一种特异性阻断PKCΑ信号传递的SIRNA及其应用.pdf

本发明公开了一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，所述siRNA为以下针对人PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反义链：5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正义链：5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反义链：5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正义链：5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反义链：5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA为以下针对小鼠PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反义链：5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正义链：5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反义链：5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正义链：5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反义链：5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′，siRNA-PKCα特异性针对PKCα亚型，为治疗这类严重的致盲性眼病提供了一种新的药物特异性干预靶点的基因药物。

1.  一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，其特征在于：所述siRNA为以下针对人PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反义链：5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正义链：5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反义链：5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正义链：5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反义链：5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA为以下针对小鼠PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反义链：5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正义链：5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反义链：5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正义链：5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反义链：5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′。

2.  根据权利要求1所述的特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，其特征在于：所述双链RNA分子的3′末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基。

3.  根据权利要求2所述的特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，其特征在于：所述双链RNA分子为正义链：5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA dAdT-3′，反义链：5′UUUCAUACAACAGGACGCC dAdT-3′。

4.  根据权利要求1所述的特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，其特征在于：所述针对人PKCα的siRNA的浓度为50-300nM，或所述针对小鼠PKCα的siRNA的浓度为100-300nM。

5.  权利要求1-4任一项所述的siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用。

6.  根据权利要求5所述的siRNA的应用，其特征在于：所述眼病理增生性疾病为增生性玻璃体视网膜病变、外伤性增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变或青光眼术后滤过泡瘢痕化。

一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物靶点药物及其应用，具体地说，涉及一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA及其在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用。
背景技术
眼病理增生性疾病包括增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、外伤性增生性玻璃体视网膜病变(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变(PDR)和青光眼术后滤过泡瘢痕化等。它们共同的病理特征是眼内细胞的过度增生导致的瘢痕化，引起视网膜脱离和堵塞滤过泡，是一组严重的致盲性眼病，是在细胞和分子水平上，由多种细胞和体液因素形成复杂的网络关系，进而调控眼内以视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞为主，还包括胶质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等的过度增生反应。
目前的治疗药物，如用糖皮质激素抑制炎症过程，用抗代谢药抑制细胞增殖过程，这些药物均是抗肿瘤的细胞毒性药物，包括5-FU(5-fluorouracil，5-FU)，道诺霉素或称柔红霉素(daunorubicin or daunomycin)、秋水仙缄(colchicine)和丝裂霉素等。然而这些药物都存在药效较弱、毒性较大等问题，并且缺乏对照的前瞻研究。因此需要寻找一些更安全、更有效的药物来防治这类疾病。
研究这类疾病复杂网络中的某一因子或某一细胞的阻断可能比较困难，对这些复杂因素作用细胞的下游汇合处的信号调控进行研究也许更有效。而蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是转导细胞外信号到细胞内反应的细胞内酶家族，广泛参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增生、分化及癌变等一系列与生命现象有关的过程，是理想的信号阻断靶点。
国内外诸多研究显示，在PVR发生中，RPE细胞的增生(proliferation)、移行(migration)、吞噬(phagocytosis)和胶原纤维收缩(gel contraction)等行为与RPE细胞自身的PKC有非常重要的关系。这些结果提示我们要研究致病因素作用RPE细胞后，产生的PKC信号是如何调控细胞并导致其行为失常的。本发明的发明人应用PKC的特异性抑制剂首次在国内外发现它通过抑制RPE细胞的钙离子内流，来抑制PVR的发生(Ophthalmic Res.2005.37：128-35)，应用PKC特异性抑制剂金丝桃素可以有效抑制兔实验性PVR的发生(高前应，惠延年，王雨生.金丝桃素抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变，眼科学报，2002，18(4)：240-245)。从细胞、蛋白和基因水平确定了在PKC的12种亚型中，有10种PKC亚型在RPE细胞表达，且主要分布在细胞浆中。
PKC在成纤维细胞、胶质细胞和血管内皮细胞中也有广泛表达，研究显示应用PKC抑制剂也可以阻断这类细胞的增生，对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变(PDR)和青光眼术后滤过泡瘢痕化等眼病理增生性疾病具有防治作用。
但若从PKC水平阻断生物信号传递，PKC所有亚型的信号传递都会被阻断，影响细胞的生理功能。
aprinocarsen(ISIS 3521)是一种专一抑制靶向PKCα的mRNA的反义寡核苷酸，可以抑制肿瘤细胞的异常增生和诱导肿瘤细胞凋亡，主要用于恶性肿瘤病人，如非小细胞(型)肺癌、卵巢癌等患者，目前处于临床试验阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子siRNA，该siRNA可特异性地阻断PKCα亚型的信号传递。
为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，所述siRNA为以下针对人PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反义链5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正义链：5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反义链：5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正义链：5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反义链：5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA为以下针对小鼠PKCα的双链RNA分子中的任意一种：正义链：5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反义链：5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正义链：5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反义链：5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正义链：5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反义链：5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′。
优选地，所述双链RNA分子3′末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基(Over-hang)，以增加siRNA的稳定性。
优选地，所述双链RNA分子为正义链：5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA dAdT-3′，反义链：5′UUUCAUACAACAGGACG CC dAdT-3′。
本发明的另一目的是提供该siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用，该siRNA能有效阻断眼病理增生性疾病，为这类严重的致盲性眼病提供一个新的特异性生物治疗靶点和干预方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
特异性阻断PKCα信号传递的siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用，所述眼病理增生性疾病为增生性玻璃体视网膜病变、外伤性增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变和青光眼术后滤过泡瘢痕化等眼病理增生性疾病。
本发明siRNA可以制成眼科用滴眼液、注射液等不同剂型。
本发明的发明人应用分子生物学技术研究体外人RPE细胞周期的多种因子和PKC亚型的关系，发现只有PKCα通过下调p27^Kip1调控RPE细胞的增生和PVR的形成，在PVR发生中起着关键作用。PKCα能调控RPE细胞周期的G1/S转折点，即能控制细胞从静止状态(G1期)进入DNA合成期(S期)，也称为限制点(restriction point)，是细胞能否越过静止期进入细胞增生的关键点。参与调控的是细胞周期素(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependentkinases，CDKs)形成的复合物Cdk2-CyclinE或Cdk2-CyclinA，而细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs)主要是p27^Kip1。
本发明具有以下有益效果：
1)siRNA-PKCα特异性针对PKCα亚型，在阻断PKCα的同时，并不会引起PKC其它亚型的信号传递阻断而影响细胞的生理功能，从而为治疗这类严重的致盲性眼病提供了一种新的药物特异性干预靶点的基因药物；
2)首次应用PKCα信号特异性抑制剂siRNA-PKCα阻断眼病理增生性疾病，效果显著，且没有目前所用药物的副作用。
附图说明
图1为小鼠眼球HE染色比较；
其中A：正常小鼠眼球；B：阴性对照组(Notarget siRNA)；C：50nM浓度组；D：100nM浓度组；E：150nM浓度组；F：200nM浓度组；G：300nM浓度组；
图2为小鼠PVR的发生率；
其中contrast：阴性对照组(Notarget siRNA)；1：50nM浓度组；2：100nM浓度组；3：150nM浓度组；4：200nM浓度组；5：300nM浓度组；
图3为RPE细胞接受各种处理24小时后的RT-PCR结果图；
图4为P27^kip1接受PMA和Thy处理0-24小时的mRNA(A)和蛋白(B)的表达情况；
图5为RPE细胞接受各种处理后PKCα的mRNA表达情况；
图6为各种处理对RPE细胞增殖的影响图；
图7为Western blot法检测各处理组RPE细胞中PKCα蛋白的表达量。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明。
实施例1：利用小鼠siRNA治疗小鼠PVR
1、试验模型：小鼠PVR模型(C57BL/6小鼠，购自南方医科大学实验动物中心)
本实验选择5-6周的SPF级C57BL/6小鼠共36只，按照Frenzel等(Frenzel EM，Neely KA，Walsh AW，et al.A new model of proliferative vitreoretinopathy，Invest Ophthalmol Vis Sci.1998Oct；39(11)：2157-2164)的方法，在无需进行玻璃体切割、视网膜切开或冷冻的条件下用10μL的微量进样器于小鼠右眼角巩膜缘后3mm向玻璃体腔注射2μL(0.2u/μL)的dispase(中性蛋白酶，GIBCO公司)，一般4～8周时即有明显的PVR形成，形成了小鼠PVR模型。
2、PKCα siRNA的设计与合成
首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取小鼠PKCα mRNA的序列全长，设计三条PKCα-siRNA和一条阴性对照siRNA(Notarget siRNA)。此外，设计了dTdT两个碱基的悬挂末端，以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。将合成的siRNA粉末用无RNA酶的ddH₂O溶解，配制成20μM的siRNA母液于-20℃保存备用。
表1小鼠PKCα-siRNA及阴性对照Notarget siRNA

3、试验方法
将36只C57BL/6小鼠随机分为6组，每组6只，A组为阴性对照组(Notarget siRNA)，1-5组为实验组，分别代表PKCα siRNA4终浓度为50nM(1组)、100nM(2组)、150nM(3组)、200nM(4组)和300nM(5组)。
小鼠玻璃体腔注射dispase 1周后使用水合三氯乙醛(4.3％)麻醉小鼠，用复方托吡卡胺滴眼液散大小鼠瞳孔，在手术显微镜下，用10μL的微量进样器沿小鼠角巩缘进针，抵达视神经乳头表面，在玻璃体腔内注射2μL的药物。其中阴性对照组注射2μL浓度为500nM的NotargetsiRNA，眼内终浓度为100nM，实验组分别注射2μL浓度为250nM、500nM、750nM、1000nM、1500nM的PKCα siRNA4，眼内终浓度分别为50nM(1组)、100nM(2组)、150nM(3组)、200nM(4组)、300nM(5组)。
玻璃体腔注射药物后，使用CUY21EDIT多功能活体电转化仪，进行活体电转染。使用前检查仪器，测量空气电阻，设置参数(Resistance：0.8-1.5kohm；Volt：80-100V；Pon：50msec；Poff：950msec；Number：5；Ampere：0.08-0.15A)。将小鼠两眼涂上羟丙基甲基纤维素滴眼液，然后用电极(CUY650P7)贴紧角膜，然后按下Start，开始进行转染。
电转染后连续观察4周，颈椎脱臼法处死小鼠，收集标本。用眼科弯镊摘取小鼠双侧眼球，去除球外组织，用OCT包埋眼球，制作冰冻切片并进行常规HE染色和免疫组化检测。
4、试验结果
A.眼球结构变化
药物作用4周后，将小鼠眼球冰冻切片后进行HE染色。图1结果表明，阴性对照组和实验组50nM浓度组：6眼球视网膜全脱离，视网膜基本结构发生改变；实验组100nM组、150nM组、200nM浓度组：有4眼发生视网膜脱落，2眼未发生视网膜脱落，且眼球基本结构完好；实验组300nM浓度组：有3眼发生视网膜脱落，3眼未发生视网膜脱落，且眼球结构完好，说明100nM-300nM的PKCα siRNA对PVR的发生有一定的抑制作用。
B.PVR发生率
如图2所示，阴性对照组和实验组50nM浓度组视网膜严重脱离，PVR发生率为100％，实验组100nM组、150nM组、200nM组，PVR发生率均为66.7％，300nM组PVR发生率为50％。
C.免疫荧光检测
1)RPE细胞、Müller细胞表达
通过免疫荧光检测RPE细胞的标志性蛋白RPE65，和Müller细胞的标志性蛋白GS的表达分布，结果表明：正常小鼠视网膜中可见RPE细胞和Müller细胞呈弱阳性表达，阴性对照组、50nM浓度组、100nM浓度组、150nM浓度组脱落的视网膜组织RPE细胞和Muller细胞呈强阳性表达，200nM组和300nM组脱落的视网膜组织RPE细胞和Müller细胞呈弱阳性表达。实验组中随着siRNA浓度的升高，RPE细胞和Müller细胞表达明显减少。
2)成纤维细胞、星型胶质细胞表达
通过免疫荧光检测成纤维细胞的标志性蛋白α-SMA，和星型胶质细胞的标志性蛋白GFAP的表达分布，结果表明：正常小鼠视网膜中可见成纤维细胞、星型胶质细胞呈弱阳性表达，阴性对照组、50nM浓度组、100nM浓度组、150nM浓度组脱落的视网膜组织成纤维细胞、星型胶质细胞呈强阳性表达，200nM组和300nM组成纤维细胞、星型胶质细胞呈弱阳性表达。实验组中随着siRNA浓度的升高，成纤维细胞和星型胶质细胞表达明显减少。
利用小鼠siRNA治疗小鼠PVR，结果表明PKCα siRNA能够抑制PVR的发生，100-300nM的siRNA对PVR的发生有一定的抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显；siRNA通过抑制与眼病理增生性疾病相关的细胞的表达来抑制PVR的发生，随着siRNA浓度的升高，RPE细胞、Müller细胞、成纤维细胞和星型胶质细胞表达明显减少。
实施例2：利用人siRNA抑制RPE细胞的增殖
1、实验细胞
RPE细胞：在中山眼科中心眼库中取捐献者死后24小时内的眼球，在无菌条件下自赤道布环形切开眼球，弃去眼前节，清除玻璃体，分离视网膜神经上皮层，将后节眼杯置于眼球托上，将质量百分比为0.25％的胰酶加入眼杯，37℃孵育消化约10分钟后用吸管轻轻吹打，使RPE细胞脱落，将含RPE细胞的消化液移入预加有含质量百分含量为20％的胎牛血清和1％的抗生素的DMEM中，终止胰酶作用。离心、漂洗后用含质量百分含量为20％的胎牛血清和1％的抗生素的DMEM制成浓度为2×10⁴cell/ml RPE细胞悬液，用于接种培养。
2、PKCα siRNA的设计与合成
首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人PKCα mRNA的序列全长，设计三条PKCα siRNA和一条阴性对照siRNA(Notarget siRNA)。此外，设计了两个碱基的悬挂末端，以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。将合成的siRNA粉末用无RNA酶的ddH₂O溶解，配制成20μM的siRNA母液于-20℃保存备用。
表2人PKCα-siRNA及阴性对照Notarget siRNA

3、实验方法
(1)细胞培养
将RPE细胞悬液接种于6孔培养板，当细胞融合率达50％时，去除原培养基，每孔加入2ml含质量百分含量为20％的胎牛血清的无抗生素的DMEM培养基。
(2)制备转染复合物
取60μl浓度为2mg/ml的脂质体LipofectAMINE2000，加入300μl DMEM混匀，室温下静置5分钟得A液；分别取180μl浓度为100nM的PKCα siRNA3和Notarget siRNA，各加300μl DMEM混匀得B液，将A液与B液混合，轻轻地颠倒混匀，不要震荡，室温下温育20分钟，形成siRNA-LipofectAMINE2000和Notarget siRNA-LipofectAMINE2000的转染复合物。
(3)转染
当细胞融合率达60％时，进行转染处理。各组每个孔内均加入1ml对应的液体，前后轻柔推摇培养板以混匀液体，将培养板送入细胞培养箱常规培养。每个组设置5个重复。
siRNA组：siRNA-LipofectAMINE2000转染复合物；
阴性对照组：Notarget siRNA-LipofectAMINE2000转染复合物；
Thy组：含thymeleatoxin(一种特异性激活PKCα的化学物质)的培养基，终浓度为100nM；
Control组：空白对照组。
4、实验结果
RT-PCR结果显示：细胞接受siRNA、Thy(100nM)或PMA(100nM)处理24小时后，在主要细胞周期调节因子中，只有p27^kip1 mRNA的表达量发生了变化，提示细胞周期抑制性蛋白P27^kip1是PKCα促人RPE增殖相关的细胞周期相关蛋白(图3)。P27^kip1蛋白分别在1小时(PMA)和3小时(Thy)明显下降(图4)。
RPE细胞在接受各种处理3小时后，测定PKCα mRNA的表达情况，结果表明，Thy和PMA作用RPE细胞后，PKCα mRNA的表达量增加，siRNA作用RPE细胞后，PKCα mRNA的表达量下降(图5)。
转染2天后，每个处理组均取3孔细胞，采用细胞计数板法分别计数并计算平均数，其余2孔提蛋白做Western blot检测靶蛋白PKCα的表达。
与Control组相比，siRNA组的RPE细胞数明显减少，表明siRNA能显著抑制RPE细胞的增殖，抑制效率达到39.9％(图6)。
不同处理组中的β-Actin条带亮度几乎无差异，说明总蛋白量基本一致，Control组的PKCα蛋白表达有明显条带，而转染了PKCα siRNA3的细胞几乎检测不到PKCα蛋白的表达，实验结果进一步证实了PKCα siRNA在蛋白水平对靶基因表达的抑制及作用的特异性(图7)。
本发明的siRNA均能不同程度下调PKCα的mRNA水平从而抑制RPE细胞的增殖，其中以50-300nM浓度效果最佳，以PKCα siRNA3的抑制作用最明显。在人RPE细胞转染了100nM的siRNA3后，细胞增殖的抑制效率为39.9％，且此浓度的siRNA对RPE细胞的形态无影响。
序列表
<110>中山大学中山眼科中心
<120>一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA及其应用
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
cgacgacugu cuguagaaa                            19
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
uuucuacaga cagucgucg                            19
<210>3
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
ggaugguaca aguugcuua                            19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
uaagcaacuu guaccaucc                            19
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cuuuccucga accuuaucu                         19
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