ACYWSUB135/SUB群脑膜炎球菌多糖B型流感嗜血杆菌结合疫苗.pdf

本发明提供一种ACY W135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACY W135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACY W135群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打五针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。

1、  一种ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品含以下组分及含量：
A群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
C群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
Y群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
W135群脑膜炎球菌多糖疫苗：     50μg
b型流感嗜血杆菌结合疫苗：      10μg
乳糖：                         2.5～3.0mg。

2、  权利要求1所述联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
1)菌种的的选用：选用ACYW135群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备；
2)生产用种子
启开工作种子批菌种，经传代检定合格后，接种于综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子；
3)生产用培养基
采用综合培养基或经批准的其他适宜培养基，培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分；
4)培养
采用培养罐液体培养；在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃；
5)收获和杀菌
于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养；取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌；以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜；
6)去核酸
将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；
7)沉淀多糖
于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化；
8)多糖纯化
将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；提取过程应在15℃以下进行；
9)内毒素去除
取A、C、W₁₃₅、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量；
10)半成品配制及分装
将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检；
11)冻干
将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗成品。

ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗
技术领域：
本发明提供了一种ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用于脑脊髓膜炎重要疫病的免疫预防，属于疫苗生产制备技术领域。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎(流脑)主要发病人群是婴幼儿，ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗主要用于儿童尤其是婴幼儿预防使用，二十世纪八十年代，随着流脑多糖疫苗开发成功和纳入计划免疫，全球范围内接种人数逐年上升。我国的流脑发病以A群为主，因此开发的疫苗均为A群或A+C群双价疫苗，但是2000年在贵州、2004年在河北分别爆发了流脑，引起当地的恐慌，经流行病学调查证明，引起流行的是C群菌株，而在部分地区曾经分离到W₁₃₅群和Y群，尽管尚未引起流行，但也引起了疾病控制部门的重视。
b型流感嗜血杆菌(Hib)通过飞沫传播感染，引起五岁以下儿童鼻咽炎、会咽炎等原发性疾病；细菌从局部进入血液或通过血脑屏障，引起肺炎、化脓性脑膜炎、关节炎、骨髓炎、心包炎和败血症等严重的侵袭性疾病。
鉴于ACY W₁₃₅群脑膜炎球和b型流感嗜血杆菌引起疾病的严重性和疫苗的有效性，研发该疫苗具有极其重要的意义。在目前已使用Hib疫苗的38个国家中，其免疫程序遵照的原则是：1)在出生后2-6月龄之间完成基础免疫程序，每剂注射间隔至少1个月；2)出生后12-24个月之间可以进行一次加强免疫。遵照这一原则，ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-Hib联合疫苗可用于流脑多糖、Hib结合苗免疫后的加强免疫。接种该疫苗可同时预防ACYW₁₃₅群引起的流行性脑脊髓膜炎及Hib导致的疾病。
本发明的目标是开发一种能提高疫苗覆盖率、减少儿童免疫次数及保护效果更佳的联合疫苗。
发明内容
本发明提供一种ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，具有一针多种免疫的功能。
本发明还提供了上述疫苗的生产工艺。
本发明的ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量：
A群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
C群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
Y群脑膜炎球菌多糖疫苗：        50μg
W135群脑膜炎球菌多糖疫苗：     50μg
b型流感嗜血杆菌结合疫苗：      10μg
乳糖：                         2.5～3.0mg。
本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
1.菌种的选用：选用ACYW135群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备。
2.生产用种子
启开工作种子批菌种，经传代检定合格后，接种于综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子。
3.生产用培养基
采用综合培养基，培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。
4.培养
采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
5.收获和杀菌
于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
6.去核酸
将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。
7.沉淀多糖
于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化。
8.多糖纯化
将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
9.内毒素去除
取A、C、W₁₃₅、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
10.半成品配制及分装
将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
11.冻干
将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
12.成品检定
根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
本发明的培养基不含有马血清或其他致敏物质；不含有能与cetavlon形成沉淀的成分或有害物质；培养基适于脑膜炎球菌繁殖生长，并适于产生丰厚的荚膜多糖物质；常用酸水解酪蛋白做基础液，加入酵母透析液、硫酸镁、葡萄糖等制成半综合培养基。
美国则采用Frantz培养基，pH7.4～7.6。
本发明与WHO规程有几点不同：
①细菌培养时间不通，WHO规程培养10-12h，国内只培养6-8h；②WHO规程对中间产品进行冻干，国内则放低温(-20℃)保存；我国ACYW135群流脑多糖疫苗质量控制指标与WHO规程比较见表41-5：
表41-5：本发明疫苗规程质控指标与WHO规程比较

本发明采用ACYW₁₃₅群脑膜炎奈瑟氏双球菌、b型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化后，将ACYW₁₃₅群脑膜炎多糖原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按一定比例混合，再加入适宜稳定剂冻干制成，用于预防ACYW₁₃₅群引起的流行性脑脊髓膜炎及Hib导致的疾病。
本发明的积极效果在于：运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打五针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。
具体实施方式：
实施例1：
200901批ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W₁₃₅群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35-37℃二氧化碳的环境中培养16-20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取A、C、W₁₃₅、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6、半成品配制及分装
将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
7、冻干
将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例2：
200902批ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W₁₃₅群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35-37℃二氧化碳的环境中培养16-20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取AC₅Y W₁₃群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6.半成品配制及分装
将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
7、冻干
将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例3：
200903批ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备
1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W₁₃₅群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35-37℃二氧化碳的环境中培养16-20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。
3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2-8℃静置1-3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在-20℃以下，待纯化。
4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。
5、内毒素去除
取AC₅Y W₁₃群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。
6.半成品配制及分装
将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。
7、冻干
将ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为：-35℃预冻2小时，制品-40℃冷冻4～5小时，逐渐升温真空干燥10～12小时，30℃以下恒温真空干燥5～6小时，全过程累计20～24小时，制备出冻干ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
试验例1
1、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗进行检定，以保证制品的安全性。
ACY W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗质量标准：根据WHO《生物制品规程》