一种紫杉醇磁性纳米脂质体的制备方法.pdf

紫杉醇是近20年来抗肿瘤药物领域的重大发现，具有高度亲脂性，不溶于水。现有的上市剂型为注射型，以聚羟乙基蓖麻油∶乙醇(1∶1)为溶剂，使用前用右旋葡糖苷等稀释至稀释到0.3-1.2mg/ml。由于溶剂及紫杉醇本身的毒副作用阻碍了其在临床上的应用。目前，紫杉醇尚未有较好靶向效果的靶向制剂。本发明的目的就是提供紫杉醇磁性纳米脂质体靶向制剂，这种磁性脂质体的制备方法是采用微乳液-低温固化的方法制备，其过程如下：油相(硬脂酸)、表面活性剂(吐温-80)、助表面活性剂(乙醇)在73±2℃水浴中混合，滴加入一定量的蒸馏水，形成透明体系，迅速加入分散好的磁液，搅拌均匀，形成含磁悬液，将该混悬液注入置于冰浴中的水分散，得到产品粒子悬液，将悬液透析清洗，冷冻干燥，即得磁性固体脂质纳米粒产品。

1、  采用微乳液-低温固化的方法制备紫杉醇磁性纳米脂质体，其过程如下：油相(硬脂酸)、表面活性剂(吐温-80)、助表面活性剂(乙醇)在73±2℃水浴中混合，滴加入一定量的蒸馏水，形成透明体系，迅速加入分散好的磁液，搅拌均匀，形成含磁悬液，将该混悬液注入置于冰浴中的水分散，得到产品粒子悬液，将悬液透析清洗，冷冻干燥，即得磁性固体脂质纳米粒产品。

2、  权利要求1所述的磁性纳米脂质体，其配方为：硬脂酸为5-10g，油酸为1.5-2.5g，Fe₃O₄为5-10g，吐温-80为6-12g，乙醇为2-5g，水为35-65g时制备的脂质体粒子粒径在150nm～170nm之间，脂质体具有较好的稳定性和磁响应性；当紫杉醇用量为1g时具有最大的药物包封率，为98.29％(W/W)。

3、  权利要求1所述的磁性纳米脂质体，其脂质体内核为Fe₃O₄磁性纳米粒子，可以借助外加磁场的作用将脂质体送到靶部位。

4、  权利要求1所述的紫杉醇磁性纳米脂质体的制备方法由以下步骤构成：
(1)以铁盐和氨水共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，经研究其显著影响因素和适合的反应条件为：沉淀剂氨水的用量以铁盐混合液与氨水体积比为1∶8最佳，维持反应体系pH＝10，并施加氮气保护；铁盐溶液浓度以1.0mol·L^-1为宜，且Fe²⁺∶Fe³⁺＝1∶2，在合成阶段和清洗阶段分别施加超声处理，可以制得平均粒径在10nm左右、质量磁化率为9.05×10^-2m³·kg^-1的Fe₃O₄磁性纳米粒子；
(2)选择微乳液-低温固化法制备紫杉醇磁靶向固体脂质纳米粒给药系统，结果如下：油酸能有效地对Fe₃O₄磁性纳米粒子(磁核)进行表面亲油改性，使其能很好地被脂质材料包埋，并保持稳定；较理想的紫杉醇磁性纳米脂质体的制备条件为：硬脂酸为0.5g，改性的Fe₃O₄粒子为0.5g，吐温-80为0.8g，乙醇为3.2g，水为4g，紫杉醇用量为100mg；所制得的紫杉醇磁性固体脂质纳米粒平均粒径200nm左右，药物包封率为87.70％(w/w)，可见微乳液-低温固化法是较理想的制备紫杉醇磁性固体脂质纳米粒的方法；
(3)对于制备的脂质体进行低温冷冻干燥，得到紫杉醇磁性固体纳米脂质体；
(4)施加的聚乙二醇的量对实验结果的影响：脂质体各组分的配比为：Fe₃O₄1.00g，吐温-801.60g，乙醇6.40g，硬脂酸1.00g，水8g混合反应制备紫杉醇磁性纳米脂质体乳液后，倒入含有6g聚乙二醇-800的36ml生理盐水组中，具有较好的稳定性。

一种紫杉醇磁性纳米脂质体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物脂质体制剂及其制备方法，尤其涉及紫杉醇脂质体的制备方法。
背景技术：
紫杉醇^[57]是近20年来抗肿瘤药物领域的重大发现，分子式为C₄₇H₅₁O₁₄N，分子质量853.9，具有高度亲脂性，不溶于水，血浆蛋白结合率89％-98％，终末半衰期平均值为5.3-17.4h，主要经肝脏代谢，肾脏清除仅5％。此药于1983年开始用开卵巢癌和乳腺癌的临床研究，1992年经FDA批准上市。它作用机理独特，可促进微管蛋白装配成微管，但抑制微管的解聚，从而导致细胞死亡，从而导致维管束的排列异常，使纺锤体失去正常功能导致细胞死亡，其对多种肿瘤有治疗效果，尤其对乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤治疗效果更突出。紫杉醇主要从红豆杉中提取，但红豆杉中紫杉醇含量并不高，如紫杉醇含量最高的树皮中含量也仅为0.01％-0.02％，提取1kg的紫杉醇需要15-30吨树皮，但紫杉醇的市场需求量却较高，目前美国的年需求为300kg，而且以每年20％的速度增长。
现有的上市剂型为注射型，以聚羟乙基蓖麻油∶乙醇(1∶1)为溶剂，浓度为6g/L的紫杉醇注射液，在4℃下可稳定5个月，使用前用右旋葡糖苷等稀释至稀释到0.3-1.2mg/ml，用药量为135mg/m²。由于溶剂及紫杉醇本身的毒副作用阻碍了其在临床上的进一步应用。为改变这一现状，研究人员对紫杉醇进行了生产及药物剂型改变的研究。在生产上实现其它工艺生产紫杉醇，如合成法、生物技术法、真菌发酵法等。药剂学方面的改性方法有前体药物法、乳剂法、脂质体法、和环糊精包埋等。其中脂质体法可以提高药物的给药量，实现药物在体内的缓慢释放，增加了药物在体内的代谢时间，同时，因脂质体可以使用水作溶剂，避免了因使用有机溶剂产生的毒副作用，具有较好的发展前景。
目前，紫杉醇尚未有具有较好靶向效果的靶向制剂。
发明内容：
本发明的目的就是为了克服目前没有较好的靶向作用的制剂的缺点，提供紫杉醇磁性纳米脂质体，本发明还提供了这种磁性脂质体的制备方法。
本发明的制备方法：
1、Fe₃O₄纳米磁核的制备
以共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，在反应体系中加入一定体积pH为8-12的氨水，不断搅拌下滴加Fe²⁺、Fe³⁺混合液(按Fe ²⁺/Fe³⁺＝2-0的比例混合)，并用pH＝12的氨水保持体系pH值，同时施加超声作用。铁盐溶液滴加完毕后，继续搅拌反应一段时间，于恒温水浴熟化，之后用去离子水离心清洗，至检测无Cl^-存在为止，再用无水乙醇洗涤，在清洗的过程中施加超声作用。溶液真空干燥，研磨，即得Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末。经研究其显著影响因素和适合的反应条件为：沉淀剂氨水的用量以铁盐混合液与氨水体积比为1∶8最佳，维持反应体系pH＝10，并施加氮气保护；铁盐溶液浓度以1.0mol·L^-1为宜，且Fe²⁺∶Fe³⁺＝1∶2，在合成阶段和清洗阶段分别施加超声处理，合成阶段适宜的超声条件：声强为348w.cm^-2、处理次数6次；清洗阶段适宜的超声条件：声强为276w.cm^-2、处理次数4次。可以制得平均粒径在10nm左右、质量磁化率为9.05×10^-2m³·kg^-1的Fe₃O₄磁性纳米粒子。
2.Fe₃O₄磁性纳米粒子表明改性
将已制好的Fe₃O₄磁性纳米粒粉末加入到已调好pH值的100mL氨水中，加热搅拌至某一温度，缓慢加入一定量的油酸，保温20min，冷却，用磁铁将絮状沉淀吸住，倾去废液。余下的絮沉物加入一定量丙酮处理，除去多余的油酸及丙酮，即得产品。考察不同的pH值、油酸用量及改性温度对改性效果的影响。pH值选择范围为pH＝6-10；油酸用量为油酸∶磁粉(W/W)＝1∶1.5-1∶5；温度考察范围在40-80℃。结果表明，pH＝9，油酸用量为油酸∶磁粉＝1∶2，温度为70℃时有较理想的表面改性效果。油酸的包覆过程需要吸收能量，在70℃以下，随着温度的升高油酸吸附量增大，至70℃时达到平衡，再随着温度继续升高，解吸的速度也迅速增大甚至大于吸附速度，使吸附量反而下降。
紫杉醇磁性纳米脂质体的制备
油相(硬脂酸)、表面活性剂(吐温-80)、助表面活性剂(乙醇)在73±2℃水浴中混合，滴加入一定量的蒸馏水，形成透明体系，迅速加入分散好的磁液，搅拌均匀，形成含磁悬液，将该混悬液注入置于冰浴中的水分散，得到产品粒子悬液，将悬液透析清洗，冷冻干燥，即得磁性固体脂质纳米粒产品。较理想的紫杉醇磁性固体脂质纳米粒给药体系的制备条件为：硬脂酸为0.5g，K(硬脂酸/(Tween80+乙醇))＝1∶8，吐温80∶乙醇∶水＝9.8∶39.3∶50.9，硬脂酸∶改性磁粒＝1∶1(W/W)，紫杉醇用量为100mg，所制得的紫杉醇磁性固体脂质纳米粒平均粒径为150-170nm，包封药量为98.29mg，药物包封率为98.29％(w/w)。
4.体内外磁靶向性
本发明的紫杉醇磁性纳米脂质体，体外释放实验表明，具有足够的磁响应性，其在外加磁场的作用下可以顺利的到达并聚集在靶部位。在体外磁导向定位实验中，在设定的磁场范围(0.4T、0.6T、0.8T)、作用时间(10-120min)条件下，所制备的紫杉醇磁性固体脂质纳米粒子显示出良好的体外磁靶向性，尤其是在磁场强度为0.8T，作用时间为30min时，可以达到在靶区的100％滞留率。
体内的靶向实验分别给予大鼠紫杉醇脂质体和紫杉醇磁性纳米脂质体，在肝部位施加0.5T的磁场，处死后测定靶部位的紫杉醇浓度，实验证明靶部位与非靶向部位存在显著差别(P＜0.2)。
5.靶向治疗裸鼠肿瘤
取对数生长期的SPCA-I细胞，注射裸鼠前肢腋下，待肿瘤生长至6mm时，将裸鼠随机分为六组，分别给予注射药物分别为：1)尾静脉注射生理盐水(NS)组；2)尾静脉注射空白脂质体(LPS)；3)尾静脉紫杉醇脂质体(Taxol-LPS)；4)尾静脉注射磁性空白脂质体(Mag-LPS)；5)尾静脉注射磁性靶向脂质体(Taxol-Mag)，体外不施加磁场；6)尾静脉注射磁性靶向脂质体(Taxol-Mag)，体外施加磁场，磁场强度为0.5特斯拉(T)。注射的紫杉醇磁性纳米脂质体乳液中紫杉醇的含量为，注射量为0.05ml/10g。重量抑瘤率为：

注：*为P＜0.05，相对生理盐水。
从已有的试验结果我们可以看到磁性脂质体作为一种药物剂型还是有较大的发展前景的。