五环三萜类化合物的氨基酸偶合物前药及其医药用途.pdf

本发明的目的是提供式I和II所示的五环三萜类化合物与氨基酸通过酯键或氨基甲酸酯键形成的偶合物，其中，R1为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；X为H2或O；R2为H，CH3或COOH；R3为CH3或COOH；R4为H或CH3。

1、  由式I和II所代表的五环三萜类化合物与氨基酸通过酯键或氨基甲酸酯键形成的偶合物：

其中，R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；X为H₂或O；R₂为H，CH₃或COOH；R₃为CH₃或COOH；R₄为H或CH₃。

2、  权利要求1中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物，在式I和II所代表的结构式中，R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；R₂为CH₃；R₃为COOH；R₄为H；X为H₂。

3、  权利要求1中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物，在式I和II所代表的结构式中，R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；R₂为COOH；R₃为CH₃；R₄为H；X为O。

4、  权利要求1中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物，在式I和II所代表的结构式中，R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；R₂为H；R₃为COOH；R₄为CH₃；X为H₂。

5、  权利要求1-4中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物的非毒性药学上可接受的盐。

6、  含有权利要求1-4中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。

7、  权利要求1-4中式I和II所代表的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含权利要求1-4中式I和II所示的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物用于治疗肝炎的用途。

五环三萜类化合物的氨基酸偶合物前药及其医药用途
技术领域：
本发明涉及五环三萜类化合物如齐墩果酸、甘草次酸及乌索酸等与氨基酸通过酯键或氨基甲酸酯键偶合形成的前药及其非毒性的药学上可接受的盐；以及含有这些化合物作为活性成分的药物组合物及其在制备肝炎治疗药物方面的应用。
技术背景：
五环三萜类化合物如齐墩果酸、甘草次酸及乌索酸等具有保肝解毒、抗炎、抗溃疡、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性，在临床被用于治疗各种急慢性肝炎。其化学结构如下：

   甘草次酸               齐墩果酸                       乌索酸
但是该类化合物水溶性差，口服生物利用度低，如大鼠口服齐墩果酸的绝对生物利用度只有0.7％。(DW Jeong，YH Kim，HH Kim，et al.Biopharmaceutics&Drug Disposition 2007，28：51-57.)。因此，其口服制剂难以发挥较好的疗效。
发明内容：
将药物通过可生物降解的化学键与氨基酸偶联形成的前药，可以提高药物的水溶性；同时利用氨基酸的主动转运途径促进药物的吸收。因此，药物与氨基酸形成的前药能够显著提高药物的生物利用度。
本发明的目的是提供式I和II所示的五环三萜类化合物与氨基酸通过酯键或氨基甲酸酯键形成的偶合物前药：

其中，R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；X为H₂或O；R₂为H，CH₃或COOH；R₃为H，CH₃或COOH；R₄为H或CH₃。
本发明还提供式I和II所示的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物的非毒性药学上可接受的盐。
本发明还提供含有式I和II所示的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物的非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。
本发明还提供式I和II所示的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含式I和II所示的五环三萜类化合物的氨基酸偶合物及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物用于治疗肝炎的用途。
具体实施方式
本发明的化合物I可以按照如下合成路线制备：

五环三萜类化合物与N-苄氧羰基氨基酸在二环己基碳二亚胺作用下缩合，得到3-O-(α-N-苄氧羰基氨基-烷基酰)-五环三萜衍生物，催化氢化脱保护，得到目标化合物。结构式中R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；X为H₂或O；R₂为H，CH₃或COOH；R₃为H，CH₃或COOH；R₄为H或CH₃。
本发明的化合物II可以按照如下合成路线制备：

五环三萜类化合物与氯甲酸对硝基苯酯反应，得到3-O-(对硝基苯氧基羰基羰基)-五环三萜衍生物，后者与氨基酸反应，得到目标化合物。结构式中R₁为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基；X为H₂或O；R₂为H，CH₃或COOH；R₃为H，CH₃或COOH；R₄为H或CH₃。
下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实施例不应作为对本发明的范围的限制。
实施例1  3-O-(甘氨酰)-齐墩果酸(I₁)的制备
将2.3g(5.0mmol)齐墩果酸、1.1g(5.0mmol)N-苄氧羰基甘氨酸用25ml二甲基甲酰胺溶解，然后加入0.1ml二甲氨基吡啶，1.3g(6mmol)二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应过夜，过滤，将滤液减压蒸干。将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇/乙酸(9∶1∶0.01)混合溶剂洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸2.4克。
将3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸2.4克用25ml毫升二氧六环溶解，加入0.2克5％的钯炭，在1个大气压的氢气下搅拌4小时后，滤去催化剂。将滤液减压浓缩，然后以硅胶柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得I₁1.5克。
核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.93(S，3H)；0.96(S，3H)；1.11(S，3H)；2.76(brd，1H)；3.98(m，2H)；4.78(dd，1H)；5.16(br s，1H)；8.27(br s，2H)；12.14(br S，1H)。
实施例2  3-O-(L-丙氨酰)-齐墩果酸(I₂)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-丙氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下与齐墩果酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-齐墩果酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)齐墩果酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₂。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.11(S，3H)；1.26(d，3H)；2.76(br d，1H)；3.54(q，1H)；4.78(dd，1H)；5.16(br s，1H)；8.27(br s，2H)；12.10(br S，1H)。
实施例3  3-O-(L-缬氨酰)-齐墩果酸(I₃)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-缬氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与齐墩果酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-齐墩果酸。
用3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-齐墩果酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₃。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.73(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.92(m，6H)；0.96(S，3H)；1.11(S，3H)；2.25(m，1H)；2.75(br d，1H)；3.69(m，1H)；4.76(dd，1H)；5.19(br s，1H)；8.27(br s，2H)；12.20(br S，1H)。
实施例4  3-O-(L-亮氨酰)-齐墩果酸(I₄)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-亮氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与齐墩果酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-亮氨酰)-齐墩果酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-亮氨酰)-齐墩果酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₄。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.65(d，6H)；0.72(S，3H)；0.83(S，3H)；0.88(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.09(S，3H)；1.35(m，2H)；2.78(br d，1H)；3.54(m，1H)；4.76(dd，1H)；5.17(br s，1H)；8.27(br s，2H)；12.06(br S，1H)。
实施例5  3-O-(L-异亮丙氨酰)-齐墩果酸(I₅)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-异亮氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与齐墩果酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-异亮氨酰)-齐墩果酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-异亮氨酰)-齐墩果酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₅。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.64(t，3H)；0.72(S，3H)；0.82(d，3H)；0.88(S，3H)；0.89(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.03(m，2H)；1.09(S，3H)；1.35(m，1H)；2.78(br d，1H)；3.54(m，1H)；4.77(dd，1H)；5.19(br s，1H)；8.27(br s，2H)；12.15(br S，1H)。
实施例6  3-O-(L-苯丙氨酰)-齐墩果酸(I₆)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与齐墩果酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-苯丙氨酰)-齐墩果酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-苯丙氨酰)-齐墩果酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₆。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.12(S，3H)；2.78(br d)；3.01(dd，1H)；3.15(dd，1H)；4.45(m，1H)；4.79(dd，1H)；5.18(br s，1H)；7.23-7.26(m，5H)；8.27(br s，2H)；12.09(br S，1H)。
实施例7  3-O-(L-缬氨酰)-甘草次酸(I₇)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-缬氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与甘草次酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-甘草次酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-甘草次酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.76(S，3H)；0.83(S，3H)；0.92(m，6H)；0.98(S，3H)；1.04(S，3H)；1.07(S，3H)；1.10(S，3H)；1.37(S，3H)；2.09(br m，1H)；2.25(m，1H)；2.42(s，1H)；2.50(d，1H)；3.69(m，1H)；4.79(br m，1H)；5.41(s，1H)；8.27(br s，2H)；12.18(br S，1H)。
实施例8  3-O-(L-缬氨酰)-乌索酸(I₈)的制备
按照实施例1的方法，用N-苄氧羰基-L-缬氨酸代替N-苄氧羰基甘氨酸，在二环己基碳二亚胺作用下，与乌索酸缩合，得到3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-乌索酸。
按照实施例1的方法，用3-O-(N-苄氧羰基-L-缬氨酰)-乌索酸代替3-O-(N-苄氧羰基甘氨酰)-齐墩果酸，催化氢化脱保护，得到I₈。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.78(S，3H)；0.85(d，3H)；0.89(S，3H)；0.91(S，3H)；0.92(m，6H)；0.93(d，3H)；0.97(S，3H)；1.07(S，3H)；2.18(d，1H)；2.25(m，1H)；3.69(m，1H)；4.61(t，1H)，5.24(m，1H)；8.21(br s，2H)；12.23(br S，1H)。
实施例9  3-O-[(α-羧基甲基)氨基-羰基]-齐墩果酸(II₁)的制备
将23g(50.0mmol)齐墩果酸溶于100mL吡啶，冰浴冷却到0℃，加入氯甲酸对硝基苯酯15g(75mmol)，冰浴下搅拌反应30分钟；然后室温下反应5小时，将反应液倒入适量的冰冷的1N盐酸溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，干燥完成后，依次除去干燥剂，溶剂，残余物用硅胶柱分离用二氯甲烷/甲醇(5∶1)混合溶剂洗脱，得3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸14.0g。
取3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸1.25g(2.0mmol)溶于5毫升二氧六环和5毫升水的混和溶剂中，加入甘氨酸0.3g(4.0mmol)，4-甲基吗啉0.4g(4.0mmol)。在50℃搅拌反应15小时，将反应液用1N盐酸酸化，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，依次除去干燥剂，溶剂，残余物用硅胶柱分离，用二氯甲烷/甲醇(5∶1)混合溶剂洗脱，得II₁0.6g。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.93(S，3H)；0.96(S，3H)；1.11(S，3H)；2.76(br d，1H)；3.98(m，2H)；4.78(dd，1H)；5.16(br s，1H)；5.72(br s，1H)；10.9(br S，1H)；12.14(br S，1H)。
实施例10  3-O-[(1-羧基乙基)氨基-羰基]-齐墩果酸(II₂)的制备
按照实施例9的方法，用L-丙氨酸代替甘氨酸，与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸反应，得II₂。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.11(S，3H)；1.26(d，3H)；2.76(br d，1H)；3.54(q，1H)；4.78(dd，1H)；5.16(brs，1H)；5.82(br s，1H)；10.5(br S，1H)；11.4(br S，1H)。。
实施例11  3-O-[(1-羧基-2-甲基-丙基)氨基-羰基]齐墩果酸(II₃)的制备
按照实施例9的方法，用L-缬氨酸代替甘氨酸，与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸反应，得II₃。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.73(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.92(m，6H)；0.96(S，3H)；1.11(S，3H)；2.25(m，1H)；2.75(br d，1H)；3.69(m，1H)；4.76(dd，1H)；5.19(br s，1H)；5.80(br s，1H)；10.8(br S，1H)；12.04(br S，1H)。
实施例12  3-O-[(1-羧基-3-甲基-丁基)氨基-羰基]-齐墩果酸(II₄)的制备
按照实施例9的方法，用L-亮氨酸代替甘氨酸，与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸反应，得II₄。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.65(d，6H)；0.72(S，3H)；0.83(S，3H)；0.88(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.09(S，3H)；1.35(m，2H)；2.78(br d，1H)；3.54(m，1H)；4.76(dd，1H)；5.17(br s，1H)；5.69(br s，1H)；10.9(br S，1H)；12.14(br S，1H)。
实施例13  3-O-[(1-羧基-2-甲基-丁基)氨基-羰基]-齐墩果酸(II₅)的制备
按照实施例9的方法，用L异亮氨酸代替甘氨酸，与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸反应，得II₅。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.64(t，3H)；0.72(S，3H)；0.82(d，3H)；0.88(S，3H)；0.89(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.03(m，2H)；1.09(S，3H)；1.35(m，1H)；2.78(br d，1H)；3.54(m，1H)；4.77(dd，1H)；5.19(br s，1H)；5.72(br s，1H)；10.9(br S，1H)；12.14(br S，1H)。
实施例14  3-O-[(1-羧基-2-苯基-乙基)氨基-羰基]-齐墩果酸(II₆)的制备
按照实施例9的方法，用L-苯丙氨酸代替甘氨酸，与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-齐墩果酸反应，得II₆。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.72(S，3H)；0.82(S，3H)；0.87(S，3H)；0.90(S，3H)；0.91(S，3H)；0.95(S，3H)；1.12(S，3H)；2.78(br d，1H)；3.01(dd，1H)；3.15(dd，1H)；4.45(m，1H)；4.79(dd，1H)；5.18(br s，1H)；5.72(br s，1H)；7.23-7.26(m，5H)；10.9(br S，1H)；12.14(brS，1H)。
实施例15  3-O-[(1-羧基-2-甲基-丙基)氨基-羰基]-甘草次酸(II₇)的制备
按照实施例9的方法，用甘草次酸代替齐墩果酸，与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-甘草次酸。
按照实施例9的方法，用L-缬氨酸与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-甘草次酸反应，得II₇。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.76(S，3H)；0.83(S，3H)；0.92(m，6H)；0.98(S，3H)；1.04(S，3H)；1.07(S，3H)；1.10(S，3H)；1.37(S，3H)；2.09(br m，1H)；2.25(m，1H)；2.42(s，1H)；2.50(d，1H)；3.69(m，1H)；4.79(br m，1H)；5.41(s，1H)；5.72(br s，1H)；10.9(br S，1H)；12.14(br S，1H)。
实施例16  3-O-[(1-羧基-2-甲基-丙基)氨基-羰基]-乌索酸(II₈)的制备
按照实施例9的方法，用乌索酸代替齐墩果酸，与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-乌索酸。
按照实施例9的方法，用L-缬氨酸与3-O-[(对-硝基)苯氧基-羰基]-乌索酸反应，得II₈。核磁共振氢谱：δ(ppm，DMSO-d₆)：0.78(S，3H)；0.85(d，3H)；0.89(S，3H)；0.91(S，3H)；0.92(m，6H)；0.93(d，3H)；0.97(S，3H)；1.07(S，3H)；2.18(d，1H)；2.25(m，1H)；3.69(m，1H)；4.61(t，1H)，5.24(m，1H)；5.72(br s，1H)；10.9(br S，1H)；12.14(br S，1H)。
实施例17化合物对小鼠CCl₄中毒性肝损伤的治疗作用
取质量大约20-25g的Baclb/c小鼠，随机分组，每组10只小鼠。用100mL/L％的CCl₄，按照10mL/kg的剂量，皮下注射制备肝损伤模型，皮下注射生理盐水作为正常对照组。造模4h后，通过腹腔注射或口服给予不同剂量的待测化合物，1次/12h，连续2天。治疗完成后，处死动物，留取血清标本，统一用全自动生化仪测定血清中的ALT，AST水平。测定结果见下表：

实施例18化合物对对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤的治疗作用
取质量大约20-25g的Baclb/c小鼠，随机分组，每组10只小鼠。用110mL/kg的对乙酰氨基酚皮下注射制备肝损伤模型，皮下注射生理盐水作为正常对照组。造模4h后，通过腹腔注射或口服给予不同剂量的待测化合物，1次/12h，连续2天。治疗完成后，处死动物，留取血清标本，统一用全自动生化仪对于血清中的ALT，AST水平进行检测。测定结果见下表：