005 Aug 12；280(32)：29194-8；Kunikowska G，et al：Brain brain Res.2003 Apr 11；968(2)：206-18；Tatton WG，et al：Ann Neurol.1998 Sep；44(3 Suppl 1)：S134-41)。
以上研究表明上述细胞因子，如GDNF及其家族成员、CDNG、转录因子Nurr1和Pitx3、MANF、BDNF和SOD1等具有抗细胞凋亡、神经细胞保护和恢复功能以及与多巴胺合成相关的基因，如酪氨酸水解酶(TH)或GTP环水解酶基因等，对中框神经系统多种疾病有冶疗效果，并且与GAD因子有较好相互协同作用。因此，基于以上的研究，构建一种共表达GAD和上述细胞因子的重组病毒，既可显著改善相关疾病患者的临床症状，又可阻止神经细胞进一步凋亡，促进神经细胞再生，以达到更有效冶疗中枢神经系统相关疾病之目标是可能的。
发明内容
本发明的目的是构建一种共表达人GAD和相关细胞因子的重组病毒以及利用其表达产物来治疗如本说明书中所描述的中枢神经系统相关疾病。
本发明的内容为构建共表达GAD和细胞因子的重组病毒，并优选共表达GAD65和GDNF基因组合的重组腺相关病毒(AAV，下同)为例；此重组病毒所表达的基因组合不仅仅包含有GAD和GDNF的共表达，也包括了GAD基因和其他具有神经保护、促神经细胞再生、抗氧化、防止细胞凋亡功能的或与多巴胺合成相关的细胞因子基因组合的共表达；所应用的病毒载体系统也不仅仅限于AAV病毒系统，也包括了应用其他病毒载体系统所构建的共表达GAD和上述细胞因子的重组病毒。
本发明以AAV为表达载体，更具体的是以AAV helper-free系统为表达载体，构建含共表达人GAD65和GDNF表达盒结构的重组AAV病毒，其主要特征为：
1)、共表达人源GAD和GDNF基因的表达系统为helper-free AAV系统；
2)、表达的GAD基因为人源GAD65基因；
3)、表达的人源GDNF为成熟型基因，即其N-末端比野生型人源GDNF缺失从第一位到第五十八位的58个氨基酸，且其N-末端融合有人白细胞介素-2的先导序列，其C末端序列维持氨基酸不变；
4)、共表达的人源GAD65和GDNF基因是通过内部核糖体结合位点(IRES)片段相连接；
5)、共表达人源GAD65和GDNF基因的表达盒结构由CMV启动子、β-珠蛋白外显子、人源GAD65基因、内部核糖体结合位点(IRES)片段、人源GDNF基因和人生长激素多聚腺嘌呤序列构成。
附图说明
附图1人源谷氨酸脱羧酶(GAD)GAD65基因的PCR产物：
提取脑组织总核糖核酸并合成cDNA，应用人工合成的特异性引物，以脑组织cDNA为模板进行PCR反应，其反应产物在1.5％琼脂糖电泳分离；纯化后进行克隆。第一泳道为DNA分子量标记物，第二泳道为GAD65基因大片段PCR产物，第三泳道为GAD65基因小片段PCR产物。箭头为PCR反应产物。
附图2人源谷氨酸脱羧酶GAD65基因的克隆：
经RT-PCR反应后，将纯化的PCR片段克隆于T-Easy载体；经测序证实后，将小片段PCR产物按正确方向拼接于大片段PCR产物上，构成含全长人源谷氨酸脱羧酶GAD65基因的氨基酸编码片段，用内切酶EcoR1消化，1.5％琼脂糖胶电泳分离。第一泳道为DNA分子量标记物、第二泳道为GAD65基因大片段PCR产物T-Easy载体的酶切图谱、第三泳道为GAD65基因小片段PCR产物T-Easy载体的酶切图谱、第四泳道为全长人源谷氨酸脱羧酶GAD65基因氨基酸编码片段的酶切图谱(箭头所指为GAD65全长基因片段)。
附图3人源神经细胞营养因子GDNF基因cDNA片段(RT-PCR)产物：第一泳道为脱氧核苷酸(DNA，下同)分子量标准；第二和第三泳道为该基因的反向转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)产物。箭头所指为该GDNF基因cDNA片段在琼脂糖电泳上的位置。
附图4人源GDNF基因与人白细胞介素-2(IL-2)先导序列的融合：采用PCR方法，以GDNF基因为模板，应用编码人白细胞介素-2(IL-2)先导序列多肽和GDNF的5’-未端氨基酸的核苷酸引物进行PCR反应，完成人源神经营养因子GDNF与人白细胞介素-2(IL-2)先导序列多肽的融合。第一道为DNA分子量标准、第二和第三道为PCR产物(箭头所指)。
附图5融合GDNF基因在大肠杆菌内的表达：构建的融合GDNF基因原核细胞表达质粒转化大肠杆菌后，经诱导表达，用12％SDS-PAGE胶分析。第一道蛋白质分子量标准物；第二道非诱导的大肠杆菌蛋白产物；第三道诱导的大肠杆菌蛋白产物。箭头所指为表达的融合GDNF蛋白产物。
附图6表达GDNF蛋白产物的Western Blotting反应：第一道蛋白质分子量标准物；第二道非诱导的大肠杆菌蛋白产物；第三道诱导的大肠杆菌蛋白产物。箭头所指为GDNF蛋白质。
附图7共表达人源GAD65和GDNF基因表达盒结构图：从左到右，分别是pCMV启动子、β-珠蛋白内含子、人GAD65、IRES、人GDNF和人生长激素多聚腺嘌呤组成。
附图8含共表达人源GAD65和人源GDNF基因表达盒的重组腺相关病毒基因组结构图：从左到右，分别为反转末端重复子(ITR)、共表达人源GAD65和GDNF基因的表达盒和反转末端重复子(ITR)。
附图9共表达人源GAD65和人源GDNF重组腺相关病毒的构建流程图：本发明构建的共表达人GAD和GDNF的重组腺相关病毒是采用AAV helper-free表达系统来构建的。第一步，首先是从人脑组织中克隆GAD65和GDNF基因，并作必要的修饰；第二步将GAD65和GDNF基因插入pIRES-neo载体，使GAD65经由IRES连接GDNF基因；第三步是用适当内切酶的GAD65/IRES/GDNF的DNA片段克隆到含ITR的pAAV-MSC的载体上，构建成含共表达GAD65和GDNF表达盒的pAAV-MSC载体质粒；第四步则是用共表达GAD65和GDNF表达盒的重组pAAV载体、pAAV-RC和pHelper质粒共转染AAV-293细胞以获得共表达人GAD65和GDNF的AAV病毒颗粒。
具体实施
为了便于叙述构建共表达人源GAD和人源GDNF表达结构的重组病毒的具体实施过程，本发明采用腺相关病毒(AAV，下同)表达系统，更具体的是采用helper-free AAV表达系统，构建共表达GAD和GDNF表达结构的AAV重组病毒。
构建共表达GAD和GDNF表达结构的AAV重组病毒具体实施过程如下：
一、人源谷氨酸脱羧酶GAD65基因的克隆：
1).考虑到GAD65基因较大，决定将此基因分为二个片段进行克隆，然后再利用适当内切酶位点，完成GAD65全长基因的拼接。
首先提取脑组织总核糖核酸(total RNA)，并利用Poly(T)引物在反转录酶作用下合成脑组织cDNA；然后以人脑组织cDNA作为模板，应用人工合成的特异性引物，以脑组织cDNA为模板进行PCR反应，分别产生两个大小不同的PCR片段。
引物设计如下：
a：产生GAD65的N-末端至C-末端内切酶Stu1位点片段的引物，
5’-ccggatccgatggcatctccgggctctggcttttgg-3’
5’-tgtaaggccttgtctccagtgtcatag-3’
b.产生GAD65的内切酶Stu1位点至C-末端氨基酸合成终止子片段的引物
5’-gacaaggccttacagtgcggacgc-3’
5’-gagcggccgctctagattataaatcttgtccaaggcgttctatt-3’
PCR扩增产物分别经tailing反应，加上腺嘌呤(T)后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定；
2).经DNA测序正确后，应用内切酶Stu1和Sca1分别消化含上述PCR片段的T-easy质粒；用电泳分离、纯化含上述PCR的片段，应用连结酶反应，将此二个PCR的片段拼接；然后，转化感受态细菌，进行扩增，完成全长人源GAD65基因的克隆；
二、人GDNF基因克隆及其N未端与人白细胞介素-2先导序列的融合：
合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)的步骤同上；然后以人脑组织cDNA作为模板，应用人工合成的2个正向引物，即1.含有部份编码人白细胞介素-2先导氨基酸的核苷酸引物、2.含有部份编码人白细胞介素-2先导氨基酸的核苷酸序列和人GDNF基因N-末端氨基酸的核苷酸序列的引物、和1个反向引物，即人源GDNF基因C-末端核苷酸序列进行PCR扩增，采用二步PCR法克隆人源GDNF基因，并完成其N未端与人白细胞介素-2先导序列融合的改建。
正向引物设计如下：
1、5’-tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3’
2、5’-cctggtggaccgaatggtctcagccgaaaaaaaaacgtaaagtgtcaccagataaacaaatgg-3’
反向引物设计如下：
5’-tcaagcttcagatacatccacaccttt-3’
PCR扩增产物经tailing反应，加上腺嘌呤(T)后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。
三、含共表达GAD65和GDNF表达盒的pAAV-MCS载体的构建：
1)、应用AAV helper-free表达系统中pAAV-MCS载体的多克隆位点，将GAD65基因以内切酶BamH1和Xbal1核苷酸片段、经纯化、并与BamH1和Xbal1酶切消化、纯化的pAAV-MCS载体进行连接反应后，转化感受态细菌，进行扩增，并涂布在含适当抗生素的培养皿上，37℃培养箱过夜生长；
2)、筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中，37℃震荡培养过夜，于第二天抽取、纯化pAAV-MCS质粒DNA，并用BamH1和Xbal1酶切消化，以确定含有BamH1和Xbal1的GAD65基因片段的pAAV-MCS载体的质粒DNA和克隆菌株；
3)、确定含有GAD65基因片段的pAAV-MCS之后，以内切酶Hind111和Bgl11完全消化含有GAD65基因的pAAV-MCS质粒DNA，1％琼脂糖分离、纯化备用；
4)、为获得IRES片段，用内切酶Hind111和Smal1完全消化pIRESneo3载体DNA(CloneTech.Lab.Inc)，1％琼脂糖分离、纯化IRES片段备用；
5)、用内切酶Smal1和Bgl11完全消化含有GDNF基因片段的T-easy载体DNA，1％琼脂糖分离、纯化GDNF基因片段备用；
6)、将上述内切酶Hind111和Smal1消化的IRES片段和内切酶Smal1和Bgl11消化的GDNF基因片段经连结酶反应，拼接到上述内切酶Hind111和Bgl11完全消化的含GAD65基因的pAAV-MCS载体质粒DNA上，转化感受态细菌，37℃培养扩增，并涂布在含适当抗生素的培养皿上，37℃培养箱过夜生长；
7)、筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中，37℃震荡培养过夜，于第二天抽取、纯化pAAV-MCS质粒DNA，并用上述内切酶消化pAAV-MCS质粒DNA，确定含GAD65基因、IRES片段和GDNF基因的pAAV-MCS质粒；
四、共表达人源GAD65和GDNF基因的腺相关病毒的制备：
腺相关病毒的制备按Stratagene公司提供的AAV Helper Free系统说明手册描述的方法进行。具体操作过程如下：
1)、在转染前48小时，在加入10ml DMEM生长培养液的100毫米培养皿中接种约3百万个AAV-293细胞，2天后细胞密度应为70~80％；
2)、解冻含上述表达盒的pAAV-MCS、pAAV-RCH和pHelper质粒DNA，用pH7.5的TE缓冲液调整每种质粒DNA为1mg/ml；
3)、在15毫升培养管中从上述3种质粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫升0.4M CaCl₂，轻轻混匀；
4)、在另一支15毫升培养管中加入1毫升2x HBS溶液，再将上达3)中的1.03毫升的DNA/CaCl₂滴入1毫升2x HBS溶液中，倒转培养管多次混匀；
5)、立即将DNA/CaCl₂/HBS混悬液滴入AAV-293细胞培养皿中，并使其均匀分布在培养液中；
6)、将AAV-293细胞培养皿放入37℃培养箱中6小时，随后去除AAV-293细胞培养皿中的培养液，加入10毫升新鲜DMEM生长培养液，在37℃培养箱中培养72小时；
7)、3天后观察，如观察到培养液颜色变化、或看到有细胞形态变园，脱离板面或漂浮在培养液中，则表明有重组AAV病毒颗粒产生；
8)、此时收集细胞培养液、并收集细胞，通过4次冻/融法，裂解细胞，使其胞内重组AAV病毒释放出来，最后在室温下以10,000Xg离心10分钟，将上清液转移至另一新管中，贮存于-80°冰箱保存。此即为表达人源GAD65和GDNF基因的重组腺相关病毒(AAV)母液，下一步可进行病毒扩增、病毒滴定度检测及GAD65和GDNF基因表达产物的检测。
序列表
Individual Applicant
--------------------
Street：科学城国际企业孵化器A区610房
City：广州市
State：广东省
Country：中国
PostalCode：510633
PhoneNumber：020-32290208
FaxNumber：020-38491559
EmailAddress：shangwu_w@yahoo.com
<110>LastName：王
<110>FirstName：尚武
<110>MiddleInitial：
<110>Suffix：
Application Project
-------------------
<120>Title：一种共表达人源谷氨酸脱羧酶和细胞因子的重组病毒
<130>AppFileReference：
<140>CurrentAppNumber：1
<141>CurrentFilingDate：2008-05-19
Sequence
--------
<210>1
<211>1792
<212>DNA
<213>人源GAD65人工序列
<400>1
gctgaattcc cggatccgat ggcatctccg ggctctggct tttggtcttt cgggtcggaa   60
gatggctctg gggattccga gaatcccggc acagcgcgag cctggtgcca agtggctcag  120
aagttcacgg gcggcatcgg aaacaaactg tgcgccctgc tctacggaga cgccgagaag  180
ccggcggaga gcggcgggag ccaacccccg cgggccgccg cccggaaggc cgcctgcgcc  240
tgcgaccaga agccctgcag ctgctccaaa gtggatgtca actacgcgtt tctccatgca  300
acagacctgc tgccggcgtg tgatggagaa aggcccactt tggcgtttct gcaagatgtt  360
atgaacattt tacttcagta tgtggtgaaa agtttcgata gatcaaccaa agtgattgat  420
ttccattatc ctaatgagct tctccaagaa tataattggg aattggcaga ccaaccacaa  480
aatttggagg aaattttgat gcattgccaa acaactctaa aatatgcaat taaaacaggg  540
catcctagat acttcaatca actttctact ggtttggata tggttggatt agcagcagac  600
tggctgacat caacagcaaa tactaacatg ttcacctatg aaattgctcc agtatttgtg  660
cttttggaat atgtcacact aaagaaaatg agagaaatca ttggctggcc agggggctct  720
ggcgatggga tattttctcc cggtggcgcc atatctaaca tgtatgccat gatgatcgca  780
cgctttaaga tgttcccaga agtcaaggag aaaggaatgg ctgctcttcc caggctcatt   840
gccttcacgt ctgaacatag tcatttttct ctcaagaagg gagctgcagc cttagggatt   900
ggaacagaca gcgtgattct gattaaatgt gatgagagag ggaaaatgat tccatctgat   960
cttgaaagaa ggattcttga agccaaacag aaagggtttg ttcctttcct cgtgagtgcc  1020
acagctggaa ccaccgtgta cggagcattt gaccccctct tagctgtcgc tgacatttgc  1080
aaaaagtata agatctggat gcatgtggat gcagcttggg gtgggggatt actgatgtcc  1140
cgaaaacaca agtggaaact gagtggcgtg gagagggcca actctgtgac gtggaatcca  1200
cacaagatga tgggagtccc tttgcagtgc tctgctctcc tggttagaga agagggattg  1260
atgcagaatt gcaaccaaat gcatgcctcc tacctctttc agcaagataa acattatgac  1320
ctgtcctatg acactggaga caaggcctta cagtgcggac gccacgttga tgtttttaaa  1380
ctatggctga tgtggagggc aaaggggact accgggtttg aagcgcatgt tgataaatgt  1440
ttggagttgg cagagtattt atacaacatc ataaaaaacc gagaaggata tgagatggtg  1500
tttgatggga agcctcagca cacaaatgtc tgcttctggt acattcctcc aagcttgcgt  1560
actctggaag acaatgaaga gagaatgagt cgcctctcga aggtggctcc agtgattaaa  1620
gccagaatga tggagtatgg aaccacaatg gtcagctacc aacccttggg agacaaggtc  1680
aatttcttcc gcatggtcat ctcaaaccca gcggcaactc accaagacat tgacttcctg  1740
attgaagaaa tagaacgcct tggacaagat ttataatcta gagcggccgc tc          1792
<210>2
<211>585
<212>PRT
<213>人源GAD65氨基酸序列
<400>2
MetAlaSerProGlySerGlyPheTrpSerPheGlySerGluAspGlySerGlyAspSer
            5              10             15             20
GluAsnProGlyThrAlaArgAlaTrpCysGlnValAlaGlnLysPheThrGlyGlyIle
            25             30             35             40
GlyAsnLysLeuCysAlaLeuLeuTyrGlyAspAlaGluLysProAlaGluSerGlyGly
            45             50             55             60
SerGlnProProArgAlaAlaAlaArgLysAlaAlaCysAlaCysAspGlnLysProCys
            65             70             75             80
SerCysSerLysValAspValAsnTyrAlaPheLeuHisAlaThrAspLeuLeuProAla
            85             90             95             100
CysAspGlyGluArgProThrLcuAlaPhcLcuGlnAspValMctAsnIlcLcuLcuGln
            105            110            115            120
TyrValValLysSerPheAspArgSerThrLysValIleAspPheHisTyrProAsnGlu
            125            130            135            140
LeuLeuGlnGluTyrAsnTrpGluLeuAlaAspGlnProGlnAsnLeuGluGluIleLeu
            145            150            155            160
MetHisCysGlnThrThrLeuLysTyrAlaIleLysThrGlyHisProArgTyrPheAsn
            165            170            175            180
GlnLeuSerThrGlyLeuAspMetValGl yLeuAlaAlaAspTrpLeuThrSerThrAla
            185            190            195            200
AsnThrAsnMetPheThrTyrGluIleAlaProValPheValLeuLeuGluTyrValThr
            205            210            215            220
LeuLysLysMetArgGluIleIleGlyTrpProGlyGlySerGlyAspGlyIlePheSer
            225            230            235            240
ProGlyGlyAlaIleSerAsnMetTyrAlaMetMetIleAlaArgPheLysMetPhePro
            245            250            255            260
GluValLysGluLysGlyMetAlaAlaLeuProArgLeuIleAlaPheThrSerGluHis
            265            270            275            280
SerHisPheSerLeuLysLysGlyAlaAlaAlaLeuGlyIleGlyThrAspSerValIle
            285            290            295            300
LeuIleLysCysAspGluArgGlyLysMetIleProSerAspLeuGluArgArgIleLeu
            305            310            315            320
GluAlaLysGlnLysGlyPheValProPheLeuValSerAlaThrAlaGlyThrThrVal
            325            330            335            340
TyrGlyAlaPheAspProLeuLeuAlaValAlaAspIleCysLysLysTyrLysIleTrp
            345            350            355            360
MetHisValAspAlaAlaTrpGlyGlyGlyLeuLeuMetSerArgLysHisLysTrpLys
            365            370            375            380
LeuSerGlyValGluArgAlaAsnSerValThrTrpAsnProHisLysMetMetGlyVal
            385            390            395            400
ProLeuGlnCysSerAlaLeuLeuValArgGluGluGlyLeuMetGlnAsnCysAsnGln
            405            410            415            420
MetHisAlaSerTyrLeuPheGlnGlnAspLysHisTyrAspLeuSerTyrAspThrGly
            425            430            435            440
AspLysAlaLeuGlnCysGlyArgHisValAspValPheLysLeuTrpLeuMetTrpArg
            445            450            455            460
AlaLysGlyThrThrGlyPheGluAlaHisValAspLysCysLeuGluLeuAlaGluTyr
            465            470            475            480
LeuTyrAsnIleIleLysAsnArgGluGlyTyrGluMetValPheAspGlyLysProGln
            485            490            495            500
HisThrAsnValCysPheTrpTyrIleProProSerLeuArgThrLeuGluAspAsnGlu
            505            510            515            520
GluArgMetSerArgLeuSerLysValAlaProValIleLysAlaArgMetMetGluTyr
            525            530            535            540
GlyThrThrMetValSerTyrGlnProLeuGlyAspLysValAsnPhePheArgMetVal
            545            550            555            560
IleSerAsnProAlaAlaThrHisGlnAspIleAspPheLeuIleGluGluIleGluArg
            565            570            575            580
LeuGlyGlnAspLeu
            585
<210>3
<211>494
<212>DNA
<213>GDNF人工序列
<400>3
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt   60
ggatcaccag ataaacaaat ggcagtgctt cctagaagag agcggaatcg gcaggctgca  120
gctgccaacc cagagaattc cagaggaaaa ggtcggagaa gccagagggg caaaaaccgg  180
ggttgtgtct taactgcaat acatttaaat gtcactgact tgggtctggg ctatgaaacc  240
aaggaggaac tgatttttag gtactgcagc ggctcttgcg atgcagctga gacaacgtac  300
gacaaaatat tgaaaaactt atccagaaat agaaggctgg tgagcgacaa agtagggcag  360
gcatgttgca gacccatcgc ctttgatgat gacctgtcgt ttttagatga taacctggtt  420
taccatattc taagaaagca ttccgctaaa aggtgtggat gtatctgaaa gcttgcatca  480
ctagtgaatt cgcg                                                    494
<210>4
<211>206
<212>PRT
<213>GDNF人工序列
<400>4
MetTyrArgMetGlnLeuLeuSerCysIleAlaLeuSerLeuAlaLeuValThrAsnSer
            5              10             15             20
GlySerProAspLysGlnMetAlaValLeuProArgArgGluArgAsnArgGlnAlaAla
            25             30             35             40
AlaAlaAsnProGluAsnSerArgGlyLysGlyArgArgSerGlnArgGlyLysAsnArg
            45             50             55             60
GlyCysValLeuThrAlaIleHisLeuAsnAlaThrAspLeuGlyLeuGlyTyrGluThr
            65             70             75             80
LysGluGluLcuIlcPhcArgTyrCysScrGlyScrCysAspAlaAlaGluThrThrTyr
            85             90             95             100
AspLysIleLeuLysAsnLeuSerArgAsnArgArgLeuValSerAspLysValGlyGln
            105            110            115            120
AlaCysCysArgProIleAlaPheAspAspAspLeuSerPheLeuAspAspAsnLeuVal
            125            130            135            140
TyrHisIleLeuArgLysHisSerAlaLysArgCysGlyCysIle
            1451            50            155