肠配质的药物剂型 本发明涉及“肠配质-粉剂和安瓿”制剂、其工业水平的分离方法、药物剂型的生产方法及该制剂药理学作用的研究方法。“肠配质-粉剂和安瓿”的活性成分是从肠粘膜分离的生物活性物质。已有文献报道在肠粘膜内存在着可抑制细胞增殖(1，2，3)的物质。文献中没有报道可对形态发生产生刺激作用的物质的分离。我们曾申请了一种从温血动物的肠粘膜分离生物刺激性物质的方法(4，5)。该方法存在着一些缺点：复杂的工艺过程使该物质的生产成本相对昂贵，并且该方法不能生产最终的药理学试验的剂型。
本发明的目的是：1)改善所述的分离“肠配质-粉剂和安瓿”制剂的生物活性成分地方法；2)发展“肠配质-粉剂和安瓿”制剂的药物剂型；3)在对生物活性成分的效果进行了实验性研究后，在兽医和动物驯养的实践中测试“肠配质-粉剂和安瓿”制剂的药理学作用。
第一个目的通过从猪的肠粘膜中分离生物合成过程刺激质的方法来完成。生产方案主要包括以下步骤：1)从动物肠粘膜中分离特定的细胞群，该肠粘膜为肉类包装厂的肠衣清洗车间的废弃物；2)将高分子量聚合物沉降后得到醇性酸提取物；在该步骤中应防止任何与起始生物量有关的污染；3)分批进行离子交换分级分离；4)将分级分离得到的洗脱液进行超过滤。技术方案在实施例1.1中进行描述。与专利BG49927MPK A61K37/02中记载的方法相比，具有如下改进：试剂的用量较小；对基本技术方案中的一些步骤进行了改变，减少了步骤数；对超过滤的参数进行了改变并进行了进一步的确定。其结果是，分离出了两种而不是一种生物活性核肽(nucleopeptide)，我们将其命名为“刺激性肠细胞配质”。
第二个目的通过制备两种药物剂型来完成：1)用于口服给药的“肠配质粉”的肠溶颗粒包装；2)含有纯化的储备形式的生物活性制剂的“肠配质安瓿”瓶。在2至6℃保存时，该药物剂型可在3年内有效。对上述药物剂型的分析已得到兽医制剂控制实验室和国家兽药局的官方证实(6)。该分析包括“肠配质”中的生物活性核肽的化学和生物学的鉴别反应。另外，还给出了制剂中载体成分的分析方法。
第三个目的通过实验室和临床实验以及在兽医实践中的应用来完成。“肠配质-粉和安瓿”中所含的生物活性核肽在分子水平起作用；它们使肠粘膜细胞的生理性再生的增殖周期缩短，从而导致小肠吸收表面的增加；对于非增殖性细胞，它们刺激特定蛋白质的合成：横纹肌内的肌纤凝蛋白，肝脏内的解毒蛋白，脾脏内的致免疫蛋白；以及胃肠道内的消化酶。在平滑肌细胞中，这些核肽通过刺激Ca2+-流入来诱导去极化(7)。
在小的实验动物中，每日使用该制剂可使它们的体重增加200％以上。在猪及家畜饲养场应用“肠配质”20天可产生持续六个月的长期的刺激效果。该效果的特点是，可使猪的重量每日增加125g，牛每日增加110g。对于小鸡，从孵化后的第3天至第45天添加于饮用水中，“肠配质”刺激DNA和蛋白质的生物合成，使它们体重增加118％。“肠配质”还在动物模型中表现出治疗效果：在实验性胃溃疡中、肝中毒后、通过刺激免疫发生来预防感染性疾病。经国家肿瘤中心和国家药物管理研究所的试验证实，“肠配质”无毒、无致畸作用、对胚胎无毒，并且无遗传毒性。
现在通过以下实施例对本发明进行说明。
实施例1.任务1(图1).在屠宰厂肠衣清洗间内的biterling机器上，收集从3号肠衣挤压轮上挤出的富集细胞的物质，并同时在恒定的搅拌下加入20％的冷乙酸，使乙酸的最终浓度为2％(相对于总体积)。对生物量的处理过程可以继续进行，也可以将生物量储存于-40℃的冰箱内。如果采取后一种方法，随后需要进行部分解冻。接着用绞肉机处理。向绞碎的物质中加入95％的乙醇(总量的0.2倍体积)。然后将生物量迅速加热至70℃并立即冷却至室温。通过分离和过滤分出液体提取液。弃掉高分子量的碎屑。将酸性pH值调至6.5-7.0。将醇及脂质混合物转移至玻璃反应器的醚中。在恒定的盐浓度下将提取物吸附到DEAE纤维素上并用碱性盐水溶液分批洗脱。有活性的部分通过穿透超过滤器进行纯化，收集0.5-2.0kDa范围内的部分。第二次过滤在无菌的条件下进行。测定核肽的浓度，该浓度为确定药物剂型的剂量所必需。实施例1.任务2.“肠配质-粉剂和安瓿”药物剂型的制备通过为鉴定核肽所设计的化学和生物学方法进行：a)紫外吸收光谱-最大值260nm，最小值237nm；A260/A237＝1.21-1.19；b)肽的特征反应，例如，Reichelt的茚三酮反应；c)分子量的测定：通过使用由分子量已知的肽预先校准过的Sephadex G-25细柱；对于Kav，两种活性核肽的参考极限分别是1.1-1.3kDa和0.6-0.65kDa；d)氨基酸组成：通过纸色谱上的“指纹”分析，或更精确地，通过在氨基酸分析仪上的定量测定。在低分子量的核肽中测得了甘氨酸和色氨酸；另一个核肽中含有精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、组氨酸、甘氨酸和酪氨酸；e)定量分析：分光光度分析A260，以标准的0.01mmol硫酸腺嘌呤为对照；计算公式：f)生物活性通过测量3H-亮氨酸(腹膜内注射，剂量为0.04MBp/20g小鼠体重)的掺入量来测定。在注射同位素(对照组)和同位素加0.02mg“肠配质”(实验组)18小时后，测量取自小鼠后腿内收肌的50mg肌肉组织中的同位素的掺入量。
流程图
刺激性肠配质的分离
实施例1.任务3.对“肠配质-粉剂和安瓿”制剂的生物学活性的迅速评价方法是通过相应的同位素标记的前体的掺入量来测定DNA、RNA和蛋白质的生物合成。平均活化作用大于200％(表1)。用“肠配质”反复处理的动物中出现长期的形态学改变(表2)。肠的吸收表面增加，从而在摄取少量食物时使食物的效能增加2.56倍，并且使蛋白质的效能系数比对照组增加2.5倍。在横纹肌中也发生了形态学的改变，收缩肌蛋白质相对增加。对小牛注射6次该制剂；每日在猪和淡水鱼的食物中加入该制剂20天；以及在小鸡的饮用水中加入该制剂45天，可使它们的生长动力学得到改善。
在大鼠中观察到“肠配质”对两种实验性溃疡模型(利血平和紧张-组胺模型)的显著的治疗效果。在大鼠四氯化碳中毒后研究了肝肾综合症的代谢和恢复过程的动力学。“肠配质”制剂表现出保护和修复作用。
表1“肠配质”对DNA(3H-胸腺嘧啶的掺入量)、RNA(14C-尿嘧啶的掺入量)、和蛋白质(3H-亮氨酸的掺入量)的生物合成的影响[相对于未给予“肠配质”的对照组动物的百分数]动物 器官 掺入量胸腺嘧啶尿嘧啶亮氨酸大鼠十二指肠空肠小肠中段回肠肝细胞核 221 190 284 337 16 小鼠十二指肠空肠小肠中段回肠肌肉 163 302 212 153 360 160 212 117 鸡白肌小肠中段红肌肝 103 242 118 183 104 265 193 331
表2用“肠配质”多次处理后的形态学改变[相对于未给予“肠配质”的对照组动物的百分数] 参数 器官 动物改变％体重(g)整体体重肝小肠心脏脾肾 小鼠 大鼠 大鼠 大鼠 大鼠 大鼠 212 159 126 135 112 120细胞构成(×105/lμm2)肠粘膜十二指肠空肠小肠中段回肠十二指肠空肠小肠中段回肠 大鼠 大鼠 大鼠 大鼠 小鼠 小鼠 小鼠 小鼠 144 173 167 135 134 163 173 139肠绒毛的数量(显微镜下切片)小肠中段 小鼠 133肠绒毛的长度(显微镜下切片/μm)小肠中段 小鼠 125单一肌纤维的面积(μm2)腓肠肌 猪 191膈 猪 279斜肌 猪 252单一肌纤维的直径(μm，电子显微镜下)腓肠肌 猪 154膈 猪 170斜肌 猪 157Z纹的厚度(μm，电子显微镜下)腓肠肌 猪 300
参考文献
1.Skraastad 0，Reicelt KI.内源性结肠有丝分裂抑制剂在血清有限介质内减少结肠癌细胞(HT29)增生。Virchows Arch B，50，(1989)，393-390。
2.Skraastad 0，Reichelt KI.内源性结肠有丝分裂抑制剂及食用钙抑制由胆酸诱导的结肠细胞增生。J Gastroent 23(1986)，801-807。
3.Triffonov B，Roussev GK，Argirov C，Draganov M，Kamberov B.一种新肠肽的生物学作用-抑制培养的3T3鼠成纤维细胞和L5178Y鼠淋巴细胞的肠细胞配基。Regulatory Peptides，51(1994)，111-119。
4.Triffonov B，Roussev GK，Boshev H，Tyanev G.分离生物刺激物的方法。Patent 49927，BG 49927 MPK A61K37/02，Vol 3，March16，1992，1-3(Bulgarian)。
5.Roussev GK，Triffonov B，Petrov M，boshev H.分离有成形活性物质的方法。Invention patent 37396 MPK-A61K35/38，Vol 6，June14，1985，1-6。
6.证书号XIII-33/10.02.1995，农业部国家兽医办许可在兽医行业生产和使用“肠配基”制剂的许可。
7.Triffonov B，Kristev A，Zaprianov G，Lukanov J，KostadinovaI.一种新肠肽(肠配基)对大鼠和豚鼠肠平滑肌的收缩和生物电活性的作用。J Gastrointest Motil 4，(1992)，193-l99。