氨基酸的ΑN甲基化.pdf

本发明涉及氨基酸的α-N-甲基化。该方法适用于在树脂上进行甲基化，适用于Fmoc/tBu SPPS，也适用于携有保护的或未保护的亲核侧链的氨基酸，特别是Arg(Pbf)、Met、Cys和Trp。本发明还涉及式(I)化合物，在式(I)中，m、n、X和Y如说明书中所定义。

1.  氨基酸的^αN-保护的方法，该方法包括使得氨基酸或肽与5-氯代二苯并环庚烷(Dbs-Cl)反应的步骤。

2.  权利要求1的方法，其中所述氨基酸或肽与固相树脂偶合。

3.  权利要求1或2的方法，其中所述氨基酸选自Arg(Pbf)[Pbf＝2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰胺]、蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸。

4.  权利要求1-3的方法，该方法包括下列步骤：
a)使氨基酸或肽与固相树脂偶合
b)使步骤a)的产物与Dbs-Cl反应。

5.  权利要求1-4的方法，其中所述氨基酸包括侧链保护基团。

6.  权利要求1-5的方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与甲醛或被保护的甲醛等价物反应的步骤。

7.  权利要求6的方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与还原剂反应的步骤。

8.  权利要求6或7的方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与酸反应的步骤。

9.  权利要求8的方法，其中所述酸为TFA。

10.  权利要求9的方法，其中所述TFA为5％的TFA。

11.  权利要求10的方法，其中所述还原剂为NaCNBH₃或NaBH(OAc)₃。

12.  在固相树脂上使得Arg(Pbf)进行^αN-甲基化的方法，该方法包括下列步骤：
a)将Fmoc-保护的Arg(Pbf)进行Fmoc脱保护；
b)使步骤a)的产物与Dbs-Cl反应；
c)使步骤b)的产物与甲醛或被保护的甲醛等价物反应；
d)使步骤c)的产物与还原剂反应；并且
e)使步骤d)的产物与酸反应。

13.  权利要求12的方法，其中所述酸为TFA。

14.  权利要求13的方法，其中所述TFA为5％的TFA。

15.  权利要求12-14的方法，其中所述还原剂为NaCNBH₃或NaBH(OAc)₃。

16.  式I化合物：

其中：
R为保护的或未保护的氨基酸侧链；
每一个X和Y独立选自低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基；并且
m和n独立为0、1或2。

17.  权利要求16的化合物，其中m为0。

18.  权利要求16或17的化合物，其中n为0。

19.  权利要求16-18的化合物，其中所述氨基酸侧链为下列氨基酸的侧链：Arg、Arg(Pbf)、Met、Cys、Trp、Gln、Gly、Val、Ala、Orn、Ile、Leu、Tyr、Phe、Ser、Asn、Lys、Thr和His。

20.  权利要求19的化合物，其中所述氨基酸侧链为Arg(Pbf)。

21.  权利要求20的化合物，该化合物具有下列结构：


22.  在固相树脂上合成肽的方法，该方法包括下列步骤：
a)使得Fmoc-或Boc-保护的氨基酸或肽脱保护，
b)使得步骤a)的产物与权利要求21的化合物反应。

23.  权利要求22的方法，该方法还包括使得步骤b)的产物与酸反应。

24.  权利要求23的方法，其中所述酸为TFA。

25.  权利要求24的方法，其中所述TFA为5％的TFA。

氨基酸的α-N-甲基化
技术领域
本发明涉及^αN-甲基化的氨基酸的合成方法。
背景技术
在肽合成中，酰胺键^αN-甲基化通常用于消除蛋白水解的敏感性，提高具有最小结构扰动(minimal structural perturbation)的肽的稳定性。氨基酸的甲基化可以追溯至Emil Fischer的研究，他是第一个完成α-氨基酸的单-甲基化的(Fischer，E.；Lipschitz，W.Chem.Ber.1915，48，360.)。Fischer的三步合成路线包括下列三个关键步骤：将伯α-氨基进行暂时保护以保留单一N-H基团，进行^αN-甲基化从而以N-CH₃基团代替N-H基团，将暂时保护基团去保护从而释放现在为仲的^αN-甲基氨基酸。尽管在化学细节上存在差别，但是目前应用的多数^αN-甲基化化学方法仍然采用相同的三个关键步骤。
详细分析而言，Fischer原创的化学方法是有问题的，这是由于下面两方面的原因。首先，在他第一个步骤中作为暂时保护的甲苯磺酰胺保护基团的使用使得在第三步骤中需要采用过分苛刻的去保护化学条件(浓盐酸回流)，它不适用于酰胺键，实际上也不适用于多数蛋白原侧链。第二方面，在第二步骤中的甲基化化学方法是在强烷基化和促外消旋化条件下进行的。因为以上原因，自此以后的大多数合成工作旨在努力将该相同的三步反应流程开发为较温和的方法。
在^αN-甲基化化学领域中最初的改进是由Quitt等报道的，其中Leukart反应被应用于^αN-苄基氨基酸的甲基化(Quitt，P.In Proceedings ofthe 5^th European Peptide Symposium Oxford，UK，1963，第165-169页)。
该反应的温和性和化学选择性(这两者对官能团都是关键因素，并且可以由此推断其一般适用性)使得该方法能够获得具有一系列(尽管不是全部)蛋白生成官能团的立体化学纯的^αN-甲基氨基酸，该反应后来由Ebata等进行了进一步改进(Ebata，M.；Takahashi，Y.；Otsuka，H.Bull.Chem.Soc.Jpn.1966，39，2535)。因为这些反应通过催化氢化从而完成Fischer的第三步骤N-去保护，因而含硫氨基酸使得催化剂中毒、Trp吲哚的还原以及氨基酸在氢化反应条件下的不溶性都是待解决的问题，这些问题导致低收率。然而，该化学方法奠定了后来立体化学纯的^αN-甲基氨基酸合成的基础。
自从Leukart反应用于^αN-甲基化的效果得到证实后，该转化的多种具有不同程度复杂性的其它方法也有报道。这些方法在其它地方也有详细的综述，但是大部分为能够获得特定结构的创新，例如天然产物合成子(natural product synthon)，它们不能作为^αN-甲基化的一般可适用的方法(Aurelio，L.；Brownlee，R.T.C.；Hughes，A.B.Chem.Rev.2004，104，5823-5846；Sagan，S.；Karoyan，P.；Lequin，O.；Chassaing，G.；Lavielle，S.Curr.Med.Chem.2004，11，2799-2822)。一类值得注意的化学方法主要集中在^αN-氨基甲酰基-或酰基氨基酸的5-噁唑烷酮类，它们通常通过甲醛类原料的环化脱水制备，然后经还原获得^αN-保护的^αN-甲基氨基酸(Reddy，G.V.；Rao，G.V.；Iyengar，D.S.Tetrahedron Lett.1998，39，1985-1986；Freidinger，R.M.；Hinkle，J.S.；Perlow，D.S.；Arison，B.H.J.Org.Chem.1983，48，77)。另一种有价值(很好的)化学方法包括Aza-Diels Alder反应，其中甲基亚胺中间体采用环戊二烯通过环加成而被结合(trapped)，随后通过酸催化的环复原(cycloreversion)和硅烷还原获得^αN-甲基氨基酸(Grieco，P.A.；Bahsas，A.J.Org.Chem.1987，52，5746-5749)。
基于下面两个原因，所有的上述化学方法基本上均不适用于固相上的甲基化。首先，大多数方法采用催化氢化，很久以来催化氢化就被认为不适用于固相合成，因为固体载体实际上不能穿透在这些反应中所使用的催化剂颗粒。第二方面，对于采用无法通过催化氢化除去的暂时^αN-保护基团，最终的去保护步骤通过强酸完成，它不适用于多数保护基团和现代SPPS(固相肽合成)中的肽-树脂键合。
直到Kaljuste和Undén创新了新的三步化学方法，还原甲基化才得以能够用于基于Boc/Bzl方法的固相肽合成(Kaljuste，K.；Undén，A.Int.J.Pept.Prot.Res.1993，42，118-124)。
在该化学领域中，4，4′-二甲氧基二苯基甲基氯(Dod-Cl)用作^αN-脱保护的肽树脂的烷基化试剂。在第二个步骤中，现在的仲^αN-末端采用还原试剂甲醛和NaCNBH₃进行还原甲基化。然后采用1∶1的TFA∶CH₂Cl₂在固相上完成最终的去保护步骤，释放Dod阳离子和新的^αN-甲基末端氨基酸残基。由于其温和性(无强碱、SN2烷基化、不同种类的催化作用以及加热)等，该化学方法的优点使其完全适用于Boc/Bzl SPPS中树脂上的^αN-甲基化。
然而，该化学方法需要在最终的去保护步骤中使用强酸；^αN-Dod末端的去保护需要在高浓度的TFA(50％v/v的CH₂Cl₂溶液)中暴露较长时间(1hr)。所以，该化学方法从根本上不适用于现代Fmoc/tBu SPPS，在这种情况下，高浓度的酸将有效地除去侧链保护基团和/或裂解肽-树脂键。
就Fmoc/tBu SPPS而言，适用的树脂上的甲基化的第一个甲基化化学方法为Fukuyama的硝基苯磺酰胺化学方法(Fukuyama，T.；Jow，C.K.；Cheung，M.Tetrahedron Lett.1995，36，6373-6374，Miller，S.C.；Scanlan，T.S.J.Am.Chem.Soc.1997，119，2301-2302，Yang，L.H.；Chiu，K.L.Tetrahedron Lett.1997，38，7307-7310)。
在该化学方法中，^αN-末端采用2-或2，4-二硝基苯磺酰氯进行磺酰基化。在下一步骤，将磺酰胺氮在SN2或Mitsunobu条件下进行烷基化，获得N-甲基磺酰胺。然后将该磺酰胺在固相上通过硫羟亲核试剂(例如苯硫酚)去保护，获得仲^αN-甲基末端。该化学方法在理论上有益于侧链保护基团和Fmoc/tBu SPPS中使用的肽-树脂结合键完全正交，已经被用于在固相上制备选定的单一^αN-甲基氨基酸以及短肽(Lin，X.D.；Dorr，H.；Nuss，J.M.Tetrahedron Lett.2000，41，3309-3313，Biron，E.；Chatterjee，J.；Kessler，H.Journal of Peptide Science 2006，12，213-219，Biron，E.；Kessler，H.J.Org.Chem.2005，70，5183-5189)。
然而，即使在该化学方法的第一个公开报道中，也已经证明了它基本上或者完全不适用于携有亲核侧链的氨基酸，特别是Met和Arg(Pbf)。这些化学选择性问题随后由Rivier等进行了报道，由于具有较大的侧链相容性，他选择采用Undén的化学方法(在Boc/Bzl的合成中)(Erchegyi，J.；Hoeger，C.A.；Low，W.；Hoyer，D.；Waser，B.；Eltzschinger，V.；Schaer，J.C.；Cescato，R.；Reubi，J.C.；Rivier，J.E.J.Med.Chem.2005，48，507-514)。Fukuyama的化学方法与Arg(Pbf)的不相容性可能是由于硝基苯磺酰胺和Pbf磺酰胺的相似的pKa，而Pbf-保护的胍以及预期的N-末端硝基苯磺酰胺一起被烷基化。

在随后的数年中，随着Fukuyama化学方法对SPPS的适用，Laplante和Hall报道了对于树脂上甲基化的Matteson重排的变通方法(Laplante，C.；Hall，D.G.Org.Lett.2001，3，1487-1490)。然而，该化学方法在操作上非常复杂，并采用了强效的氧化剂处理；结果，它不适用于可氧化侧链，例如Met、Cys(Trt)和Trp，因此，在肽化学中用途有限。
在Fmoc SPPS中，Arg侧链通常采用2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰胺(Pbf)基团屏蔽，在相对温和的整体的(global)去保护条件下它可以顺利地去保护而不会损害其它蛋白生成官能团。在携有N-甲基Arg基团的肽合成中，可以采用Fmoc-MeArg(Mtr)-OH(掺入酸更稳定的4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯-磺酰胺保护基团)作为合成子以避免在树脂上完全的^αN-甲基化步骤。然而，Arg(Mtr)对Arg(Pbf)而言是一个不可行的选择。这是因为在Arg(Mtr)存在下整体去保护步骤伴有多种严重的副反应，它们能够导致不可接受的低收率和复杂的色谱纯化步骤。这些问题归因于在Arg(MeArg)基团进行^αN-甲基化时Mtr保护基团的使用，因为该保护基团对酸十分稳定，在整体去保护步骤中需要进行苛刻的、长时间的酸处理才能将其自Arg侧链除去。而且，它有时只能部分被除去，如此除去的磺酰基阳离子可以共价修饰其它基团，例如Trp。因此，在需要进行Arg的^αN-甲基化的肽构建的放大方法中，对于酸更不稳定的Arg(Pbf)而言，Arg(Mtr)并非一个有效的可供选择的方法。
因此，需要适用于树脂上甲基化的^αN-甲基化化学方法，它适用于Fmoc/tBu SPPS，适用于携有保护的或未保护的亲核侧链的氨基酸，特别是Arg(Pbf)、Met、Cys和Trp。
发明内容
本发明提供了氨基酸的^αN-保护的方法，该方法包括使得侧链保护的或未保护的氨基酸或肽与Dbs-Cl反应的步骤。
本发明提供了上述方法，其中所述氨基酸或肽与固相树脂偶合。
本发明提供了上述方法，其中所述氨基酸为Arg(Pbf)。
本发明提供了氨基酸的^αN-保护的方法，该方法包括下列步骤：
a)使氨基酸或肽与固相树脂偶合，
b)使得步骤a)的产物与Dbs-Cl反应。
本发明提供了上述方法，其中所述氨基酸为Arg(Pbf)。
本发明提供了氨基酸或肽的^αN-甲基化的方法，该方法包括使得氨基酸或肽与Dbs-Cl反应的步骤。
本发明提供了上述方法，其中所述氨基酸或肽与固相树脂偶合。
本发明提供了上述方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与甲醛或保护的甲醛等价物反应的步骤。
本发明提供了上述方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与还原剂反应的步骤。
本发明提供了上述方法，该方法还包括使得氨基酸或肽与酸反应的步骤。
本发明提供了上述方法，其中所述酸为TFA。
本发明提供了上述方法，其中所述TFA为5％的TFA。
在上述方法的某些实施方案中，所述还原剂为NaCNBH₃或NaBH(OAc)₃。
在上述方法的某些实施方案中，所述氨基酸还包括侧链保护基团。
在上述方法的某些实施方案中，所述氨基酸为Arg(Pbf)。
在上述方法的某些实施方案中，所述氨基酸为蛋氨酸。
在上述方法的某些实施方案中，所述氨基酸为色氨酸。
在上述方法的某些实施方案中，所述氨基酸为半胱氨酸。
本发明提供了在固相树脂上对Arg(Pbf)进行^αN-甲基化的方法，该方法包括下列步骤：
a)对Fmoc-保护的Arg(Pbf)进行Fmoc脱保护；
b)使得步骤a)的产物与Dbs-Cl反应；
c)使得步骤b)的产物与甲醛或保护的甲醛等价物进行反应；
d)使得步骤c)的产物与还原剂反应；并且
e)使得步骤d)的产物与酸反应。
本发明提供了上述方法，其中所述酸为TFA。
本发明提供了上述方法，其中所述TFA为5％的TFA。
本发明提供了上述方法，其中所述还原剂为NaCNBH₃或NaBH(OAc)₃。
本发明提供了式I化合物：

其中：
R为保护的或未保护的氨基酸侧链；
每一个X和Y独立选自低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基；并且
m和n独立为0、1或2。
在上述化合物的某些实施方案中，m为0。
在上述化合物的某些实施方案中，n为0。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Arg的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Arg(Pbf)的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Met的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Cys的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Trp的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Gln的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Gly的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Val的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Ala的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Orn的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Ile的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Leu的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Tyr的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Phe的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Ser的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Asn的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Lys的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为Thr的侧链。
在上述化合物的某些实施方案中，所述氨基酸侧链为His的侧链。
本发明提供了具有下列结构的化合物：

本发明提供了在固相树脂上合成肽的方法，该方法包括下列步骤：
a)将Fmoc-或Boc-保护的氨基酸或肽脱保护，
b)使得步骤a)的产物与上述化合物反应。
本发明提供了上述方法，该方法还包括使得步骤b)的产物与酸反应。
本发明提供了上述方法，其中所述酸为TFA。
本发明提供了上述方法，其中所述TFA为5％的TFA。
定义
本文中使用的术语“一个”实体是指一或多个实体；例如，一个化合物是指一或多个化合物或至少一个化合物。因此，术语“一个”、“一或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
无论是在过渡性短语中还是在权利要求中，本说明书中使用的术语“含有”和“包括”应当理解为具有开放的意义。也就是说，该术语应当理解为与术语“含有至少”或“包括至少”相同的意义。当在一种方法中使用时，术语“包括”是指该方法包括至少所述的步骤，但也可以包括另外的步骤。当在化合物或组合物中使用时，术语“包括”是指化合物或组合物包括至少所述的特征或组分，但是也可以包括另外的特征或组分。
除非另外特别说明，本文中使用的术语“或者”具有“和/或”的“包含”的意义，并非“任选一个/或”的“排除的”意义。
本文中使用的术语“独立”代表在任何情况下应用变量，不考虑在相同化合物中具有相同或不同定义的变量存在与否。因此，在其中R出现2次并且被定义为“独立的碳或氮”的化合物中，两个R可以均为碳，两个R可以均为氮，或一个R可以为碳而另一个为氮。
当任何变量在任何描绘或描述化合物(本发明使用或所要求保护的)的基团或结构式中出现一次以上时，则每次出现时其定义独立于在任何其它出现时的定义。同样，取代基和/或变量的组合是允许的。
本文中使用的术语“任选的”或“任选地”是指随后所述的事件或情况可以但是并非需要发生，该表述包括其中事件或情况发生的实例，也包括它不发生的实例。例如，“任选取代的”是指任选取代的基团可以结合一个氢或者一个取代基。
本文中使用的术语“大约”是指近似地在某个范围内、粗略地为该值或其周围。当术语“大约”用于表述数字范围时，它通过延续所述数值的上下限而修正该范围。通常，术语“大约”在本文中用于修正数值，表示该所述值上下差异为20％。
本文中使用的“氨基酸”是指由R′-NH-CH(R)-C(O)-R′所代表的一组化合物，其中每一个R′独立为氢、脂族基团、取代的脂族基团、芳族基团、另一个氨基酸、肽或取代的芳族基团。氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸。R可以为氢或为天然存在的氨基酸的保护的或未保护的侧链。
本文中使用的天然存在的“氨基酸侧链”包括甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲-丁基(异亮氨酸)、-CH₂CH(-CH₃)₂(亮氨酸)、苄基(苯基丙氨酸)、对-羟基苄基(酪氨酸)、-CH₂-OH(丝氨酸)、-CHOHCH₃(苏氨酸)、-CH₂-3-吲哚基(色氨酸)、-CH₂COOH(天冬氨酸)、-CH₂CH₂COOH(谷氨酸)、-CH₂C(O)NH₂(天门酰胺)、-CH₂CH₂C(O)NH₂(谷氨酰胺)、-CH₂SH(半胱氨酸)、-CH₂CH₂SCH₃(蛋氨酸)、-[(CH₂)]₄NH₂(赖氨酸)、-[(CH₂)]₃NH₂(鸟氨酸)、-[(CH)₂]₄NHC(＝NH)NH₂(精氨酸)和-CH₂-3-咪唑基(imidazoyl)(组氨酸)。
含有杂原子官能团的氨基酸侧链，例如醇(丝氨酸、酪氨酸、羟基脯氨酸和苏氨酸)、胺(赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸和精氨酸)，可能需要保护基团以促进本文中所讨论的反应的进行。当含有杂原子的官能团被修饰从而包含保护基团时，则该侧链被称为氨基酸的“被保护的侧链”。当含有杂原子的官能团没有进行修饰即包含保护基团时，则该侧链被称为氨基酸的“未保护的侧链”。保护基团通常用于肽合成中，这些基团是普通专业人员所熟知的并且是他们经常使用的。例如，多种适当的保护基团以及制备被保护的氨基酸的方法可以参见Green等，有机合成中的保护基团(ProtectingGroups In Organic Synthesis)，第三版，John Wiley&Sons，Inc.纽约，1999。
本文中使用的术语“保护基团”或“暂时保护基团”是指与分子中的官能团反应并与之结合的化学基团，它使得该官能团免于参与分子随后的反应，但该基团可以随后除去从而再生成未保护的官能团。其它参考参见：牛津生物化学和分子生物学字典(Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，Oxford(牛津)，1997，它是“保护基团”在有机化学领域中作为充分确立的术语的证明。某些常用胺保护基团包括Aloc、Cbz、Dde、Fmoc、Trt和t-Boc。
本文中使用的术语“氨基酸或侧链保护的衍生物”是指天然或非天然氨基酸或在其侧链上另外含有保护基团的衍生物。例如“氨基酸或侧链保护的衍生物”非限定性地包括Arg和Arg(Pbf)。
术语“被保护的甲醛等价物”包括1，3，5-三氧六环、1，3-二氧六环、1，3-二氧戊环、甲醛二甲缩醛(或更高级的烷基缩醛)、多聚甲醛和DMSO。
本文中使用的“载体”、“固体载体”或“固相”是指氨基酸或肽在其上合成、连接、结合或者固定的任何固相物质。载体包括术语例如“树脂”、“固相”、“表面”和“固体载体”。载体可以由有机聚合物以及共聚物和其接枝物(grafts)组成，所述有机聚合物为例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺，载体也可以是无机物，例如玻璃、硅胶、可控孔度玻璃(CPG)或反相硅胶。载体的构型可以是珠状、球状、颗粒状、凝胶状或面状(surface)。面状可以是平面的、基本上平面的或者非平面的。载体可以是多孔的或非多孔的，可以具有膨胀性或者非膨胀性。载体可以成形为井、窝或其它容器的形式、特征或单元。
术语“树脂”或“固相树脂”包括聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)(PS-DVB)树脂、聚(乙二醇)(PEG)类树脂，“杂交(hybrid)”树脂由PEG和聚苯乙烯两种成分以及硅胶-和甲基丙烯酸酯类树脂组成。这些树脂均适用于Dbs/甲基化化学领域-烷基化反应、还原烷基化反应和温和酸解反应，上述这些反应在适合于上述树脂类型的温和的条件下进行，因为这些树脂是由对本文中所述的反应条件惰性的醚类、酯类、酰胺类和聚合骨架组成的。“树脂”包括但不限于聚苯乙烯树脂例如PS-DVB树脂、PEG类树脂例如CLEAR树脂、ChemMatrix树脂和PEGA树脂、杂交树脂(部分PEG和部分聚苯乙烯)例如TentaGel和HypoGel以及硅胶/甲基丙烯酸酯树脂例如SynBeads和Functionalized Silica。
术语“连接基团”包括但不限于能够将氨基酸或肽与树脂连接的任何化学实体，例如Rink Amide Linker(它对低浓度的TFA短时间稳定)、苄基酯连接基团(Merrifield Resin)、4-羟基甲基苯基乙酸连接基团(PAMLinker)、对-烷氧基苄基酯连接基团(Wang Resin)、4-羟基甲基苯氧基乙酸连接基团(Sheppard Linker)、4-甲基二苯甲基酰胺连接基团(MBHAResin)、Rink酰胺树脂、Rink Amide Linker和4-(4-氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸连接基团(PAL Linker)。
本文中使用的术语“与固相树脂偶合”是指与固体载体或树脂通过连接基团连接或结合。例如，与固相树脂偶合的氨基酸包括不限于采用RinkAmide Linker与PS-DVB树脂偶合的氨基酸，例如Arg(Pbf)。
除非另外定义，本文中使用的技术和科学术语具有本发明相关领域技术人员通常所理解的意义。本文中可以参考本领域技术人员所熟知的各种方法和材料。阐明药理学普遍原理的标准参考著作包括Goodman和Gilman的“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”第10版，McGraw Hill Companies Inc.，纽约(2001)。技术人员已知的任何适当的材料和/或方法可以用于实施本发明。然而，描述了优选的材料和方法。除非另外说明，下列描述和实施例中所提及的材料、试剂等可以购自商业。
画向环系的键(与顶点连接的相对)表明该键可以与任何适当的环原子连接。
本文中使用的术语“烷基”代表含有1-10个碳原子的非支链或支链饱和的单价烃基。术语“低级烷基”代表含有1-6个碳原子的直链或支链烃基。本文中使用的术语“C1-10烷基”是指由1-10个碳组成的烷基。烷基的实例包括但不限于低级烷基，包括甲基、乙基、丙基、异-丙基、正-丁基、异-丁基、叔-丁基或戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。
当术语“烷基”用作下列其它术语(如“卤代烷基”)的后缀时，它是指被1-3个选自其它特别指定的基团的取代基取代的如上文所定义的烷基。因此，例如，“卤代烷基”代表基团R′R″，其中R′为卤素基团，R″为本文中所定义的亚烷基，可以理解卤代烷基的连接点在亚烷基上。
除非另外说明，本文中使用的“亚烷基”代表1-10个碳原子的二价饱和线性烃基团(例如，(CH₂)n)，或者代表2-10个碳原子的支链饱和二价烃基团(例如，-CHMe-或-CH₂CH(i-Pr)CH₂-)。除了在亚甲基的情况下，亚烷基的开放化合价不与相同的原子连接。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基-亚丙基、1，1-二甲基-亚乙基、亚丁基、2-乙基亚丁基。
本文中使用的缩写“Dbs-Cl”是指5-氯代二苯并环庚烷。
本文中使用的缩写“Dbs”是指二苯并环庚烷。
本文中使用的缩写“TFA”是指三氟乙酸。
本文中使用的缩写“Pbf”是指2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
通常采用的缩写包括：乙酰基(Ac)，偶氮-二-异丁酰基腈(AIBN)，大气压(Atm)，9-硼杂双环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)，叔-丁氧基羰基(Boc)，焦碳酸二-叔-丁基酯或二碳酸二-叔-丁基酯(BOC₂O)，苄基(Bn)，丁基(Bu)，化学文摘登记号(CASRN)，苄氧基羰基(CBZ或Z)，羰基二咪唑(CDI)，1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)，二乙基氨基三氟化硫(DAST)，二亚苄基丙酮(dba)，1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，1，2-二氯乙烷(DCE)，二氯甲烷(DCM)，偶氮二甲酸二乙基酯(DEAD)，偶氮二甲酸二-异-丙基酯(DIAD)，二-异-丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)，二-异-丙基乙基胺(DIPEA)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)，1，1′-二-(二苯基膦基)乙烷(dppe)，1，1′-二-(二苯基膦基)二茂铁(dpPf)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，乙基(Et)，乙酸乙酯(EtOAc)，乙醇(EtOH)，2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙基酯(EEDQ)，乙醚(Et₂O)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′N′-四甲基六氟磷酸乙酸脲(HATU)，乙酸(HOAc)，1-N-羟基苯并三唑(HOBt)，高效液相色谱(HPLC)，异-丙醇(IPA)，六甲基二硅胺基锂(LiHMDS)，甲醇(MeOH)，熔点(mp)，MeSO₂-(甲磺酰基或Ms)，甲基(Me)，乙腈(MeCN)，间-氯代高苯甲酸(MCPBA)，质谱(ms)，甲基叔-丁基醚(MTBE)，N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，N-羧酸酐(NCA)，N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，N-甲基吗啉(NMM)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，氯代铬酸吡啶(PCC)，重铬酸吡啶(PDC)，苯基(Ph)，丙基(Pr)，异-丙基(i-Pr)，每平方英寸磅(psi)，吡啶(pyr)，室温(rt或RT)，叔-丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe₂Si(TBDMS)，三乙胺(TEA或Et₃N)，2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)，三氟甲磺酸盐或CF₃SO₂-(Tf)，1，1′-二-2，2，6，6-四甲基庚烷-2，6-二酮(TMHD)，O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N ′-四甲基四氟硼酸脲(TBTU)，薄层色谱(TLC)，四氢呋喃(THF)，三甲基甲硅烷基或Me3Si(TMS)，对-甲苯磺酸单水合物(TsOH或pTsOH)，4-Me-C₆H₄SO₂-或对苯磺酰基(Ts)，N-尿烷-N-羧酸酐(UNCA)。
当与烷基一起使用时，包括前缀正(n)、异(i-)、仲(sec-)、叔(tert-)和新的传统命名法具有其传统意义。(J.Rigaudy和D.P.Klesney，有机化学命名法(Nomenclature in Organic Chemistry)，IUPAC 1979Pergamon Press，牛津.)。
通常而言，本申请采用的命名法基于AUTONOMTM v.4.0，一种用于生成IUPAC系统命名法的Beilstein Institute计算机处理系统。如果在描述的结构与名称所给定的结构之间存在差异，则以描绘的结构为准。另外，如果结构或部分结构的立体化学没有采用例如粗线或虚线表示，则该结构或部分结构应当理解为包括其所有的立体异构体。
在适用于采用Fmoc/tBu SPPS和采用携带保护的或未保护的亲核侧链(特别是Arg(Pbf)、Met、Cys和Trp)的氨基酸进行的树脂上甲基化的^αN-甲基化化学领域的方法研究中，不选择采用Fukuyama的2，4-二硝基苯磺酰胺，因为在固相化学中存在与Mitsunobu反应相关的风险(偶氮二甲酸酯试剂的爆炸性)和不均匀性问题(三苯膦氧化物的沉淀)。另外，正如所料，Fukuyama的2-硝基苯磺酰胺化学方法被证明是难以处理的；而对于某些获得的目标产物，该化学方法收率低并且肯定无法扩大规模。工作转向最初的Undén化学领域，它完全适用于Boc/Bzl SPPS中通常所采用的甲苯磺酰基酰胺类Arg侧链保护。然而，甲基化后^αN-Dod去保护所需要的相对苛刻的酸解去保护条件不适用于在Fmoc/tBu化学方法中使用的侧链保护和肽-树脂结合。因此，应当确定可供选择的暂时^αN-保护基团，它能够在较温和的条件下除去(在≤10vol％TFA的CH₂Cl₂溶液中处理约5分钟)，这样可以保持保护基团(例如Arg(Pbf)和Tyr(t-Bu))以及连接基团(例如Rink酰胺连接基团)的完整性，它们可以在较高浓度的TFA下经较长时间的酸处理而裂解。N-三苯甲基胺类可以在非常温和的条件下(1％TFA，v/v的CH₂Cl₂溶液)脱保护。然而，已经发现：与Unden的观察一致，^αN-三苯甲基化有效地保护了α-氨基避免了还原烷基化，推断可能是由于大体积的三苯甲基骨架的极大的空间位阻。
需要具有高度酸不稳定性的暂时^αN-保护保护基团(它是Fmoc/tBu化学领域所需要的)和在α-氨基周围具有较小的空间位阻。在有机化学采用的多种保护基团和连接基团中，一种酸不稳定的连接试剂(Ramage三环酰胺连接试剂)基于二苯并环庚烷(Dbs)骨架(Ramage，R.；Irving，S.L.；McInnes，C.Tetrahedron Lett.1993，34，6599-6602)。^αN-二苯并环庚基胺被认为较^αN-三苯甲基胺具有更小的空间密集程度，因为前者的α-碳为叔碳，而后者的为季碳，因此更容易进行采用Dod基团的同等还原烷基化。尽管Dbs先前被报道由于其对酸解的不稳定性而用作胺-保护基团和催化氢化(Pless，J.Helv.Chim.Acta 1976，59，499-512，Hong，C.Y.；Overman，L.E.；Romero，A.Tetrahedron Lett.1997，38，8439-8442)，已经知道它对约10-20％TFA(v/v，CH₂Cl₂溶液)不稳定，该浓度对于本发明而言太高，但是对于其在整体去保护步骤中作为可裂解的肽-树脂连接试剂的常规应用是可以接受的。相对于标准仲酰胺氮保护基团，该保护基团作为暂时^αN-保护基团的用途以及该保护基团的相应的最小酸不稳定性尚未见报道，在本文中对其进行了描述。
如下面更详细的描述，Dbs基团成功地用作暂时^αN-保护基团，因为它可以通过稀TFA而轻松地脱保护，适用于Fmoc/tBu化学领域、侧链保护基团和肽-树脂连接。采用Dbs基团(通用流程)进行三步甲基化系列反应(保护、甲基化和去保护)。在实施例1中，在Arg(Pbf)Fmoc去保护后，肽-树脂可以在DIEA存在下在NMP中容易地采用Dbs-Cl进行N-烷基化。
通用流程：

该反应可以通过茚三酮实验容易地监测，发现过夜反应后反应完成(后来证明需要6小时完成反应)。还原甲基化步骤可以根据Undén的最初反应条件进行，加入THF作为共溶剂以结合硼酸盐，从而防止其在树脂内部沉淀，同时减少水含量以改善树脂膨胀。稍加改变的化学计量也可以用于使得甲基化的收率最大化，虽然如此，但是可以重复甲基化步骤以保证定量的甲基化。然后将Dbs基团采用5vol％TFA的CH₂Cl₂溶液(5×1分钟)除去，然后采用DIEA使得树脂游离，随后通过茚三酮鉴定分析。尽管伯胺和仲胺都可以与茚三酮反应，但是只有伯胺能够形成可溶性Ruhemann紫色加合物，仲胺在树脂上显示浅红色。因此，Ruhemann紫色加合物的不存在证明了甲基化反应的定量进行。
树脂上甲基化步骤后，Gln基团被偶合，树脂-结合的Fmoc-QmRY-CONH₂的样品被裂解并通过RP-HPLC分析。该产物与采用获自商业的Fmoc-MeArg(Mtr)-OH所得到的纯化的三肽具有相当的纯度，说明该甲基化的确是定量进行的，还原烷基化条件没有沉淀的盐而污染肽-树脂，这就不会阻碍随后的偶合反应的进行。然后N-末端的链装配完成，肽的纯度可以采用两种方法比较：本文中所述的树脂上的Dbs甲基化途径和采用Fmoc-MeArg(Mtr)-OH的另一种途径。裂解后，经纯化和冷冻干燥，获自Dbs/树脂上甲基化途径的粗品产物具有明显的高纯度，分离的收率约高三倍。
应用Fmoc-MeArg(Mtr)-OH的肽合成提供了复杂的混合物，难以色谱处理并且分离收率较低，特别是当目标系列产物含有Trp、Met或非天然氨基酸残基时。这些问题通常可以归因于用于Arg保护的Mtr基团的使用。因为酸更不稳定的Arg(Pbf)的使用与这些复杂性无关，采用便宜和易于获得的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，该Dbs树脂上N-甲基化方法有助于肽构建的上量放大。而且，该化学方法到目前为止是在SPPS领域中树脂上甲基化的最通用的化学方法。同样，在Boc/Bzl化学中，无法得自商业的Dod-Cl试剂可以采用得自商业的Dbs-Cl代替。在Fmoc/tBu化学领域中，该化学方法是第一个被证明可以完全适用于Arg(Pbf)的方法，也适用于并有效地促进其它氨基酸的^αN-甲基化，包括Met、Cys和Trp。然而，Dbs/树脂上甲基化化学方法可以有效地获得His(Trt)基团的侧链甲基化，这是意料之外的，Kaljuste和Undén也报道了在Boc/Bzl SPPS领域中采用His(Dnp)所获得的相同的观察。这个问题可以同样通过在His侧链上的前述侧链保护迂回，一种似乎也可以通过多种特定His侧链保护方法的使用而应用于Fmoc/tBu SPPS的策略。
具体实施方式
实施例
材料
NaCNBH₃(Aldrich cat#156159)，甲醛的37wt％(12.3M)的水溶液(Aldrich cat#252549)，5-氯代二苯并环庚烷(Dbs-Cl)(Aldrich cat#C34308)。所有的操作均于室温、压力和大气压下进行。所有的洗涤液均为200mL，搅拌时间1分钟。所有的百分比均为体积百分比％。采用的基质树脂为Polymer Labs PL-AMS树脂，1.0mmol/g。
通用方法
下列通用方法应用于除组胺酸之外的任何氨基酸的^αN-甲基化，它可以在咪唑侧链氮原子之一上进行过量的甲基化。氨基酸或肽可以通过任何本文中所定义的连接基团与任何本文中所定义的树脂连接，根据下列3个通用步骤进行末端氨基酸的^αN-甲基化：
步骤1-Dbs保护：
Fmoc去保护后，1当量的在树脂上的氨基酸或肽采用DMF适当洗涤并抽干。将5当量的Dbs-Cl溶于足量的DMF以使得树脂膨胀，向其中加入25当量的DIEA，然后将溶液加至树脂中，将其搅拌4小时。此时茚三酮为阴性。然后将该树脂洗涤(5×DMF)，将其悬浮于DMF中直到下一步骤。
步骤2-甲基化：
使用前立即制备甲基化试剂溶液，25当量的甲醛在约3∶1∶0.05的NMP/THF/AcOH中。
将得自步骤1的树脂抽干，然后加入上述甲基化试剂溶液。然后将树脂搅拌数分钟以形成甲基亚胺。然后将10当量的NaCNBH₃通过粉末漏斗加至搅拌的肽树脂中，搅拌数小时，然后将其抽干，用DMF洗涤，将其悬浮于DMF中直到下一步骤。
步骤3-Dbs去保护：
将得自步骤2的树脂抽干，用CH₂Cl₂洗涤以除去树脂中痕量的DMF，再次抽干。然后将树脂分批采用5％的TFA在CH₂Cl₂中搅拌处理，用CH₂Cl₂和DMF洗涤，可以用于随后的通过DIC/HOAt化学进行的偶合反应。
实施例1
步骤1-Dbs保护：
Fmoc去保护后获得0.01mol H₂N-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Rink-Ahx-树脂，将该树脂适当洗涤(2×DMF，2×CH₂Cl₂，2×DMF)并抽干。将0.05molDbs-Cl溶于150mL DMF，向其中加入50mL 1∶1的DIEA∶甲苯。然后将该溶液加至上述树脂中，随后将其搅拌4小时。此时茚三酮为阴性。然后将该树脂洗涤(5×DMF)，将其悬浮于DMF中用于下一步骤。
2-甲基化：
下列甲基化试剂溶液在使用前立即制备：300mL NMP，80mL THF，20mL甲醛溶液(0.246mol)，4mL乙酸。
将得自步骤1的树脂抽干，然后加入上述甲基化试剂溶液。然后将该树脂搅拌15分钟形成甲基亚胺。然后称重0.1mol(6.2g)NaCNBH₃，通过粉末漏斗将其一次性加入搅拌的肽树脂中，如果需要可以加入最小(10-20mL)量的NMP。将该树脂搅拌6小时，然后将其抽干，洗涤(5×DMF)，再次抽干，整个甲基化过程采用新鲜的混合物重复一次，这次过夜(～18小时)。然后将树脂抽干，洗涤(5×DMF)，将其悬浮于DMF用于下一步骤。
步骤3-Dbs去保护：
将获自步骤2的树脂抽干并洗涤(5×CH₂Cl₂)以除去树脂中痕量的DMF，然后再次抽干。随后将树脂分批采用5％的TFA的CH₂Cl₂溶液搅拌处理(5×1分钟)。然后将树脂洗涤(2×CH₂Cl₂，2×DMF)，随后通过DIC/HOAt化学方法采用自动化循环(自Fmoc去保护开始)进行随后的偶合，在此情况下没有必要，因为哌啶处理通常用于将N-末端释放为游离碱。
为了清楚和理解的目的，前面已经通过说明和实施例对本发明进行了详细地阐述。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在本发明权利要求的范围内可以进行改变和修饰。因此，可以理解，上述说明是用于说明而非用于限定。因此，本发明的范围不是由上述说明限定，而是由权利要求书以及该权利要求书的等同范围限定。