含有海藻糖的干燥的血液因子组合物 本发明涉及血液因子的干燥的组合物，用于用水或水溶液重建(reconstitution)。
血液因子，特别是因子VIII和因子IX，是目前治疗由缺少适当因子引起的疾病，特别是血友病的标准治疗药剂。血液因子一般是通过各种提取技术来源于人的血液的，例如EP-A-0083483中所公开的，或者通过在基因修饰的微生物中表达得到，例如EP-A-0160457和EP-A-0182448中所公开的。
血液因子制品(例如因子VIII)是非常敏感、不稳定的蛋白。它们通常是以溶于合适的缓中液中的，冰冻的溶液的形式提供的，更一般地，它们是以冻干的粉末形式提供的。但甚至冻干的粉末在保存时也必须保持在低温下。为了使冻干的物质稳定，商业制品含有稳定化蛋白，特别是人血清白蛋白(HSA)。制备在环境温度和巴氏消毒(例如60℃)下稳定的，不合HSA的干燥的血液因子组合物被认为是不可能的。但是，HSA的存在将带来不可忽视的纯化方面地问题，因为蛋白不被病毒污染这一点是必需的。克服这些问题的重组HSA的应用是昂贵的。
已知海藻糖是敏感蛋白的高效稳定剂，如US-A-4891319中所公开的，能够使蛋白在冰点以上的温度干燥。我们现已发现，在完全不含有HSA的条件下，如果用海藻糖来稳定血液因子制品，该制品不仅可以在冷冻或不冷冻的条件下干燥，并且甚至在60℃温度下持续一定时间后也是稳定的。因此，根据本发明，我们提供了稳定的干燥的血液因子组合物，该组合物含有稳定化量的海藻糖，不含有白蛋白。
通常可以应用任意稳定化量的海藻糖，过量一般不会带来问题。实际上，海藻糖的存在有助于再水化过程，它用于注射时是生理可接受的，能够迅速地被代谢成葡萄糖。该组合物对因子VIII的制剂是特别适用的，该制剂也可包含适当的缓冲盐或离子增强盐，特别是钙源。一般地，每单位的因子VIII对应大约1.0至1.5毫克钙离子的比率是合适的。
其他缓冲或改性剂(例如组氨酸)也可存在于干燥的物质中，用于重建成注射液。但是，我们发现盐(特别是氯化钠)的存在水平可影响干燥制品的保存性。用于注射的商业制品被认为需要具有等渗盐浓度。但是，冻干的制剂最好是高渗的，典型地含有大约500mM NaCl(等渗NaCl＝150mM)，这被认为有助于稳定血液因子。结果，商业性冻干制剂通常具有高的盐含量，需用合适量的无菌水重建以得到等渗的溶液用于注射。
显著减少的盐含量对本发明的干燥的物质是优选的，需要干燥的每毫升大约500单位的因子III溶液通常优选地含有少于200mM，例如75-150mM的NaCl，特别是大约100mM，或者甚至低于例如20-50mM，特别是大约22-30mM。低盐制备物具有更高的干燥稳定性。可用盐溶液而不是常规的水将干燥制品重建到所需的盐浓度。海藻糖与盐的摩尔比通常应当高于1∶1，特别是高于2.5∶1，例如高于10∶1，优选地高于12.5∶1。
可通过干燥血液因子的适当溶液得到干燥的组合物，所述血液因子溶液含有正确比例的海藻糖和其他所需的成分。通常，被干燥的溶液应仅仅含有重建的注射溶液中所需的全部成分，虽然用于干燥的溶液不必处于同样的稀释度。典型地，每毫升用于干燥的溶液含有1-1000单位的因子III。干燥的方法可包括冻干、真空干燥和喷雾干燥。本发明特别优选的方法包括在不高于25℃，优选不高于10℃的温度下进行真空干燥，以形成泡沫，使暴露表面和干燥效果最大化。
下述实施例将进一步阐明本发明。
实施例1
重组的因子VIII是以深度冷冻溶液的形式得到的，含有大约2000-2500单位/毫升，溶于制造者的高盐缓中剂中。融化的溶液被透析，所用缓中液含有500mM NaCl，15mM CaCl2和10mM组氨酸，pH6.8。在同样缓冲液中稀释透析后的蛋白，但是加入海藻糖，终浓度为每毫升500单位，10％重量比的海藻糖，pH6.8。该溶液以1毫升的等分试样被真空干燥。真空度从大气压逐级减少到4Pa(30mTorr)，以避免样品冷冻。在形成泡沫之前，样品的温度不允许超过12℃，在形成泡沫之后，温度保持在低于30℃。总的干燥时间是24小时至28小时。
样品在40℃下保存0、1.5、3和6个月，然后在进行活性检测之前用5毫升等分试样的无菌蒸馏水重建。结果显示于下表，与含有HSA的商品化冻干制品进行对比。受试样品和商品化样品都具有高的盐含量。干燥后的结果显示，在不含有HSA而含有海藻糖的条件下，虽然可以成功地干燥因子VIII，但即使在含有HSA时，高的盐含量对于长期保存也是不利的。
初始活性的百分数 时间(月) 样品 商业制品 0 1.5 3 6 100.0 86.8 75.1 76.6 100.0 95.3 71.2 63.6
实施例2
如实施例1所述干燥样品，但所使用的缓冲制剂包含100mM NaCl，15mM CaCl2，15mM组氨酸和1.27摩尔海藻糖(48％)，并在重建之前保存在60℃。结果显示在下表中，其中活性是在ACL 100自动凝度计(Instrumentation Laboratory SpA，Milan，Italy)上测量的。即使在60℃下保存4周之后，具有低盐含量的受试样品也没有显示出明显的活性损失。
恢复的初始活性的百分数 湿性对照 100.0 干燥后 2周 4周 95 5 96.0 96.8实施例3制备含有如下不同盐浓度的两种制剂：
制剂A 制剂BNaCl 0.13％ NaCl 1.03％CaCl2 0.011％ CaCl2 0.011％L-组氨酸 0.12％ L-组氨酸 0.12％Tris 0.002％ Tris 0.002％Tween 80 0.002％ Tween 80 0.002％PEG 3350 0.004％ PEG 3350 0.004％海藻糖 7.5％ 海藻糖 7.5％因子VIII 50U/ml 因子VIII 50U/ml加水至100％ 加水至100％
将10毫升的制剂分配到各个30毫升的瓶中，使得因子VIII的浓度为500单位/瓶。
冻干是在Laconco(Lyph-lock 12 stoppering)冻干机中进行的。开始时，样品被冷却至-40℃，然后在加温至-35℃之前被置于真空。80小时之后，以2.5℃/小时的速率将样品加温，直到搁板温度达到25℃。然后在封闭之前，在真空下将样品保持在25℃两小时，并从干燥机中移出。
干燥之后，用10毫升水将样品重新水化，测定两次(测定1和2)因子VIII的浓度。结果由下表给出，以因子VIII浓度相对于预补充(prefill)对照(在-70℃下冷冻)的百分数表示。从该结果可以看出，因子VIII可以在不含有HSA的，基于海藻糖的制剂中被成功地冻干。 样品 测定1 测定2 制剂A 制剂B 77％ 91％ 85％ 94％