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1、10申请公布号CN104043099A43申请公布日20140917CN104043099A21申请号201410255461322申请日20140610A61K38/01200601A61K35/30200601A61K9/08200601A61K47/34200601A61P3/02200601A61P25/00200601A61P9/1020060171申请人广州一品红制药有限公司地址510000广东省广州市广州经济技术开发区东博路6号自编一栋72发明人张莉李捍雄74专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理事务所普通合伙11411代理人颜春艳54发明名称一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法57。
2、摘要本发明提供了一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法，取猪脑，去杂，加纯化水匀浆；匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；清液调节PH至173，加热至100110，保温1545MIN，然后调PH至8090；810KD膜超滤，收集滤液；滤液上柱层析，收集洗脱液，调PH至8090，阴离子交换膜浓缩，02M膜过滤得原液；原液冻结，然后解冻，加抗氧化剂，调PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤。所得脑蛋白水解物注射液中多肽与对照品相似090，含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例85，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，稳定安全。51INTCL权利要求书2页说明书7页附图4页。
3、19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页附图4页10申请公布号CN104043099ACN104043099A1/2页21一种脑蛋白水解物注射液，其特征在于，所述脑蛋白水解物注射液中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697200602中的小分子多肽的相似度90；所述脑蛋白水解物注射液含有16种游离氨基酸门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；所述脑蛋白水解物注射液中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物注射液的总氮量的85以上。2根据权利要求1所述脑蛋白水解物注射液，其。
4、特征在于，所述脑蛋白水解物注射液采用下述步骤制备而成1取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆；2将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；3将步骤2得到的清液调节PH至173，加热至100110，保温1545MIN，然后调节PH至8090；4冷处理，取清液，810KD膜超滤，收集滤液；5将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，阴离子交换膜浓缩，02M膜过滤得原液；6将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为001005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，既得。3根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注。
5、射液，其特征在于，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。4根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注射液，其特征在于，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。5根据权利要求2所述的脑蛋白水解物注射液，其特征在于，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为AMBERLITEIRA200，所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS8040C离子膜。6一种脑蛋白水解物注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，取检验合格猪脑，去杂，加纯化水匀浆；步骤2，将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；步骤3，将步骤2得到的清液调。
6、节PH至173，加热至100110，保温1545MIN，然后调节PH至8090；步骤4，冷处理，取清液，810KD膜超滤，收集滤液；步骤5，将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，阴离子交换膜浓缩，02M膜过滤得原液；步骤6，将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为001005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤。7根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。8根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤7灌装，100120灭菌，检漏。9根据权。
7、利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸权利要求书CN104043099A2/2页3钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。10根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为AMBERLITEIRA200，阴离子交换膜采用美国进口膜DUS8040C离子膜。权利要求书CN104043099A1/7页4一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法。背景技术0002脑蛋白水解物注射液产品是由原材料经检验、检疫合格，提取，精制，灭菌等生产工艺制。
8、备得到；脑蛋白水解物的主要成分是低分子肽和游离氨基酸。易通过血脑屏障进入脑神经细胞，低分子肽具有与天然存在的神经营养因子相同的作用，能诱导神经元分化、维持正常神经细胞的功能、增加神经递质的产生和突触传递，保护神经细胞免受各种损害，调节人体脑代谢、神经传递及神经生长；能提高葡萄糖分解酶活性，增加脑对葡萄糖的无氧能量代谢，降低脑内乳酸的浓度，在缺血缺氧时对神经细胞的线粒体有保护作用。0003脑蛋白水解物注射液上世纪由奥地利EBEWE药厂进口注册，到2010年底，已有公开的涉及脑蛋白水解物制剂及工艺的专利申请29件。0004例如中国发明专利文献CN011305231公开了一种脑蛋白水解物注射液生产工。
9、艺新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，匀浆，双层纱布过滤，胃蛋白酶水解，加胰酶水解，加盐酸调PH值2530，2010下静置1030小时；室温，双层纱布过滤，加水，调PH值到中性，微孔滤膜过滤澄清，超滤膜超滤，超滤膜进行浓缩，浓缩液加热沸腾15分钟，然后迅速冷却，再微孔滤膜和超滤膜，得到的超滤液，再经121蒸汽灭菌；根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准编号WS1XG252000计算需要添加的氨基酸用量，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配装针成成品药液，灭菌成无菌制剂。又如CN1857711A公开了一种脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法将猪脑匀浆，胃蛋白酶、胰酶水解，。
10、上羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化，调配肽图，收集目标物，采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，进行定氮、氨基酸分析，添加相应氨基酸配制成浓配液，滤膜过滤，即得。现有的制备工艺在生产制剂时需要额外添加相应氨基酸才能制得符合标准的脑蛋白水解物，而根据国家食品药品监督管理局2008年734号关文件要求，脑蛋白水解物不得添加外源性氨基酸。因而我们需要进行不添加外源性氨基酸的脑蛋白水解物的制备方法的研究。发明内容0005本发明的目的在于克服现有脑蛋白水解物制备技术中需要额外添加相应氨基酸的缺陷，提供一种脑蛋白水解物注射液及其制备方法，采用该制备方法制备的脑蛋白水解物注射液中小分子肽反相肽图色谱鉴别与对。
11、照品相似度090，无需补充添加外源性氨基酸，完全依靠猪脑水解制得。0006本发明的第一个方面是提供一种脑蛋白水解物注射液，所述脑蛋白水解物注射液中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697200602中的小分子多肽的相似度90；所述脑蛋白水解物注射液含有16种游离氨基酸门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、说明书CN104043099A2/7页5脯氨酸；所述脑蛋白水解物注射液中总的氨基酸的氮含量占所述脑蛋白水解物注射液的总氮量的85以上。0007优选地，所述脑蛋白水解物注射液采用下述步骤制备而成00081取。
12、检验合格猪脑，去杂去除血管、脂肪等杂质，加纯化水匀浆；00092将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；00103将步骤2得到的清液调节PH至173，加热至100110，保温1545MIN优选为2040MIN，更优选为2535MIN，然后调节PH至8090；00114冷处理，取清液，810KD膜超滤，收集滤液；00125将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，阴离子交换膜浓缩，02M膜过滤得原液；00136将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为001005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜。
13、过滤，既得。0014其中，步骤4中所述冷处理，是指将液体冷却到10以下。0015优选地，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。0016进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤将匀浆液与7585下保温1530MIN。0017优选地，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。0018优选地，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为AMBERLITEIRA200。0019优选地，步骤5中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS8040C离子膜孔径0001M。0020优选地，步骤2具体为调节PH至1730，加入胃蛋白酶水解，胃蛋白。
14、酶水解于3545下进行，保温35H，然后调节PH至7278，加入胰酶水解，胰酶水解于3545下进行，保温24H，灭活酶，终止水解，收集清液。0021其中，步骤2中收集清液可以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。0022本发明的第二个方面是提供一种脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤0023步骤1，取检验合格猪脑，去杂去除血管、脂肪等杂质，加纯化水匀浆；0024步骤2，将步骤1得到的匀浆液先后经胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；0025步骤3，将步骤2得到的清液调节PH至173，加热至100110，保温1545MIN优选为2040MIN，更优选为2535MIN，然后调节PH至8090；002。
15、6步骤4，冷处理，取清液，810KD膜超滤，收集滤液；0027步骤5，将步骤4得到的滤液上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，阴离子交换膜浓缩，02M膜过滤得原液；0028步骤6，将步骤5得到的原液冻结，然后解冻，加入抗氧化剂，控制抗氧化剂的含量为001005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤。0029其中，步骤4中所述冷处理，是指将液体冷却到10以下。0030优选地，在步骤1之后，进行步骤2之前，将匀浆液加热使蛋白质变性。0031进一步优选地，使蛋白质变性具体可采用下述步骤将匀浆液于7585下保温说明书CN104043099A3/7页61530。
16、MIN。0032优选地，所述制备方法还包括步骤7灌装，100120灭菌，检漏。0033优选地，步骤6中所述的抗氧化剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或叔丁基对羟基茴香醚。0034优选地，步骤5中上柱层析所使用的层析填料为AMBERLITEIRA200。0035优选地，步骤5中所述阴离子交换膜采用美国进口膜DUS8040C离子膜。0036优选地，步骤2具体为调节PH至1730，加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解于3545下进行，保温35H，然后调节PH至7278，加入胰酶水解，胰酶水解于3545下进行，保温24H，灭活酶，终止水解，收集清液。0037其中，步骤2中收集清液可。
17、以通过过滤、离心等本领域已知的方式实现。与现有技术相比，本发明制备工艺具有如下优点00381、本发明在胃蛋白酶、胰酶水解成多肽与游离氨基酸的清液后，调PH至1730，100110加热30分钟，可防止水解液中游离氨基酸再次结合成肽键，形成短肽，同时可以灭活人畜共患病毒，比现有专利更合理，防止多肽与游离氨基酸可逆结合和灭活人畜共患病毒在双酶水解后进行，属于末端控制，无其它生物材料加入，更安全；00392、采用AMBERLITEIRA200交换填料可大大改善现有阴离子交换不能吸附全部氨基酸的问题；00403、采用阴离子交换膜，在PH8090溶液中，氨基酸带负电荷，与膜表面电荷相互排斥，游离氨基酸和多。
18、肽被截留；阳离子交换膜优选美国进口膜DUS8040C离子膜，孔径为0001UM，孔径50D分子量，游离氨基酸可进一步被截留；00414、本发明工艺中采用了2次超滤，2次过滤，最大限度降低大分子致敏物质、保证了不溶性微粒和无菌保证值SAL；00425、本发明工艺中采用超滤后冻结，超滤去除大分子后冻结可减少氨基酸析出，冻结后解冻可以进一步去除少量杂质；00436、本发明提供的脑蛋白水解物注射液中小分子肽反相肽图色谱鉴别与脑蛋白水解物140697200602的相似度090；含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例85，含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸。
19、、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸等16种氨基酸。0044本发明工艺简单，制得的脑蛋白水解物注射液中小分子多肽与16种游离氨基酸含量恒定，所得脑蛋白水解物注射液中多肽与对照品相似090，含有16种氨基酸，总氨基酸的氮量占总氮含量比例85，无需额外补充添加氨基酸，完全依靠猪脑水解制得，药效稳定，更安全；注射液为最终可灭菌注射剂，SAL保证值更高，安瓿封装，更密封，提高用药安全。附图说明0045图1为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液与中检所脑蛋白水解物140697200602的指纹图谱；0046图2为中检所脑蛋白水解物140697200602的16种氨基酸高效液相图。
20、谱；0047图3为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液的游离氨基酸高效液相图谱；说明书CN104043099A4/7页70048图4为本发明实施例1提供的脑蛋白水解物注射液的总氨基酸高效液相图谱；0049图5为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液与中检所脑蛋白水解物140697200602的指纹图谱；0050图6为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液的游离氨基酸高效液相图谱；0051图7为本发明实施例2提供的脑蛋白水解物注射液的总氨基酸高效液相图谱。具体实施方式0052下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明做进一步的描述，以更好地理解本发明。0053实施例10054脑组织检疫合格去除血。
21、管、脂肪等杂质后取100KG，加1倍体积纯化水匀浆，于82保温15分钟，冷却；盐酸调PH18，胃蛋白酶水解，42保温3小时，氢氧化钠调PH76，胰酶水解，42保温2小时，离心收集清液；盐酸调PH2，105下保温30分钟，然后氢氧化钠调PH88；冷处理，抽取上清液，10KD膜超滤去除大分子，收集滤液100L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，用DUS8040C离子膜浓缩至50L，02M膜过滤，得原液，15以下冻结保存；原液解冻，调配，加入亚硫酸氢钠001WT，调节PH6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，灌装；115，30分钟，检漏等，制备得到5ML规格小容量注。
22、射液。0055相似度测定0056对照品为中检所脑蛋白水解物140697200602。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂250MM4MM，粒径5M；以01三氟醋酸溶液为流动相A；以0085三氟醋酸乙腈溶液01三氟醋酸溶液8020为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟08ML；检测波长为276NM。柱温40；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，结果如图1和表2所示。0057表1相似度测定中的梯度洗脱表0058时间分钟流动相A流动相B010004050504501005301005510006510000059表2实施例1指纹图谱相似度评价结果0060说明书CN104043099A5/7页8S1。
23、S2对照指纹图谱S1109510971S2095110997对照指纹图谱0971099710061由图1和表2可知，本实施例提供的5ML规格小容量注射液中的小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697200602的相似度为0951，符合质量控制要求090。0062氨基酸测定0063对照品为中检所脑蛋白水解物140697200602。ACCQTAG方法，4UMNORAPAKTMC1839150MM柱，流动相A为PH50、01MOL/L，醋酸磷酸盐缓冲液；流动相B为60HPLC级乙腈，按表3进行梯度洗脱；使用ACCQFLUOR衍生剂柱前衍生，UV检测波长为248NM，流速为每分钟1ML，柱温为37。。
24、检测结果如图2、3和4所示。0064表3氨基酸测定中的梯度洗脱表0065时间MIN流速ML/MIN流动相A流动相B曲线起始1010000510982615010937619010901063201067336330106733634010010063701001006380101000642010100060066由图2和图3可知，本实施例提供的5ML规格小容量注射液中氨基酸的保留时间和中检所脑蛋白水解物140697200602的一致，含有16种氨基酸门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸。0067由。
25、图4可知，本实施例提供的5ML规格小容量注射液中总氨基酸的氮含量占总氮的883。说明书CN104043099A6/7页90068实施例20069脑组织检验、检疫合格去除血管等杂质后取100KG，加2倍体积纯化水匀浆，于85保温20分钟，冷却，盐酸调PH20，胃蛋白酶水解，42保温4小时，氢氧化钠调PH78，胰酶水解，42保温2小时，离心收集清液；盐酸调PH2，110保温30分钟，氢氧化钠调PH90；冷处理，抽取上清液，10KD膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，用DUS040C离子膜浓缩50L，02M膜过滤，得原液，15以下冻结保。
26、存；原液解冻，调配，加入亚硫酸氢钠002WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，灌装；115，30分钟，检漏等，制备得到10ML规格小容量注射液。0070相似度测定的方法参照实施例1，结果如图5和表4所示。0071表4实施例2指纹图谱相似度评价结果0072S1S2对照指纹图谱S1109560997S2095610976对照指纹图谱0997097610073由图5和表4可知，本实施例提供的10ML规格小容量注射液中的小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697200602的相似度为0956，符合质量控制要求090。0074氨基酸测定的方法参照实施例1，结果如图2、图6和图7所示。。
27、由图2和图6可知，本实施例提供的10ML规格小容量注射液中氨基酸的保留时间和中检所脑蛋白水解物140697200602的一致，含有16种氨基酸门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸。由图7可知，本实施例提供的10ML规格小容量注射液中总氨基酸的氮含量占总氮的868。0075实施例30076脑组织检验、检疫合格去除血管等杂质后取100KG，加2倍体积纯化水匀浆，于85保温30分钟，冷却，盐酸调PH30，胃蛋白酶水解，35保温5小时，氢氧化钠调PH72，胰酶水解，45保温3小时，离心收集清液；盐酸调PH3。
28、0，110保温30分钟，氢氧化钠调PH80；冷处理，抽取上清液，10KD膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，用DUS040C离子膜浓缩50L，02M膜过滤，得原液，15以下冻结保存；原液解冻，调配，加入焦亚硫酸钠002WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，灌装；115，30分钟，检漏等，制备得到5ML规格小容量注射液。0077实施例40078脑组织检验、检疫合格去除血管等杂质后取100KG，加2倍体积纯化水匀浆，于75保温20分钟，冷却，盐酸调PH17，胃蛋白酶水解，40保温5小时，氢氧化钠调PH72，胰酶水解。
29、，45保温3小时，离心收集清液；盐酸调PH28，110保温45分钟，氢氧化钠调说明书CN104043099A7/7页10PH80；冷处理，抽取上清液，10KD膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，用DUS040C离子膜浓缩50L，02M膜过滤，得原液，15以下冻结保存；原液解冻，调配，加入焦亚硫酸钠005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，灌装；115，30分钟，检漏等，制备得到10ML规格小容量注射液。0079实施例50080脑组织检验、检疫合格去除血管等杂质后取150KG，加1倍体积纯化水匀浆，于80保温1。
30、5分钟，冷却，盐酸调PH17，胃蛋白酶水解，40保温5小时，氢氧化钠调PH72，胰酶水解，45保温3小时，离心收集清液；盐酸调PH17，110保温15分钟，氢氧化钠调PH80；冷处理，抽取上清液，10KD膜超滤去除大分子，收集滤液150L；上柱层析，用纯化水冲洗柱，解析，收集洗脱液，调节PH至8090，用DUS040C离子膜浓缩50L，02M膜过滤，得原液，15以下冻结保存；原液解冻，调配，加入焦亚硫酸钠005WT，调节PH至6975，810KD膜超滤，02M膜过滤，灌装；115，30分钟，检漏等，制备得到5ML规格小容量注射液。0081对实施例35提供的注射液进行相似度测定，测定方法参照实施。
31、例1。实施例35提供的注射液中小分子多肽与中检所脑蛋白水解物140697200602的相似度分别为0957、0952、0954，均符合质量控制要求090。0082对实施例35提供的注射液进行氨基酸测定，测定方法参照实施例1。实施例35提供的注射液中游离氨基酸与对照品保留时间一致，含有16种氨基酸，实施例35提供的注射液中总氨基酸的氮含量占总氮的比例分别为875、869、882。0083以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。说明书CN104043099A101/4页11图1说明书附图CN104043099A112/4页12图2图3图4说明书附图CN104043099A123/4页13图5说明书附图CN104043099A134/4页14图6图7说明书附图CN104043099A14。