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摘要
申请专利号：	CN200910192185.X	申请日：	2009.09.09
公开号：	CN102021194A	公开日：	2011.04.20
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/70申请公布日:20110420\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/70申请日:20090909\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/70; C12N15/74; A62D3/02(2007.01)I; A61K35/74; A61P3/06; A23K1/16; A62D101/04(2007.01)N; C12R1/01(2006.01)N; C12R1/19(2006.01)N	主分类号：	C12N15/70
申请人：	任政华; 熊光明
发明人：	熊光明; 任政华
地址：	510275 广东省广州市广州市新港西路135号中山大学生命科学学院贺丹青堂602室
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内容摘要

本发明涉及一种提高细菌基因表达的活化因子。该激活因子主要用于提高细菌基因组中目的产物的提高。该活化因子基因分离于Comamonas testosteroni一种革兰氏阴性细菌的染色质DNA。该基因含有564bp。首先将280bp的tac启动子DNA片段克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，在tac启动子下游再插入564bp的活化因子基因蛋白，从而构建成为质粒pKtac-act5。pKtac-act5含有卡那霉素抗性基因，并可在多数革兰氏阴性菌中复制。利用该质粒pKtac-act5可提高细菌基因表达。使工程菌的目的产物的表达水平(5-50倍)。采用了本质粒pKtac-act5可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力，生物工程制药。也可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。

权利要求书

1：本发明是通过基因筛选和重组得到一种质粒 pKtac-act5，其主要特征在于提高细菌基因表达。构建的质粒 pKtac-act5，将 280bp 的 tac 启动子 DNA 片段和一个 564bp 的活化子基因片段克隆到质粒 pK18 中获得本活性质粒。本质粒含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革兰氏阴性菌中复制。在不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质 DNA 中使细菌具有卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。
2：本质粒 pKtac-act5 基因全序列为： CGC GCA GTG CAC TTC CAC AGC ATC GAA GTT GGC CTG CTT GGCGCG CAG GGC GGC CGC AGC AAA CCA TTC CAC CAT CTG TGC AAT ATCGGC CTT GTC CAT CAC GCG GTA GCG GTC GGG GTA GGG GCC AAT CCCCAC AAA GGT CGA GAA TTC CTT GGG CGT GAC GGT GCG CAT GGC TTCGGC CAC AGG ACC GTC GGG CGG AAT CGA GGA CAC CCA CAT CTC GCGCCC GTG GGT GCG GTC ATT GGC AGC GAC CTT GCC GCT GTG ATT GATCTG GAT GGC GAC TTT GCC GCC GTG CGA GTG AAC GCG GCG CGT GACTTC GGC CAG ACC GGG GAT GAA GCT GTC GTT GGA GAT GCC CAG TTGGTG CGG CTC GCT GGT GCC GGT GGG CCA GGA GAT GGC GGC CGT GCCCAT GAT GAT GAG GCC GGT GCC GCC CTT GGC ACG CTC TTC GTA ATAGTC CTG GGC GCG TTC GCC GCA GAT ACC GTC GGT GCC GCC GTA GTTCTC GCC CAT GGG GGC CAT GAT GAT GCG GTT CTT CAG CTC CAT GGTGCC GAT ACG GCC CGG CTG CAG CAT TGA 对上述全基因序列 (564bp+TGA) 具有知识产权保护。
3：对上述全基因序列的删除、增添或突变具有保护。
4：使用本质粒 pKtac-act5 可有效的提高制药工业中工程菌的目的产物的表达水平 (5-50 倍 )。有效的提高微生物分解化学有害物质的能力，可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。

说明书

提高细菌基因表达的活化因子
    技术领域：
     本发明提供了一种提高细菌基因表达产物的新方法，可用于发酵工业，制备微生物工程及基因工程的产品。本发明可以用应用于提高其它微生物基因表达等领域如环境保护、石油裂解及开采，生物制药及生物添加剂。背景技术：
     在 Comamonas testosteroni 染色质 DNA 中克隆出的一段 DNA 片段 (564bp) 编码了一种细菌活化因子蛋白，据资料报道；细菌中存在一种能与 RNA 聚合酶结合的活化因子蛋白，该活化因子蛋白还能与细菌基因启动子特异性地松散结合。本研究证明了 Comamonas testosteroni 中的活化因子蛋白能够提高大肠杆菌和 Comamonastestosteroni 某些基因的表达，从而为该活化因子蛋白的应用提供了一个可行的途径。发明内容：
     为了提高细菌基因产物的表达，本发明提供如下质粒：
     首先将 280bp 的 tac 启动子 DNA 片段 (Rai) 克隆到质粒 pK18 的 BamHI 酶切位点中，在 tac 启动子下游再插入 564bp 的活化因子蛋白基因，从而构建成为质粒 pKtac-act5。如附图 2 所示，pKtac-act5 含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革兰氏阴性菌中复制。再不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质 DNA 中使细菌具有卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。在可复制的细菌中需要在培养基中加入卡那霉素维持质粒的存在，被整合的菌株则可在无抗生素的培养基中长期稳定的保持 pKtac-act5 的遗传特性。
     上述质粒 pKtac-act5 提高细菌基因表达的主要特征在于：
     (1) 在制药工业中某些工程菌可以产生具有生物活性的药物，但是由于表达量过低，难以进行工业化生产。使用本质粒 pKtac-act5 可有效的提高工程菌的目的产物的表达水平 (5-50 倍 )，从而解决了分离提取的问题，并能达到药品所规定的纯度标准。
     (2) 在自然环境中，有许多的化学农药污染，利用普通的微生物很难达到分解化学农药的目的，使用本质粒可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力。当本质粒整合到细菌染色质 DNA 中之后，可相当稳定的在卡那霉素的环境中保持 50 天以上。
     采用了质粒 pKtac-act5 可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。
     (3) 应用本质粒重组的 Comamonas testosteroni 工程菌具有独特的分解类固醇类化合物和脂肪功能，可以制备降低胆固醇类药物及饲料添加剂 . 具体实施方案：
     实施例 1 ：
     用氯化钙方法直接将质粒 pKtac-act5 转化到 pK18 可复制的细菌中，在培养基中加入 20-30ug/ml 卡那霉素，即可维持激活子蛋白的表达，从而提高基因表达产物的水平。
     实施例 2 ：
     用点穿孔方法将质粒 pKtac-act5 转化到 pK18 不可复制的细菌中，在培养基中加入 20-30ug/ml 卡那霉素，即可在平皿中筛选出被质粒 pKtac-act5 整合 ( 细菌染色质 DNA) 的克隆。用 PCR 方法证明整合的正确性之后，该工程菌既可被使用。附图说明：
     本发明的提高细菌基因表达活化因子的基因序列、限制性内酶切位点及生物学活性结果见附图 1-6。
     图 1 ：3a 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3a-HSD) 的活化因子 ( 激活子 ) 基因及氨基酸序列。基因序列显示 4 个 GTG 起始密码。在第 3，4GTG 附近制备的移码突变 pKPsS1 失去激活子活性，所以只有第 1，2GTG 是可能起始密码。氨基酸序列显示胰酶类似酶可能的水解位点。
     图 2 ：质粒 pKtac-act5(act5) 的物理图谱。图 3 ：活化因子基因重组 3a 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3a-HSD) 后，酶联免疫吸附实验检测活性表达结果。酶联免疫吸附实验结果证明将活化因子基因加到 3α- 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3α-HSD) 基因的不同方向 (P1， P23， P24) 都能提高 3α- 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3α-HSD) 的表达 ( 对照为 P6，无活化因子基因 )。
     图 4 ：酶联免疫吸附实验结果表明在 E.Coli 中当活化因子的表达量增高时 3a 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3a-HSD) 表达也增高。
     图 5 ：酶联免疫吸附实验结果表明在 C.testosteroni 菌中转入 PBBtac-act6，3a 羟基睾丸酮氧化 / 脱氢酶 (3a-HSD) 的表达都提高，对照为空质粒 PBBR1MCS-2 和无质粒野生菌。
     图 6 ：活化因子作用机理。
     1. 活化因子能够识别靶基因启动子附近的特异对影 DNA 序列并结合成二或四聚体。
     2. 该活化因子能与 DNA 依赖的 RNA 聚合酶结合，使靶基因启动子处的 RNA 聚合酶浓度大大增加，从而在转录水平上提高 mRNA 产量，使目的基因表达增加。
     序列表
     <110> 熊光明任政华
     <120> 提高细菌基因表达的活化因子。
     <160>2
     <210>1
     <211>567
     <212>DNA
     <213> 假单胞旋毛菌 (Comamonas testosteroni)
     <400>1
     1 gtg cgc gca gtg cac ttc cac agc atc gaa gtt ggc ctg ctt ggc gcg cag ggc ggc cgc
     60 agc aaa cca ttc cac cat ctg tgc aat atc ggc ctt gtc cat cac gcg gta gcg gtc ggg
     120 gta ggg gcc aat ccc cac aaa ggt cga gaa ttc ctt ggg cgt gac ggt gcg cat ggc ttc 180 ggc cac agg acc gtc ggg cgg aat cga gga cac cca cat ctc gcg ccc gtg ggt gcg gtc 240 att ggc agc gac ctt gcc gct gtg att gat ctg gat ggc gac ttt gcc gcc gtg cga gtg 300 aac gcg gcg cgt gac ttc ggc cag acc ggg gat gaa gct gtc gtt gga gat gcc cag ttg 360 gtg cgg ctc gct ggt gcc ggt ggg cca gga gat ggc ggc cgt gcc cat gat gat gag gcc 420 ggt gcc gcc ctt ggc acg ctc ttc gta ata gtc ctg ggc gcg ttc gcc gca gat acc gtc 480 ggt gcc gcc gta gtt ctc gcc cat ggg ggc cat gat gat gcg gtt ctt cag ctc cat ggt 540 gcc gat acg gcc cgg ctg cag cat tga 567 <210>2 <211>150 <212>PRT <213> 假单胞旋毛菌 (Comamonas testosteroni) <400>2 Val Arg Ala Val His Phe His Ser Ile Glu Val Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ala Gln Gly Gly Arg Ser Lys Pro Phe His His Leu Cys Asn Ile 20 25 30 Gly Leu Val His His Ala Val Ala Val Gly Val Gly Ala Asn Pro 35 40 45 His Lys Gly Arg Glu Phe Leu Gly Arg Asp Gly Ala His Gly Phe 50 55 60 Gly His Arg Thr Val Gly Arg Asn Arg Gly His Pro His Leu Ala 65 70 75 Pro Val Gly Ala Val Ile Gly Ser Asp Leu Ala Ala Val Ile Asp 80 85 90 Leu Asp Gly Asp Phe Ala Ala Val Arg Val Asn Ala Ala Arg Asp 95 100 105 Phe Gly Gln Thr Gly Asp Glu Ala Val Val Gly Asp Ala Gln Leu 110 115 120 Val Arg Leu Ala Gly Ala Gly Gly Pro Gly Asp Gly Gly Arg Ala 125 130 135 His Asp Asp Glu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Thr Leu Phe Val Ile 140 145 150

资源描述

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1、10申请公布号CN102021194A43申请公布日20110420CN102021194ACN102021194A21申请号200910192185X22申请日20090909C12N15/70200601C12N15/74200601A62D3/02200701A61K35/74200601A61P3/06200601A23K1/16200601A62D101/04200701C12R1/01200601C12R1/1920060171申请人任政华地址510275广东省广州市广州市新港西路135号中山大学生命科学学院贺丹青堂602室申请人熊光明72发明人熊光明任政华54发明名称提高细菌基因。

2、表达的活化因子57摘要本发明涉及一种提高细菌基因表达的活化因子。该激活因子主要用于提高细菌基因组中目的产物的提高。该活化因子基因分离于COMAMONASTESTOSTERONI一种革兰氏阴性细菌的染色质DNA。该基因含有564BP。首先将280BP的TAC启动子DNA片段克隆到质粒PK18的BAMHI酶切位点中，在TAC启动子下游再插入564BP的活化因子基因蛋白，从而构建成为质粒PKTACACT5。PKTACACT5含有卡那霉素抗性基因，并可在多数革兰氏阴性菌中复制。利用该质粒PKTACACT5可提高细菌基因表达。使工程菌的目的产物的表达水平550倍。采用了本质粒PKTACACT5可有效的提。

3、高微生物分解化学有害物质的能力，生物工程制药。也可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图6页CN102021208A1/1页2本发明是通过基因筛选和重组得到一种质粒PKTACACT5，其主要特征在于提高细菌基因表达。构建的质粒PKTACACT5，将280BP的TAC启动子DNA片段和一个564BP的活化子基因片段克隆到质粒PK18中获得本活性质粒。本质粒含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革兰氏阴性菌中复制。在不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质DNA中使细菌具有卡那霉素抗性标志。

4、，从而达到筛选工程菌株的目的。1本质粒PKTACACT5基因全序列为CGCGCAGTGCACTTCCACAGCATCGAAGTTGGCCTGCTTGGCGCGCAGGGCGGCCGCAGCAAACCATTCCACCATCTGTGCAATATCGGCCTTGTCCATCACGCGGTAGCGGTCGGGGTAGGGGCCAATCCCCACAAAGGTCGAGAATTCCTTGGGCGTGACGGTGCGCATGGCTTCGGCCACAGGACCGTCGGGCGGAATCGAGGACACCCACATCTCGCGCCCGTGGGTGCGGTCATTGGCAGCGACCTTGCCGCTGTGATTGA。

5、TCTGGATGGCGACTTTGCCGCCGTGCGAGTGAACGCGGCGCGTGACTTCGGCCAGACCGGGGATGAAGCTGTCGTTGGAGATGCCCAGTTGGTGCGGCTCGCTGGTGCCGGTGGGCCAGGAGATGGCGGCCGTGCCCATGATGATGAGGCCGGTGCCGCCCTTGGCACGCTCTTCGTAATAGTCCTGGGCGCGTTCGCCGCAGATACCGTCGGTGCCGCCGTAGTTCTCGCCCATGGGGGCCATGATGATGCGGTTCTTCAGCTCCATGGTGCCGATACGGCCCGGCTGCAGCATTGA对上。

6、述全基因序列564BPTGA具有知识产权保护。2对上述全基因序列的删除、增添或突变具有保护。3使用本质粒PKTACACT5可有效的提高制药工业中工程菌的目的产物的表达水平550倍。有效的提高微生物分解化学有害物质的能力，可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。权利要求书CN102021194ACN102021208A1/3页3提高细菌基因表达的活化因子技术领域0001本发明提供了一种提高细菌基因表达产物的新方法，可用于发酵工业，制备微生物工程及基因工程的产品。本发明可以用应用于提高其它微生物基因表达等领域如环境保护、石油裂解及开采，生物制药及生物添加剂。背景技术0002在CO。

7、MAMONASTESTOSTERONI染色质DNA中克隆出的一段DNA片段564BP编码了一种细菌活化因子蛋白，据资料报道；细菌中存在一种能与RNA聚合酶结合的活化因子蛋白，该活化因子蛋白还能与细菌基因启动子特异性地松散结合。本研究证明了COMAMONASTESTOSTERONI中的活化因子蛋白能够提高大肠杆菌和COMAMONASTESTOSTERONI某些基因的表达，从而为该活化因子蛋白的应用提供了一个可行的途径。发明内容0003为了提高细菌基因产物的表达，本发明提供如下质粒0004首先将280BP的TAC启动子DNA片段RAI克隆到质粒PK18的BAMHI酶切位点中，在TAC启动子下游再插。

8、入564BP的活化因子蛋白基因，从而构建成为质粒PKTACACT5。如附图2所示，PKTACACT5含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革兰氏阴性菌中复制。再不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质DNA中使细菌具有卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。在可复制的细菌中需要在培养基中加入卡那霉素维持质粒的存在，被整合的菌株则可在无抗生素的培养基中长期稳定的保持PKTACACT5的遗传特性。0005上述质粒PKTACACT5提高细菌基因表达的主要特征在于00061在制药工业中某些工程菌可以产生具有生物活性的药物，但是由于表达量过低，难以进行工业化生产。使用本质粒PKTACACT5可有。

9、效的提高工程菌的目的产物的表达水平550倍，从而解决了分离提取的问题，并能达到药品所规定的纯度标准。00072在自然环境中，有许多的化学农药污染，利用普通的微生物很难达到分解化学农药的目的，使用本质粒可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力。当本质粒整合到细菌染色质DNA中之后，可相当稳定的在卡那霉素的环境中保持50天以上。0008采用了质粒PKTACACT5可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。00093应用本质粒重组的COMAMONASTESTOSTERONI工程菌具有独特的分解类固醇类化合物和脂肪功能，可以制备降低胆固醇类药物及饲料添加剂具体实施方案0010实施例10。

10、011用氯化钙方法直接将质粒PKTACACT5转化到PK18可复制的细菌中，在培养基说明书CN102021194ACN102021208A2/3页4中加入2030UG/ML卡那霉素，即可维持激活子蛋白的表达，从而提高基因表达产物的水平。0012实施例20013用点穿孔方法将质粒PKTACACT5转化到PK18不可复制的细菌中，在培养基中加入2030UG/ML卡那霉素，即可在平皿中筛选出被质粒PKTACACT5整合细菌染色质DNA的克隆。用PCR方法证明整合的正确性之后，该工程菌既可被使用。附图说明0014本发明的提高细菌基因表达活化因子的基因序列、限制性内酶切位点及生物学活性结果见附图16。0。

11、015图13A羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3AHSD的活化因子激活子基因及氨基酸序列。基因序列显示4个GTG起始密码。在第3，4GTG附近制备的移码突变PKPSS1失去激活子活性，所以只有第1，2GTG是可能起始密码。氨基酸序列显示胰酶类似酶可能的水解位点。0016图2质粒PKTACACT5ACT5的物理图谱。0017图3活化因子基因重组3A羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3AHSD后，酶联免疫吸附实验检测活性表达结果。酶联免疫吸附实验结果证明将活化因子基因加到3羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3HSD基因的不同方向P1，P23，P24都能提高3羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3HSD的表达对照为P6，无活化因子基因。0018图。

12、4酶联免疫吸附实验结果表明在ECOLI中当活化因子的表达量增高时3A羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3AHSD表达也增高。0019图5酶联免疫吸附实验结果表明在CTESTOSTERONI菌中转入PBBTACACT6，3A羟基睾丸酮氧化/脱氢酶3AHSD的表达都提高，对照为空质粒PBBR1MCS2和无质粒野生菌。0020图6活化因子作用机理。00211活化因子能够识别靶基因启动子附近的特异对影DNA序列并结合成二或四聚体。00222该活化因子能与DNA依赖的RNA聚合酶结合，使靶基因启动子处的RNA聚合酶浓度大大增加，从而在转录水平上提高MRNA产量，使目的基因表达增加。0023序列表0024熊光明任政华。

13、0025提高细菌基因表达的活化因子。002620027100285670029DNA0030假单胞旋毛菌COMAMONASTESTOSTERONI0031100321GTGCGCGCAGTGCACTTCCACAGCATCGAAGTTGGCCTGCTTGGCGCGCAGGGCGGCCGC003360AGCAAACCATTCCACCATCTGTGCAATATCGGCCTTGTCCATCACGCGGTAGCGGTCGGG说明书CN102021194ACN102021208A3/3页50034120GTAGGGGCCAATCCCCACAAAGGTCGAGAATTCCTTGGGCGTGACGGTGCGC。

14、ATGGCTTC0035180GGCCACAGGACCGTCGGGCGGAATCGAGGACACCCACATCTCGCGCCCGTGGGTGCGGTC0036240ATTGGCAGCGACCTTGCCGCTGTGATTGATCTGGATGGCGACTTTGCCGCCGTGCGAGTG0037300AACGCGGCGCGTGACTTCGGCCAGACCGGGGATGAAGCTGTCGTTGGAGATGCCCAGTTG0038360GTGCGGCTCGCTGGTGCCGGTGGGCCAGGAGATGGCGGCCGTGCCCATGATGATGAGGCC0039420GGTGCCGCCCTTGGCAC。

15、GCTCTTCGTAATAGTCCTGGGCGCGTTCGCCGCAGATACCGTC0040480GGTGCCGCCGTAGTTCTCGCCCATGGGGGCCATGATGATGCGGTTCTTCAGCTCCATGGT0041540GCCGATACGGCCCGGCTGCAGCATTGA5670042200431500044PRT0045假单胞旋毛菌COMAMONASTESTOSTERONI004620047VALARGALAVALHISPHEHISSERILEGLUVALGLYLEULEUGLY00481510150049ALAGLNGLYGLYARGSERLYSPROPHEHISHISLE。

16、UCYSASNILE00502025300051GLYLEUVALHISHISALAVALALAVALGLYVALGLYALAASNPRO00523540450053HISLYSGLYARGGLUPHELEUGLYARGASPGLYALAHISGLYPHE00545055600055GLYHISARGTHRVALGLYARGASNARGGLYHISPROHISLEUALA00566570750057PROVALGLYALAVALILEGLYSERASPLEUALAALAVALILEASP00588085900059LEUASPGLYASPPHEALAALAVALARGVALASNALAALAA。

17、RGASP0060951001050061PHEGLYGLNTHRGLYASPGLUALAVALVALGLYASPALAGLNLEU00621101151200063VALARGLEUALAGLYALAGLYGLYPROGLYASPGLYGLYARGALA00641251301350065HISASPASPGLUALAGLYALAALALEUGLYTHRLEUPHEVALILE0066140145150说明书CN102021194ACN102021208A1/6页6图1说明书附图CN102021194ACN102021208A2/6页7图2说明书附图CN102021194ACN102021208A3/6页8图3说明书附图CN102021194ACN102021208A4/6页9图4说明书附图CN102021194ACN102021208A5/6页10图5说明书附图CN102021194ACN102021208A6/6页11图6说明书附图CN102021194A。

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