一种结核多价表位的基因疫苗及其用途.pdf

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因工程疫苗领域。本发明公开了一种结核多价表位的基因疫苗，其特征在于该基因疫苗包含能有效编码含有ESAT6抗原的Th细胞表位、MPT64抗原的CTL表位、38kD抗原Th表位和/或CTL表位的融合蛋白的核苷酸序列的表达载体。本发明针对结核病保护性免疫主要依赖于细胞免疫的特点，选用三个抗原的T细胞识别表位来构建多价表位基因疫苗。本发明选用的抗原表位均经实验证实为很有效T细胞表位，将这些表位连接在一起后，将大大提高疫苗的有效性，降低非免疫刺激序列对宿主产生的毒害，

1.  一种结核多价表位的基因疫苗，其特征在于该基因疫苗包含能有效编码含有ESAT6抗原的Th细胞表位、MPT64抗原的CTL表位、38kD抗原Th表位和/或CTL表位的融合蛋白的核苷酸序列的表达载体。

2.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述融合蛋白中所述ESAT6抗原的Th细胞表位、所述MPT64抗原的CTL表位、所述38kD抗原Th表位和所述38kD抗原CTL表位间可以任意顺序直接连接或通过连接肽连接。

3.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述所述ESAT6抗原的Th细胞表位氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

4.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述MPT64抗原的CTL表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

5.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述38kD抗原Th表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述。

6.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述38kD抗原CTL表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述。

7.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ IDNO.9所述。

8.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述表达载体可为噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒或禽痘病毒表达载体。

9.  如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于所述表达载体可为腺病毒表达载体。

10.  权利要求1-9任一项所述基因疫苗在制备预防结核药物中的应用。

一种结核多价表位的基因疫苗及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因工程疫苗领域。
背景技术
结核病是一种人畜共患的慢性消耗性传染病。随着爱滋病患者人数的增加、抗药性菌株的产生等，结核病的发病率有逐年增加的趋势。国外有关资料报导，目前世界上约有10～20亿人口感染有结核杆菌，每年大约有三百万人死于结核病，同时又有1000万新病例出现。我国目前有上亿人感染有结核分枝杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25.6万余人。如果不尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。牛结核是家畜的一种慢性传染病且能传染给人。人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因。如果奶牛患有结核病，不但影响泌乳量和乳汁的营养成份，而且可通过各种途径传染给人。而控制牛结核病传播最有效的方法是对于感染牛群的大规模屠宰，但是这对于大多数国家来讲，无疑将造成了一项难以承受的经济负担。另外一条有效的途径，就在于使用疫苗免疫，防患于未然。
传统的卡介苗(BCG)免疫保护效果较差，迫切需要寻找一种新的替代疫苗。DNA疫苗是90年代兴起的一种新的疫苗技术，具有可诱发体液和细胞免疫应答等优点，因此越来越受到研究者的重视。但随着越来越多的研究发现，DNA疫苗在较大个体动物中诱导的免疫应答较弱，因此保护效果也较差。追寻其原因，其中非常重要的一条是DNA疫苗免疫机体后，大部分被降解，极少被宿主细胞所吸收。另一方面，单一抗原诱导的免疫保护效果有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供了一种结核多价表位基因疫苗及其用途。
为此，本发明公开了一种结核多价表位的基因疫苗，其特征在于该基因疫苗包含能有效编码含有ESAT6抗原的Th细胞表位、MPT64抗原的CTL表位、38kD抗原Th表位和/或CTL表位的融合蛋白的核苷酸序列的表达载体。
本发明的发明思路为通过基因工程技术人为将结核抗原的多个T/B细胞的表位串联，插入到表达质粒，构成多表位核酸疫苗，接种后只诱导针对保护性表位的免疫应答，将大大提高疫苗的有效性，降低非免疫刺激序列对宿主产生的毒害，减少接种量。
在一实施方式中，所述融合蛋白中所述ESAT6抗原的Th细胞表位、MPT64抗原的CTL表位、38kD抗原Th表位和所述CTL表位间可以任意顺序直接连接或通过连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列包括但不限于，例如：(GGGGS)_N或(GGGS)_N或(GGS)_N或(AAY)_N，其中N是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸，S表示丝氨酸，A表示丙氨酸，Y表示酪氨酸。其中优选(AAY)_N。
在一实施方式中，所述所述ESAT6抗原的Th细胞表位优选氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述ESAT6抗原51-70位的Th细胞表位。
在一实施方式中，所述MPT64抗原的CTL表位优选的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所述MPT64抗原190-198位的CTL表位。
在一实施方式中，所述所述38kD抗原Th表位优选的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所述38kD抗原的71-81位的Th表位。
在一实施方式中，所述38kD抗原CTL表位优选的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所述38kD抗原的166-175位的CTL表位。
在一实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所述。
在一实施方式中，所述表达载体可为噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒或禽痘病毒，其中优选腺病毒。
另一方面，本发明还公开了上述结核多价表位的基因疫苗在制备预防结核药物中的应用。
本发明的创新点是针对结核病保护性免疫主要依赖于细胞免疫的特点，选用三个抗原的T细胞识别表位来构建多价表位基因疫苗。本发明选用的抗原表位均经实验证实为很有效T细胞表位，将这些表位连接在一起后，将大大提高疫苗的有效性，降低非免疫刺激序列对宿主产生的毒害，减少接种量。
附图说明
图1.结核表位DNA疫苗结构图；
图2.转染重组质粒的EL-4细胞的总RNA电泳；
图3.稳定转染结核抗原基因的EL-4细胞系的RT-PCR结果
图4.38kDa和MPT64抗原免疫组化；
图5.表位特异的CTL活性；
图6.分泌IFN-r细胞因子的细胞数目。
具体实施方式
本发明定义，“基因疫苗”和“核酸疫苗”为等同定义。
表位(epitope)：抗原分子中决定抗原特异性的基本结构或化学基团，是TCR/BCR及抗体特异性结合的基本单位，亦称为抗原决定基(antigenicdeterminant)。
本发明所述核苷酸序列优选有效整合入表达载体中，如BUDCE4.1表达载体。一旦整合入表达载体中，则可通过用该表达载体转染宿主细胞，将所述核苷酸序导入到宿主载体如减毒活细菌载体中，从而提供本发明的疫苗。
本发明所述核苷酸序列优选包括核苷酸序列达所必需的调控元件。此类元件包括例如启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。此外，免疫原性靶蛋白编码序列的表达通常还需要增强子。如本领域所知，这些调控元件优选有效与编码目的蛋白的序列相连接。选择的调控元件优选与其被施用的物种相容。起始密码子和终止密码子优选是编码本发明所述融合蛋白的核酸序列序列的一部分。当然，起始密码子和终止密码子必须符合融合蛋白的编码序列读框。
本发明疫苗所包含的启动子和多腺苷酸化信号优选在被免疫患者细胞中有功能。用于本发明疫苗的启动子，特别是用于生产人基因疫苗的启动子，其实例包括但不限于猿病毒40(SV40)启动子、小鼠乳癌病毒(MMT均启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV早期启动子、EB病毒(EBV)启动子、劳氏肉瘤病毒区(RSV)启动子以及来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和人金属硫蛋白的启动子。
用于本发明疫苗的多腺苷酸化信号，特别是在用于生产人基因疫苗的多腺苷酸化信号，其实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸信号。
除了核苷酸序列表达所需的调控元件外，在核苷酸序列分子中还可包括其它元件。这些其它元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸的增强子和病毒增强子，如CMV、RSV和EBV病毒增强子。
调控序列和密码子通常是与种属相关的。为了最大量地生产蛋白，选择在被免疫种属中有效的调控序列和密码子。本领域一般技术人员可轻易制备出在给定种属中有功能的核苷酸序列。
本发明所述核苷酸序列可以是如Restifo等，Gene Therapy 2000；7：89-92中所定义的“裸”DNA，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。所述核苷酸序列优选有效整合到载体中。可使用的传递载体包括生物可降解微胶囊或脂质体，以及经遗传改造的减毒活载体，如病毒或细菌。
适宜的减毒活细菌载体的实例包括鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌属、芽袍杆菌属、乳杆菌属、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌、弯曲杆菌属、李斯特氏菌属或本领域已知的任何其它合适的细菌载体。载体优选为减毒活鼠伤寒沙门氏杆菌载体。优选的减毒活鼠伤寒沙门氏杆菌包括ArpA^-菌株如SL7207，或者双减毒AroA^-、dam^-菌株，如RE88。特别优选的载体是双减毒AroA^-、dam^-鼠伤寒沙门氏杆菌.
用外源核苷酸序列转化活细菌载体的方法在本领域广为阐述。参阅例如Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(2001)。
优选的病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。
用外源核苷酸序列转化病毒载体的方法在本领域也是广为阐述。有用的脂质体载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性物质所形成的膜部分和内部的水相部分。本发明所使用的水相部分包含有要传递至靶细胞的多核苷酸物质。通常，优选脂质体形成物质具有一个阳离子基团如季胺基团，以及一个或多个亲脂性基团，如具有大约6-30个碳原子的饱和或不饱和烷基。公开号为No.0187702的欧洲专利描述了一组合适的物质，Wolff等的美国专利No.6,228,844进行了进一步的讨论，这两个文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。文献中还描述了许多其它合适的脂质体形成阳离子脂质化合物。参阅例如L.Stamatatos.等.，Biochemistry 1988；27：3917-3925；和H.Eibl等.，Biophysical Chemistry 1979；10：261-271。另一方面，也可使用微球体，如丙交醋-乙交醋共聚物生物可降解微球体。为将核酸传递到组织中，将核酸构建物用脂质体或微球体包装或复合，如本领域技术人员已知的。其它有用的载体包括含生物可降解聚(原酸醋)物质的多聚微球体，如Wang等，Nat.Mater 2004；3(3)：190-6所述，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。
本发明的方法方面包括将核酸疫苗施用于哺乳动物(如人)组织，其中，所述核酸疫苗有效编码多表位基因产物。在某些优选实施方案中，核酸疫苗经口服、肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部施用。核酸疫苗优选经口服施用。在一个优选方法中，本发明的核酸疫苗可在用疫苗治疗的患者中提供长期的结核免疫。
本发明核酸疫苗治疗的哺乳动物优选为人。本发明的核酸疫苗优选与药物可接受的载体或赋形剂如水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合一起配制。该疫苗也可以含有助剂，如保湿剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、佐剂等。本发明的疫苗优选以药物可接受载体中的溶液或悬浊液形式经口服给予哺乳动物，如人，其中核酸浓度为约1-10微克/毫升。疫苗的适用剂量因接种患者不同而不同，部分根据施用或要求施用疫苗的医师的判断而定。
本发明核酸疫苗可以多剂量或单位剂量形式包装在适宜的灭菌容器中，例如安瓶、瓶或小瓶中。容器优选在装入疫苗制备物后密封。
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
实施例1：制备以腺病毒为载体的结核多价表位疫苗
(1)由人工合成含有四种表位的核酸序列，如SEQ ID NO.5
(2)构建腺病毒穿梭载体：将合成的含有接头序列的表位序列基因经NotI酶切位点插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体pAdTrac-CM中，构建含有多表位基因的腺病毒穿梭载体；
(3)获得病毒颗粒：将获得含有多表位基因的复制缺陷的腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体毒主链质粒pAdEasy一1共同转化BJ5183感受态细胞，经卡那霉素琼脂板过夜筛选，挑菌落小提质粒，通过Pac I酶切进行鉴定。获得经同源重组的重组腺病毒质粒；
(4)将重组腺病毒质粒导入293细胞细胞中进行包装，获得包装的有感染力的病毒颗粒。构建示意图见图1。
实施例2：动物实验
方法：
(1)免疫动物 雌性C57BL/6小鼠(6～8周)，20只，随机分为2组，分别为疫苗组和空载体组，每只肌肉注射50μg实施例1所制备的病毒颗粒，共免疫3次，注射间隔为2周。在末次免疫后3周杀鼠，进行免疫指标的检测。
(2)免疫应答的检测 检测小鼠的脾细胞增殖实验，CTL活性。
1.CTL靶细胞的建立及筛选 结核病的保护性免疫主要依赖于细胞免疫，而利用有效的动物模型，抗原特异CTL反应水平的检测是评价结核DNA疫苗激发机体产生细胞免疫应答的重要指标之一。合适的靶细胞是检测CTL毒性的必要条件。参考文献(刘单，盛军，杨贵贞。中国免疫学杂志，2004，20(3)：167-170；王宏，金宁一，金洪涛等。中国生物制品学杂志，2004，17(3)：155-157)中的方法，本部分以遗传背景与Balb/c小鼠一致的EL4细胞(遗传背景为H-2^b)为靶细胞，将结核杆菌的抗原MPT64(M表位)、38kD抗原基因克隆到含有neo基因的真核表达载体pcDNA3.1中，转染细胞，经G418加压筛选，获得了稳定表达结核杆菌抗原的细胞株，并从其表达水平和基因组整合两方面进行了鉴定。对经G418筛选出来的阳性细胞克隆，先用RT-PCR的方法扩增相应的抗原基因片段。然后对PCR阳性的克隆用ELISA的方法检测细胞裂解物中的抗原表达含量；最后根据ELISA结果，把表达量最高的细胞株用免疫组化的方法进行鉴定，所选用的一抗为结核病人的血清(1∶20稀释)，二抗为山羊抗人-HRP的抗体(1∶25)。
2.CTL活性检测(LDH法)
预刺激 制备疫苗组和空载体组免疫的C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞悬液，吸取分离的脾淋巴细胞悬液10⁷/ml 1ml于6孔板中，加入以转染目的基因的靶细胞和未转染的P815细胞1m(10⁵/ml)以20∶1的比例混合，预刺激5d，其中还加入20U/ml的小鼠重组IL-2，10μg/ml的ConA.总体积为8ml。靶细胞和未转染的EL4细胞要经过浓度为50μg/ml的丝裂霉素C预处理1h，洗涤3次后才与脾细胞共孵育。共孵育2.5d后，换液，用20U/ml的小鼠重组IL-2再刺激2.5天。
效应细胞对靶细胞的杀伤活性的检测 将刺激后的脾细胞和靶细胞分别用检测培养基(Assay Medium，AM，含1％小牛血清的培养基)洗涤3次，均以AM重悬，然后将效应细胞和靶细胞按不同的比例将效靶细胞加入到96孔培养板中，效靶细胞各100μl，均设3复孔，同时设靶细胞最大释放量(100μl靶细胞+100μl AM，2％TritonX-100)、最小释放量(100μl靶细胞+100μ1AM)、自然背底(200μl AM)、效应细胞释放量。250g离心5min，于37℃，5％CO₂的饱和水气的CO₂的培养箱培养4h，250g离心5min，，吸取100μl上清至另一96孔板中，加入检测LDH含量的反应液，18～25℃避光30min，测492nm波长的A值，按下面的公式计算CTL对靶细胞的杀伤活性：

3.脾细胞分泌的IFN-γ水平(ELISPOT检测)
向ELISPOT板每孔中加入50μl包被抗体和50μlPBS，封好板于4C包被过夜，倾掉包被液，用PBST洗10次；向孔中加入封阻液(包含1％BSA的PBS)200μl，4℃封阻过夜。倾倒液体(不洗孔)，向孔中加入分离的免疫小鼠的脾细胞(用10μg/ml的特异的抗原刺激40h)，盖上板盖，于37℃5％CO₂的细胞培养箱中孵育5h；用力倾倒孔中的液体，加入200μl冰冷的去离子水，冰上放置10min，用PBST洗板10次；加入100μl生物素化的检测抗体，37℃放置1h或4℃过夜；然后倾倒板中的液体，PBST洗10次；加入50μlφ标记的抗生物素的抗体(GABA)，37℃孵育1h，去除孔中的液体，用PBST洗10次，最后把孔中的液体在草纸上拍干；最后向孔中加入30μl Activator溶液，室温放在暗处孵育15～30min，在光镜下观察点的形成情况，一旦点形成后，及时用无菌去离子水终止反应。
实验结果：
(1)靶细胞的获得 在CTL细胞活性检测中，首先制备靶细胞。由于所选用的表位是H-2b限制性的，所以在建立靶细胞时，所选择的是来源于Balb/c小鼠的EL-4细胞株。转染用的重组质粒是pcDNA3-38kDa和pcDNA3.1A-MPT64。对G418筛选出来的阳性克隆相继用RT-PCR，ELISA和免疫组化的方法从表达水平和基因组整合两方面进行抗原表达情况的鉴定。可见抽提的RNA18S和28S大小完整(图2Lane1，2，3：转染MPT64抗原基因的EL4细胞；Lane4，5，6：转染38kDa抗原基因的EL4细胞)，PCR扩增出了特异的约0.7，1.2kb的片段，分别与MPT64和38kDa抗原的cDNA大小相符(图3，左：MPT64，右：38kDa)。免疫组化(一抗为结核病人的血清，1∶20稀释)的结果见图4(左边为阴性对照，右上为MPT64抗原组化结果，右上为38kDa抗原组化结果，箭头为阳性信号)，可见阳性克隆的胞浆中有棕黄色着色，说明目的抗原38kDa和MPT64确实获得了表达，细胞核被苏木精衬染成紫蓝色。而没有转染的EL-4细胞没有目的抗原38kDa和MPT64阳性信号，说明检测的信号是特异的。
(2)CTL活性的检测
将疫苗组和空载体组免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞分别与表达MPT64和38kDa抗原的靶细胞分别以100∶1，50∶1的比例孵育8h，用LDH试剂盒测CTL的杀伤活性。结果如图5，在小鼠中构建的表位疫苗可以诱导M表位或38kD抗原表位特异的CTL应答。
(3)分泌IFN-r细胞因子的数目检测该指标也可以间接地反映了CTL的细胞活性。实验中用浓度为10μg/ml的表位分别刺激10⁶的脾细胞，共刺激40h，然后用ELISPOT的方法计数细胞数，结果如图6所示，构建的表位疫苗可以诱导脾细胞分泌M表位特异/38kD抗原表位特异的IFN-r，这对机体抵抗结核菌是很有利的。
近年来，越来越多的肿瘤、病毒及胞内感染的病原体抗原CTL表位的发现促使人们进行多表位DNA疫苗的设计和研究。本实验选用腺病毒怍载作构建重组体.腺病毒载体具有感染效率高和瞬时表达不与基因组整合等优点，利用此载体，可以提高表位疫苗在宿主细胞内的表达量，从而提高诱导的免疫应答。
在本研究中，我们选用了MPT64抗原的CTL表位和38kD抗原的CTL表位构建表位疫苗，同时加入ESAT6和38kD抗原的Th表位来为CTL细胞的活化提供辅助作用。CTL表位在呈递的过程中，表位与MHC I类分子的亲和力起着重要的作用，其他环节如表位的蛋白降解、运输、与MHC I分子竞争结合等也起着重要的作用。在本研究中，在表位之间加入AAY接头序列来提高表位的呈递。本研究结果表明我们构建的以腺病毒为载体的表位疫苗可以在小鼠体内诱导表位特异的CTL免疫应答，可以诱导脾细胞分泌特异的IFN-r。
机体对结核的保护性免疫主要依赖于细胞免疫如CTL免疫应答及一些细胞因子，所以本疫苗对机体抵抗结核病是有利的。本发明为寻找一种新型的结核疫苗提供了新思路。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表
<110>中国人民解放军海军医学研究所
<120>一种结核多价表位的基因疫苗及其用途
<130>说明书序列表
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>1
Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn
1               5                   10                  15
Asn Ala Leu Gln
            20
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>2
Phe Ala Val Thr Asn Asp G1y Val Ile
1               5
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>3
Ala Phe His Glu Arg Tyr Pro Asn Val Thr Ile
1               5                   10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>4
Ile Ala Ala Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu
1               5                   10
<210>5
<211>195
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>artificial sequence
<400>5
gccgccacca tgtaccaggg tgtccagcaa aaatgggacg ccacggctac cgagctgaac     60
aacgcgctgc aggctgcata tttcgcagtc acgaacgacg gggtgattgc tgcatatgcc    120
tttcacgaga ggtatccgaa cgtcacgatc gctgcatata tcgctgcgct caaccccggc    180
gtgaacctgt aatag                                                     195