本发明涉及凝血酶抑制剂领域，并描述了借助遗传工程手段生产改性的水蛭素，具体指脱硫水蛭素（desulphatohirudin）突变蛋白的方法。本发明的另一目的是提供通过将所述水蛭素的2到4个单体结合起来，从而制备具生物活性的高分子量水蛭素的方法。 水蛭素是水蛭（如医学上用的水蛭：医用水蛭）中天然产生的抗凝血剂。水蛭素等于是在N-末端富集疏水氨基酸并在C-末端富集极性氨基酸且含有三个二硫键并通常有抗凝活性的正起作用的多肽。大多数天然水蛭素的一个特征是在其分子的C-末端（Tyr63）有一个硫酸酪氨酸酯残基。除去已知的水蛭素变异体HV1、HV2和HV3外，已报道实际上还存在其它水蛭素（参见，如M.Scharf et al.，FEBS Lett.255，105-110（1989）），从而支持了水蛭素作为一个同效抑制剂族的概念。
水蛭素，如水蛭素变异体1（HV1），是凝血酶即丝氨酸蛋白酶的最有效并最了解的抑制剂，所述丝氨酸蛋白酶催化血液凝集作用的最后步骤（将酶原纤维蛋白原转化成可凝固的纤维蛋白）。水蛭素并不抑制血液凝固级联反应中的其它酶。与在传统抗凝治疗优选的抗凝剂即肝素相反，水蛭素直接对凝血酶发挥其抑制作用，且与前者不同，并不是通过抗凝血酶Ⅲ起作用。纯化水蛭素唯一的药物学可检测效果是抑制血液凝固并预防血栓形成。给狗静脉内施用水蛭素后，甚至以高剂量下也未观察到副作用，如对心率、呼吸、血压、血小板数量、纤维蛋白原和血红蛋白的影响。在一系列地动物模型中，已证明水蛭素在实验性血栓形成（由停滞或由注射凝血酶引起的），内毒素性休克以及DIC（弥散性血管内凝血）中的有效性。从已完成的直接对比试验看，已证明水蛭素优于肝素。
近年来，已经在微生物宿主如大肠杆菌，特别是啤酒酵母中，克隆并表达了编码水蛭素变异体的cDNA和合成基因。尽管这种表达产物在Tyr63没有硫酸盐单酯基团-并因此而称之为“脱硫水蛭素”一但结果它们表现出与天然硫酸化水蛭素基本相同的生物活性。
重组脱硫水蛭素的一种治疗用特性是其在循环中的半衰期为约50分钟，并因此会迅速从人体内排出。迅速排泄的原因是肾脏肾小球对于分子量低于70000的物质的过滤作用。由于这种迅速的排泄，脱硫水蛭素日剂量一般分成两次或更多次施用。为得到更长效凝血酶抑制剂的一种办法是合成高分子量的水蛭素。在WO 91/08229中描述了水蛭素与聚二醇的轭合作用。由于聚二醇在分子大小和重量方面一般很不均一，因此，其与水蛭素的结合会产生不均一的混合物并且不容易施用规定剂量的水蛭素。在另一种方法中，将水蛭素与其它蛋白质如白蛋白交联（WO 92/05748）。这些轭合物表现出活性降低并且致免疫特性提高，因此不适于长期施用。
在WO 91/09125中，描述了相对失活的融合蛋白，它们由凝固级联反应的酶激活，从而具有纤维蛋白溶解或凝块形成抑制活性。
令人吃惊的是，已经发现，由脱硫水蛭素突变蛋白或脱硫水蛭素衍生物的二到四个残基组成的轭合物具有显著提高的血浆半衰期，即使其分子量低于约70，000的临界值（见上文），所述轭合物还令人惊异地末表现出有可检测的提高的致免疫特性，没有被与血液凝固有关的酶裂解并且活性末发生改变。由于血浆半衰期的提高，就有可能一次施用每日剂量的脱硫水蛭素。
本发明涉及一种实质上由脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的两至四个残基组成的轭合物，其中所述轭合物不是融合蛋白，而且具有水蛭素活性的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的残基不是经戊二醛或碳化二亚胺相连的。
术语“脱硫水蛭素”包括文献中描述或由转化的微生物菌株得到的所有脱硫水蛭素化合物，所述微生物菌株含有编码脱硫水蛭素或其衍生物的DNA。上述脱硫水蛭素是例如脱硫水蛭素衍生物HV1、HV2和HV3（PA），以及M.Scharf等人（FEBS Lett.（1989），255，105-110）和EP-A-347376描述的其他水蛭素以及hirullin蛋白。应理解具有水蛭素活性（即具有凝血酶抑制作用和/或凝血酶结合作用）的水蛭素衍生物或较短的片段也包括在术语“脱硫水蛭素”的范围内。上述片段和衍生物是例如C-末端截短的脱硫水蛭素，即在C-末端缺少最多达7个氨基酸的脱硫水蛭素。
可以通过连接其它反应性基团来修饰脱硫水蛭素或其活性片段或衍生物，其中，反应性基团对凝血酶活性有生物学影响。例如，可以将位于C-末端的脱硫水蛭素的凝血酶结合区与化学合成的凝血酶抑制剂结合。上述化学修饰的脱硫水蛭素衍生物的实例是水蛭素类似物（hirulogs）（WO 90/04642）。
在优选的实施方案中，本发明的轭合物实质上由脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的两个残基组成。本发明所述轭合物的组分，即脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的残基，可以是相同或不同的。
脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物直接或经连接基团相连。为了达到该目的，通常脱硫水蛭素的一个或多个（优选的是一个）天然氨基酸被一个或多个能交联的基团（如带有反应性侧链的氨基酸）替代。
本发明的目的之一是提供能形成轭合物的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物，轭合物实质上由所述脱硫水蛭素的两到四个残基组成。在本发明优选的实施方案中，由选自Asp、Glu、Lys和Cys的氨基酸替代脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的一个或多个天然氨基酸。替代一个氨基酸是优选的，更优选的是由Cys替代一个氨基酸，最佳为由Cys替代脱硫水蛭素HV1中的Asp33
可以通过在一个残基的Asp或Glu与另一残基中的Lys之间形成肽键，或优选的在两个Gys残基之间形成二硫键来生产由两个脱硫水蛭素残基组成的轭合物。
在另一方法中，也可以经连接基团连接本发明轭合物的组分（脱硫水蛭素突变蛋白或脱硫水蛭素衍生物的两到四个残基）。在这方面，通过反应性侧链例如上述定义的导入氨基酸的反应性侧链，将脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物与有两个或更多反应性基团（两个反应性基团是优选的）的连接分子相连，所述反应性基团可与脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的反应性侧链反应并形成共价键。所述连接分子是带两个或更多反应性基团例如-SH、-N3、-COOH、-COBr、-COCl、-NH2、-CHO、-CO-O-CO-、-CO-NH-CO-的分子。实例是N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺、对-叠氮基吩嗪基溴、对-叠氮基苯基乙二醛、N-4-（叠氮基苯基硫代）苯邻二甲酰亚胺、二（磺基琥珀酰亚氨基）辛二酸酯（suberate）、二（丁烯二酰亚氨基）已烷、二[2-（琥珀酰亚氨基氧羰基氧）乙基]砜、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸芪、己二亚胺酸二甲酯、庚二亚胺酸二甲酯、辛二亚胺酸二甲酯、二硫代二（琥珀酰亚氨基丙酸酯）、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基酒石酸酯、3′，3′-二硫代二丙亚胺酸二甲酯、4，4′-二硫代二叠氮基苯、3，3′-二硫代二（琥珀酰亚氨基丙酸酯）、乙基-4-叠氮基-1，4-二硫代丁亚胺酸酯、1-叠氮基-4-氟-3-硝基苯、N-羟琥珀酰亚氨基-4-叠氮基苯甲酸酯、甲基-4-叠氮基苯甲亚胺酸酯、间-顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟磺基-琥珀酰亚胺酯、N-羟琥珀酰亚氨基-4-叠氮基水杨酸、对-硝基苯基-2-重氮基-3，3，3-三氟丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基（4-叠氮基苯基）-1，3′-二硫代丙酸酯、磺基琥珀酰亚胺基2-（间-叠氮基-邻硝基苯甲酰氨基）-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚氨基-6（4′-叠氮基-2′-硝基苯基-氨基）己酸酯、磺基琥珀酰亚氨基2-（对叠氮基水杨酰氨基）乙基-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚氨基（4-碘乙基）氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚氨基4-（N-顺丁烯二酰亚氨基乙基）-环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚氨基4-（对顺丁烯二酰亚氨基苯基）-丁酸酯、N-琥珀酰亚氨基3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯、二[2-（磺基（sulfo）琥珀酰亚氨基氧-羰氧基）乙基]砜、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸酯、乙二醇二（磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸酯）、间-顺丁烯二酰亚基苯甲酰基-N-羟磺基琥珀酸酯）、磺基琥珀酰亚氨基（4-叠氮基苯基二硫代）-丙酸酯、磺基琥珀酰亚氨基6-（4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基）已酸酯、磺基琥珀酰亚氨基（4-碘乙基）氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚氨基4-（N-顺丁烯二酰亚氨基甲基）环己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚氨基4-（对-顺丁烯二酰亚氨基苯基）丁酸酯和2-iminothiolane。
优选的连接分子特异性地与氨基酸的-SH基团发生反应，如二硫代化合物象：二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、二巯基苯、1，4-二硫代丁二醇、1，3-二硫代丙二醇、带2个Cys的短氨基酸链或其他-SH交联剂象二（顺丁烯二酰亚氨基）己烷、间-顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚氨基（4-磺乙基）氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚氨基4-（N-顺丁烯二酰亚氨基甲基）-环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚氨基4-（对-顺丁烯二酰亚氨基苯基）-丁酸酯、N-琥珀酰亚氨基3-2（2-吡啶二硫代）丙酸酯、间-顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟磺基琥珀酸酯。
氨基酸交换并因此与另一脱硫水蛭素或连接子粘接是在位于对于脱硫水蛭素活性非必需的区域内发生的。脱硫水蛭素含两个与α-凝血酶独立位点结合的功能区;一个与凝血酶催化位点结合的紧接的N-末端核心区（Chang et al.，J.Biol.Chem.（1990），265，22159-22166）和一个与该酶的外位点（exosite）（纤维蛋白原识别位点）互补的无序C-末端尾（Maraganore等人，J.Biol.Chem.（1989），264，8692-8698）。通过C-末端区连接两个单体是不理想的，因为该区内的几乎每个氨基酸残基对于脱硫水蛭素的完全有效性都是必需的（Chang，J.Biol.Chem.（1990），265，22159-22166）。然而，在N-末端区内，有一个位于表面并远离凝血酶结合位点的可弯曲环（残基30到40，特别是残基31-36）（Grütter et al.，EMBO（1990），9，2361-2365）。改变脱硫水蛭素单体并连接脱硫水蛭素单体以形成本发明轭合物，优选的是在该区的氨基酸残基7到50之间、更优选的是在残基30到40，最佳在残基31-36之间完成。最优选的是脱硫水蛭素HV1，其中Asp33由Cys替代。因此，优选的是在该区的氨基酸残基7到50，更优选的是残基30到40之间，最佳是在残基31到36之间连接脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的单体，或将脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物单体和连接基团连接。
由于氨基酸交换，新修饰过的脱硫水蛭素链的折叠可能不同于未修饰脱硫水蛭素的折叠。若不能自发形成天然的脱硫水蛭素结构，则可将分离的脱硫水蛭素变性并在适宜的条件下折叠成表现出凝血酶抑制活性的构型。
已有大量申请报道了有关将细菌宿主中产生的单一蛋白质，或者是以变性或非天然形式的单一蛋白质进行重折叠的方案。WO 88/8003以及Halenbeck，R.et al.，Biotechnologie（1989），7，710-715描述了在大肠杆菌中表达之后，具有生物活性的人集落刺激因子-1（CSF-1）二聚体的形成。描述的方法包括：首先在含脲或胍盐酸盐的促溶环境中，于还原条件下，溶解从内含体中分离的CSF-1单体;通过逐步稀释促溶剂完成重折叠;最好在氧化还原系统中氧化重折叠的分子。在WO88/8849中，公开了一种回收重组白细胞介素-2（IL-2）的方法，其特征在于用6M盐酸胍在还原条件下使从refractile体中分离的IL-2变性，在Cu2+存在的情况下通过控制氧化作用氧化溶解的IL-2，然后通过降低溶液中变性剂的浓度来使氧化的IL-2重折叠。使用用于溶解的SDS和Cu2+作为完全还原蛋白质的氧化促进剂，使白细胞介素-2和干扰素-β重折叠（US-A-4572798）。在US-A-4620948中描述的分离重组refractile蛋白质的方法涉及溶解蛋白质的强变性剂;有利于正确折叠的还原条件以及在空气或其它氧化剂存在的条件下为改变二硫键的变性剂替代。WO86/5809公开了通过使变性蛋白与固体基质可逆性结合，然后稀释变性剂使其逐步复性，从而使包括细胞色素C、卵清蛋白和胰蛋白酶抑制剂在内的未折叠蛋白复性的方法。上述资料仅仅是大量有关折叠不同来源非天然蛋白质的文献中的代表。另一方面，本领域专业人员知道不可能预期折叠实验成功与否。一般不报道不成功的实验。不能肯定任何报道折叠条件的人会用所给的变性蛋白质如脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物做得很好。考虑到事实上：末修饰的脱硫水蛭素含6个Cys残基，而脱硫水蛭素HV1（其中Asp33由Cys替代）每链含7个Cys残基和大量的分子内二硫键，它们对于活性是必需的，从其单体、变性或其它非天然形式生产具生物学活性的多聚和特别是二聚脱硫水蛭素是一个很困难的挑战。
因此，本发明的目的之一是提供将脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物展开并重新折叠成具生物学活性的多聚且特别是二聚体形式的方法，包括下列步骤：
·用促溶剂使上述脱硫水蛭素变性，
·在重折叠条件下将脱硫水蛭素复性，且如果需要，
·经连接子，或直接连接脱硫水蛭素。
适宜浓度的促溶剂能够有效地使蛋白质变性，即通过其表面的改变，或者通过改变水合状态，溶剂环境或水溶液中溶剂-表面的相互作用，从而改变相应蛋白质的立体构型，这些是本领域专业人员熟知的。上述促溶剂或变性剂的实例包括浓度为约4-9M的脲、盐酸胍、硫氰酸钠，和以0.01到2%的浓度使用的洗涤剂，如SDS。另外，水溶液酸化至pH4以下或pH10以上的碱性条件以及升高温度均会导致单体的变性。
术语“重折叠条件”指缓冲液条件，在其中变性单体可呈现与生物活性相关的构型。可以在pH约6-10的范围内使用常规缓冲液系统，如Tris、磷酸盐、碳酸盐或柠檬酸盐缓冲液。在重折叠条件下可促进二硫键形成。上述条件包括，如存在增溶剂和使得巯基二硫化物对连续氧化和还原的氧化还原系统。缓冲液系统还可含适当的盐。
适宜的增溶剂是洗涤剂，优选的是温和的洗涤剂，有机的，水可混溶的溶剂或磷脂或其混合物。
适宜的促使二硫化物形成的氧化还原系统是如以约1到100mM，最好是约1到10mM浓度的低分子量的巯基/二硫化物试剂组合如氧化和还原形式的谷胱甘肽、氧化和还原形式的二硫苏糖醇、氧化和还原形式的β-巯基乙醇或β-巯基甲醇、Cys和其还原形式，以及胱胺和其还原形式。另外，可用约10到1000μg/ml浓度，最好50-200μg/ml浓度的硫氧还蛋白或二硫化物异构酶代替低分子量的巯基/二硫化物系统。
可选择的，为了进一步促进分子间和分子内二硫化物形成，可将有效量的含Cu2+的氧化促进剂（如CuCl2，Cu（NO3）2或邻-菲咯啉/Cu2+复合物）或含Fe3+离子的氧化促进剂[如FeCl3或Fe2（SO4）3]加到重折叠缓冲液中。有效量指在合适的时间内对于巯基的氧化所必需的最小量，它大约等于脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物中游离巯基的浓度，在所需二硫键的形成中将会涉及所述游离巯基基团。优选的量为0.001到100μM。
此外，存在或不存在氧化促进剂的情况下，可将O2或空气通入重折叠缓冲液。氧化反应也可以利用I2或苯醌来完成。
对于脱硫水蛭素变异体1的情况，其中Cys替代了Asp33（[Cys33]HV1），通常在通过本身已知的方法分离脱硫水蛭素后，完成变性，折叠和二聚作用步骤以得到匀质产物。通过例如在还原条件下加入盐酸胍使开始分离的脱硫水蛭素变性，通过在碱性条件下除去盐酸胍来重折叠，随后[Cys33]HV1单体被氧化，同时二聚化形成[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体。
Cys33单体和二聚体都是高活性的抗凝剂，并且其凝血酶抑制效力几乎没有区别（±3%）。这表明一个脱硫水蛭素二聚体与两分子α-凝血酶结合。
对于合成连接子的情况，可通过本身已知的方法将重折叠的脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物单体与连接子粘接。可以通过例如在“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，London，New York 1973，在“Methoden der organischen chemie”，Houben-Weyl，4th.Edition，Vol.15/1，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart 1974和在Th.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，New York 1981中描述的常规的保护基团将不应当与连接子结合的反应性氨基酸保护起来。保护基团的特征是通过溶剂分解作用，还原作用或光解作用很容易将它们除去，也就是说不会发生不需要的副反应。
如果需要导入遗传工程方法编码的氨基酸，可通过定点诱变改变脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物的氨基酸序列。另外，用本身已知的方法，如将先经遗传工程方法合成的部分脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物固定到一个固相上，并将缺失的基团加到固定的多肽上，而用化学方法合成携带有变化之处的至少部分脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物。
为了方便，不在蛋白质水平进行脱硫水蛭素的修饰，即氨基酸的改变。代替的方法是最好经定点诱变修饰编码脱硫水蛭素的基因，以便由宿主表达所述的修饰基因，产生所需的脱硫水蛭素突变蛋白，其中一个或多个氨基酸由能与其他脱硫水蛭素或连接子形成键的一个或多个氨基酸替代。在优选的实施方案中，一个氨基酸由Cys替代。
生产本发明脱硫水蛭素的方法包括，在适当的营养条件下，培养含编码水蛭素突变蛋白的DNA序列的转化宿主细胞，所述突变蛋白中一个或多个氨基酸由能与其它脱硫水蛭素或连接子形成结合键的一个或多个氨基酸替代;然后分离所述的脱硫水蛭素突变蛋白。
适宜的宿主细胞是例如细菌，如大肠杆菌或真核宿主细胞，如酵母，如啤酒酵母。根据本发明，优选的宿主生物是啤酒酵母。
用本领域已知的方法培养含上述DNA序列的宿主细胞，特别是酵母。
可以用本领域熟知的方法制备包括SEQ ID NO：5和7所示序列的DNA。制备这些DNA的方法包括化学合成DNA，从然水蛭素基因中切除含不需要的氨基酸残基密码子的DNA部分，并用DNA片段替代之，在所述片段中已用编码所需氨基酸残基的脱氧核糖核苷酸三联体密码子取代了所述密码子;或经定点诱变，完成脱氧核糖核苷酸的取代。
DNA的化学合成是本领域熟知的并可利用常规技术。S.A.Narang（Tetrahedron（1983），39，3）已描写了适当的技术。特别是EP-A-146 785中描述的方法。
可用限制酶切除部分成熟水蛭素DNA。该方法的先决条件是在有待改变的密码子附近有适当的限制位点。用核酸内切酶裂解除去小的限制片段，该片段含有编码不需要的氨基酸的密码子。例如用化学合成法制备相应的双链DNA序列，其中使用编码所需氨基酸的三联体密码子。以适当的方向，将DNA片段与剩余的大片段连接以产生编码脱硫水蛭素突变蛋白的双链DNA序列。为了方便并便于处理水蛭素基因，后者最好包含在备有适当连接子的较大DNA片段中，所述连接子使所述片段插入并克隆在克隆载体中。
在本发明优选的实施方案中，经定点诱变制备具有与SEQ ID NO：7一致的DNA序列的DNA。该方法是一种体外诱变方法，采用该方法可以改变克隆DNA区域内的特定位点（参见，M.J.Zoller和M.Smith，Methods Enzymol（1983），100，468;D.Botstein和D.Shortle Science（1985），229，1193的综述文章）。
将野生型水蛭素基因突变的方法的特征在于：将单链野生型水蛭素基因或含有野生型水蛭素基因的单链DNA与一种寡脱氧核糖核苷酸引物杂交，所述引物与将被突变的（除导致突变的错配外的）水蛭素区域互补，用杂交的寡脱氧核糖核苷酸作为引物如经PCR引发互补DNA链的合成，将所得的（部分）双链DNA转化到受体微生物菌株中，培养所述的微生物菌株并筛选含有带修饰水蛭素基因的DNA的转化体。
在优选的形式中，使用与扩增模板DNA所需序列的上游和下游核苷酸序列互补的两种寡脱氧核糖核苷酸引物（1）和（4）;使用彼此部分互补并均覆盖突变位点的两种内引物（2）和（3）。PCR引物（1）和（3）与引物（2）和（4）在不同反应中搭配使用以扩增部分模板DNA和诱导突变。在第二个反应中，将两种产物混合并用引物（1）和（4）扩增。
优选的是在质粒，如EP-A-143081或EP-A-340170中描述的质粒中含有野生型水蛭素基因。为了完成诱变，最好是经限制性核酸内切酶消化从该质粒中分离出水蛭素基因，得到含水蛭素基因及选择性地含有与其相连的其他功能部分如启动子，信号肽DNA等，且具有粘性未端的双链DNA，并经PCR扩增或与单链DNA噬菌体，如噬菌体M13的衍生物，如M13mp8或M13mp9的复制型（RF）的适宜限制片段相连，用杂交噬菌体载体转变染感受态微生物，如Ca处理过的E.coli菌株细胞，然后从培养细胞的上清液中分离含插入水蛭素基因的单链噬菌体DNA。错配的水蛭素（诱变的）寡脱氧核糖核苷酸引物与该模板杂交。
文献中描述的一些方法取决于诱变引物沿环状模板的酶促延伸，然后连接得到在新合成的链中，具有突变的共价闭合双链环状分子。由于这种方法一般效率低，因此，研制了一种改进的方法（K.Norriset al.，Nucl.Acids.Res.（1983），11，5103），其中使用第二引物。对于M13噬菌体载体，优选的是使用通用的M13定序引物（EP-A-225 286）。
含有编码脱硫水蛭素突变蛋白的DNA序列的杂交载体
本发明还涉及含有一个启动子和一种编码人脱硫水蛭素突变蛋白的DNA序列的杂交载体，所述突变蛋白中一个或多个氨基酸被一个或多个能与其他脱硫水蛭素或连接子（linker）成键的氨基酸所替代。所述DNA序列是在所述启动子的控制下。
本发明的杂交载体选自杂交质粒和线性DNA载体，并且还根据用于转化的宿主生物来选择。
作为本发明最佳宿主生物的酵母的启动子得自酵母（特别是啤酒酵母）的基因组DNA。优选的，将高效表达酵母基因的启动子用于表达脱硫水蛭素突变体。因此，可用TRP1基因，ADHI或ADHⅡ基因，酸性磷酸酶（PHO5）基因，CUP1基因，同种细胞色素C基因的启动子，或编码糖酵解酶如TDH3，甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶（GAPDH），GAPDH的短模型（GAPFL）是优选的，3-磷酸甘油酸激酶（PGK），已糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡糖异构酶，蔗糖酶和葡糖激酶基因的启动子，或编码Q-或α因子的酵母配对信息素基因的启动子。本发明优选的载体包含带转录控制的启动子，通过改变生长条件，可以打开或关闭这类启动子，如PHO5或CUP1基因的启动子。例如，仅通过提高或降低培养基中无机磷的浓度，就可使PHO5启动子阻遏或去阻遏。因此，可在酵母的指数生长期阻遏启动子，只在最大细胞密度的早稳定期打开（去阻遏），以便由PHO5启动子控制基因的表达。通过将Cu2+阳离子加到培养基中，如以铜盐的形式，就可打开CUP1启动子。
在本发明的杂交载体中，启动子与突变水蛭素编码区可操作地相连接，以便确保脱硫水蛭素突变蛋白的有效表达。在本发明优选的实施方案中，特别是如果用酵母作为宿主生物，则构建体中应包括信号序列。适宜的信号序列是有分泌的酵母基因产物的那些，如PHO5，蔗糖酶或α-因子信号序列或水蛭素信号序列。另外，在框架中将与酵母启动子天然相连的部分基因信号序列与部分水蛭素信号序列相连，可以构建融合的信号序列。那些结合物是受欢迎的，即它们使得在信号肽和成熟水蛭素氨基酸序列间可进行精确的裂解。构建体中也可包括其他序列，如可以或不可以携带特定加工信号的原-或间隔-序列以利于前体分子的精确加工。还可产生含内加工信号的融合蛋白，所述信号使得在体内或体外完成适当的成熟加工。优选的是，加工信号含Lys-Arg残基，它可由位于高尔基膜上的酵母内肽酶识别。关于成熟水蛭素基因的表达，基因产物进入分泌途径并被运至胞质中。如果可以做到通过细胞壁排到培养液中，则应可能明显地提高产率。不必破碎细胞还可使回收过程简单化。
优选的，本发明的杂交载体还含有包括适当转录终止信号和polyA的基因3′-侧序列。适宜的3′-侧序列是例如那些与所用启动子天然相连的基因，或其他酵母基因，如PHO5基因的3′-侧序列。
在本发明优选的杂交质粒中，其他的DNA序列携带酵母复制原点和酵母的选择性遗传标记。转化后，含酵母复制原点，如自主复制片段（Ars）的杂交质粒在酵母细胞内存在于染色体外，且自主复制直至有丝分裂。也可用含有与酵母2μ质粒DNA同源的序列的杂交质粒。这些杂交质粒可通过重组融合至已存在于细胞内的2μ质粒中或自主复制。2μ序列特别适于高频转化质粒并产生高拷贝数。
另外，本发明优选的杂交质粒可包括作为存在于宿主酵母染色体上的基因（如PHO5基因或其与突变水蛭素编码区相连的启动子）的一部分的DNA序列。由于同源序列，应等于约20到100个脱氧核苷酸的长度，整个质粒或其线性片段可经重组被稳定地掺入宿主染色体中。因此，增殖期间，子代细胞可保持导入的遗传物质甚至没有选择压力。
至于酵母的选择性标记基因，可以使用任何因标记的表型表达而有利于转化体筛选的标记基因。适宜的酵母标记具体地是那些表达的抗生素抗性，或者对于营养缺陷型酵母突变体来说，是补充宿主缺陷的基因。相应的基因赋予，如对抗菌的放线菌酮的抗性或在营养缺陷型酵母突变体中，提供原养型，如URA3、LEU2、HIS3或TRP1基因。也可用与自主复制片段相关的结构基因作为标记，如果被转化宿主对于标记所表达的产物是营养缺陷型的。
有利地是，本发明杂交质粒中的其他DNA序列还可包括细菌宿主，特别是E.coli的复制复原点和选择性遗传标记。在酵母杂交质粒中，有与E.coli复制原点和E.coli标记存在有关的有用特征。首先，通过在E.coli中生长和扩增，可以得到大量的杂交质粒，其次，利用以E.coli为基础的全部克隆技术，很容易在E.coli中进行杂交质粒的构建。E.coli质粒，如pBR322等含有E.coli复制原点和赋予抗生素，如四环素和氨苄青霉素抗性的E.coli遗传标记，并且有利于作为酵母杂交载体的部分。
下文将含，如复制原点和酵母细菌宿主遗传标记（见上文）的其他DNA序列称为“载体DNA”，并与酵母启动子和突变水蛭素编码区一起形成本发明的杂交质粒。
本发明优选的杂交载体是用本领域已知的方法，如连接酵母启动子，突变水蛭素编码区，酵母基因的3′侧序列和以及选择性地连接载体DNA而制备的。
为了制备杂交质粒，可以使用便于做图谱的有至少一个限制位点，优选的两个或更多限制位点的环状载体DNA，如细菌质粒DNA等（见上文）。最好是载体DNA已含有复制原点和酵母和/或细菌宿主标记基因。用适当的限制核酸内切酶裂解载体DNA。将限制过的DNA与含酵母启动子的DNA片段及编码脱硫水蛭素突变蛋白的DNA片段相连。在启动子与突变水蛭素编码区连接之前或之后（或同时），均可以导入酵母或细菌宿主复制原点和/或标记。在整个过程中，选择限制和连接条件以便不干扰载体DNA和启动子的基本功能。可以依次构建或连接两个含全部所需序列的DNA片段来构建杂交载体。
可以用各种技术体外连接DNA片段，可以直接用T4 DNA连接酶连接由特定限制核酸内切酶产生的平整末端（全部碱基配对的DNA双螺旋）。更为常见地是，通过其单链粘性末端连接DNA片段并由DNA连接酶，如T4 DNA连接酶共价闭合。用另一类产生交错末端（在几个核苷酸的距离内，于不同点断裂DNA双螺旋的两条链）的核酸内切酶裂解DNA，可形成上述单链“粘性末端”。通过用末端转移酶将核苷酸加到平整末端或交错末端（均聚尾）或简单地用适宜的核酸外切酶如入核酸外切酶切掉平整末端DNA片段的一条链，也可形成单链。生产交错末端的其他方法包括：将化学合成的连接子DNA与平整末端的DNA片段相连，所述连接子DNA含有形成交错末端的核酸内切酶的识别位点，然后用相应的核酸内切酶消化所得的DNA。
将本发明杂交载体的组分，如酵母启动子，可选择地包括信号序列，转录终止子，复制系统等的突变水蛭素结构基因以预定的顺序相连，以确保适当的功能。通过共有的限制位点或合成的连接子分子连接这些组分以确保这些组分的适当方向和顺序。
用本领域熟知的方法加工线性DNA载体，如以一种方式将上述酵母启动子与突变水蛭素编码区相连以便由所述的启动子控制突变水蛭素编码区，然后得到含有转录终止信号的DNA片段的DNA，所述转录终止信号得自酵母基因。
可以按上文详述，即通过平整末端连接，通过粘性末端或通过化学合成的连接子DNA完成DNA片段的连接。
特别是，为了被有效地表达，必须根据含转录（酵母启动子）和转译功能（核糖体结合位点）的序列适当确定突变水蛭素基因的位置。首先，以适当的方向，将含启动子的DNA片段与突变水蛭素编码区相连。如果可能有两个方向，则要经常规限制分析确定正确的方向。通过用适当的限制核酸内切酶切割所需的基因，将含不正确定向的所需突变水蛭素基因的杂交载体重新定向，并将该基因与杂交载体片段重新连接。在任何情况下，通过将两个DNA片段之一在其末端与不同的限制位点相连，避免不正确的方向。此外，应以可进行正确转录启动和终止的方式构建交载体。至于后者，应优选地在得自酵母染色体DNA或酵母2μ质粒的DNA序列中完成转录。其次，必须建立适当的阅读框架。通常，在连接前已知或容易测定启动子区和突变水蛭素编码区的核苷酸序列，以便在建立正确的阅读框架时没有问题。
如果需要在细胞质中积累所表达的成熟脱硫水蛭素突变蛋白，必须，例如通过核酸外切酶，如Ba131消化除去选择性地跟在启动子区之后和/或成熟突变水蛭素编码区之前的信号序列或其部分。使酵母启动子与突变水蛭素编码序列直接相连的优选区是在主要的mRNA起始位点和与酵母启动子天然相连的基因的ATG之间。为了在该区域内连接，成熟水蛭素编码序列应有其自己的转译起始ATG，或它具有的其他的合成寡核苷酸。也可以通过作为连接分子的合成寡脱氧核糖核苷酸，将酵母启动子与突变水蛭素编码序列相连。因此，如果可能，可将启动子区限制在其3′-末端附近，以便它没有预定数目的碱基对。类似地，可将突变水蛭素编码序列在其5′-末端附近进行限制切割。然后构建合成的寡脱氧核糖核苷酸以便，通过连接寡脱氧核糖核苷酸而连接酵母启动子和突变水蛭素编码序列时，保留包括ATG转译起始信号的丢失的碱基对，并且突变水蛭素编码序列是在与ATG起始密码子有关的适当的阅读框架内。
如果只用一个脱硫水蛭素片段，则其生产取决于所述片段的长度。通常，少于20个氨基酸的异源蛋白质不能被以足够的量表达并从象E.coli和啤酒酵母那样的天然宿主中分离。可能的表达小蛋白质，如脱硫水蛭素的羧末端片段的方法包括：将框架中所需的小蛋白质与另一种蛋白质融合，因此产生一种融合蛋白。已经研制了数种方法以便将所需的蛋白质与其融合伙伴分离（Nishikawa et al.，Protein Engineering 1，487-492（1987）;Gardella et al.，J.Biol.Chem.265，15854-15859，（1990）;Altman et al.，Protein Engineering 4，593-600（1991））。可用的宿主是真菌如酵母，优选的是啤酒酵母，或细菌像E.coli。
适宜的内源融合伙伴是高效表达的蛋白质。优选的是蛋白质如eglin，β-半乳糖苷酶，β-乳糖酶，E.coli中与色氨酸合成有关的几种蛋白质，蛋白质A或氯霉素乙酰基转移酶。在啤酒酵母中，优选地使用嵌合泛激素融合蛋白（Sabin et al.，Biotechnology7，705-709（1989））。
在表达并纯化融合蛋白后，必须要从融合伙伴中取出所需的脱硫水蛭素的羧末端片段。如果在所需片段和融合伙伴间没有天然的裂解位点，则一般利用将所需片段与融合伙伴连接并且含有裂解位点的连接子序列来完成，可用化学或酶方法选择性地裂解所述位点。所述裂解位点包括，例如对溴化氰作用敏感的甲二磺酰基，包括由肠激酶在Lys后裂解的四肽基Asp-Asp-Asp-Lys的肽链或任何其他对用酶，如V8蛋白酶、胰蛋白酶、肽酶yscα或yscF的特异性裂解敏感的裂解位点。
另外可利用肽合成仪合成方法生产短的片段。
如果用包括信号序列在内的表达盒，经酵母菌株生产脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物，则生产的脱硫水蛭素主要（即90%以上）分泌在培养液中。可以用常规方法从中分离脱硫水蛭素。例如，第一步通常包括通过离心从培养液中分离细胞。经聚乙烯亚胺处理以便除去大部分的非蛋白质物质，使所得的上清液富集脱硫水蛭素，并用硫酸铵使溶液饱和来沉淀蛋白质。也可以用乙酸酸化（如0.1%，pH4-5）来沉淀宿主蛋白质，如果存在的话。通过用正丁醇提取乙酸上清液可进一步富集脱硫水蛭素。其他纯化步骤包括，例如，脱盐作用，层析加工，如离子交换层析，凝胶过滤层析，分配层析，HPLC，反相HPLC等。也可经透析，根据电荷通过凝胶电泳或无载体电泳，根据分子大小利用适宜的Sephadex柱，通过亲合层析，例如与抗体，特别是单克隆抗体，或者同与用于亲合层析的适宜载体偶联的凝血酶，或者用其他方法，特别是文献中已知的那些来实现混合物各组分的分离。通常，只需几个纯化步骤就可得到基本上无污染的脱硫水蛭素产物。
可以用使用抗-脱硫水蛭素或抗-脱硫水蛭素抗体（如单克隆抗体）的试验，凝血酶试验（M.U.Bergmeyer（ed），Methods in Enzymatic Analysis 1983，Vol Ⅱ.p.314-316，Verlag Chemie，Weinheim（FRG））或血液凝固试验（F.Markwardt et al.，Thromb Haemost.（1982），47，226）来检测分离和纯化步骤中脱硫水蛭素的活性。也可用层析方法，如HPLC。
因此本发明的目的之一是提供一种用于本发明脱硫水蛭素的表达盒，该表达盒包含以可操作方式连接至编码信号肽的第一DNA序列上的一个启动子以及携带转录终止信号的一个DNA序列，所述第一DNA序列在适当的阅读框架中与编码所述脱硫水蛭素或衍生物的第二DNA序列相连接。
本发明的另一目的是提供一种生产基本上由2到4个脱硫水蛭素突变蛋白或衍生物组成的脱硫水蛭素轭合物的方法，包括：
·例如通过在适当的宿主中表达适宜的脱硫水蛭素来生产适宜的脱硫水蛭素单体，
·分离脱硫水蛭素，
·如果需要，保护反应性氨基酸侧链，
·将脱硫水蛭素单体与适宜的连接子连接或例如经二硫键直接连接两个脱硫水蛭素单体。
药物组合物
根据本发明可获得的新的脱硫水蛭素轭合物具有宝贵的药理学特性并且与从水蛭中提取的单体脱硫水蛭素一样，可用于预防或者，尤其是治疗疾病。
与天然水蛭素一样，本发明获得的脱硫水蛭素轭合物是有效的凝血酶抑制剂。例如具有10-9M至10-13M的Ki值。该脱硫水蛭素轭合物对凝血酶具有绝对的专一性并且没有显示出与血凝固系统的其它蛋白酶具有相互作用。其毒性非常低。同样，没有观察到超敏反应或过敏反应。由于脱硫水蛭素轭合物的血浆半衰期增长，因此可以一次施用脱硫水蛭素的日剂量。
因而本发明制备的新的脱硫水蛭素轭合物与天然水蛭素相似可用于治疗和预防血栓形成以及血栓栓塞，包括预防手术后的血栓形成，用于急性休克治疗（例如用于浓毒性的或多外伤休克），用于治疗消耗性凝血病，以及在血透析，血分离和体外血循环中的应用。
本发明还涉及药物组合物，该组合物含有非强制性地与一种药物学上可接受的载体和/或助剂相结合的治疗有效量的至少一种本发明制备的化合物或其可药用的盐。
当将这些组合物以例如非肠道途径给药时，如静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射或肌内注射时，它们特别适用于上述的适应症。
本发明还涉及利用本发明的新的化合物以及含有这些化合物的药物组合物来预防和治疗人体或动物体，特别是预防和治疗具有上面所述临床症状的人体或动物体，主要是用于抑制人或动物体内和体外的血液的凝固。
使用的剂量主要依据给药的具体形式以及治疗或预防目的而定。单份剂量的多少以及服药方式最好是根据具体病例作单独判断来决定;为了该目的而需要对相关血液因子进行测定的方法是本领域内技术人员熟知的。通常，就注射方法而言，本发明所述化合物的治疗有效量为约0.005至约0.1mg/每公斤体重的剂量范围。优选的剂量范围为约0.01至约0.05mg/每公斤体重。给药途径包括静脉内注射、肌内或皮下注射。因此，对于用于非肠道途径给药的单剂量形式的药物组合物，依据不同的给药方式，每份剂量含有约0.4至约7.5mg本发明化合物。除活性成分外，这些药物组合物通常含有一种缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂，用于保持pH值在约3.5至7之间，还含有用于调节等渗性的氯化钠，甘露醇或山梨醇。这些组合物可以是冻干形式或溶解的形式，对于溶液而言，含有一种抗菌的活性防腐剂例如0.2至0.3%4-羟基苯甲酸甲酯或乙酯更为有利。
本发明的另一个实施例涉及一种含水制剂，该制剂含有水，至少一种本发明所述化合物，以及水不溶性盐形式的钙离子、镁离子或锌离子。
水不溶性盐最好是一种硝酸盐，因为它们是非常不溶的。
该制剂pH为4至11，优选为5至9。金属盐浓度为100mM至600mM，优选为100mM至300mM，最优选为约150mM。如果其浓度高于能用的生理浓度，可将该制剂在使用前稀释到生理浓度。本发明所述化合物的浓度为1-600mg/ml，优选为20-80mg/ml。如果现存只有高浓度，则可在使用前稀释到例如20-80mg/ml范围内。
水不溶性盐的粒径大小是10-30μm，优选为10-20μm。
通过在本发明所述化合物的水溶液中就地沉淀水不溶性盐而制备该制剂。例如，将所选择的金属（Ca、Mg或Zn）的氯化物与碱金属磷酸盐混合。然后如果合适可用盐酸或氢氧化钠调节所得制剂的pH值。对于该制剂优选的金属是锌。
本发明的制剂还含有一种糖例如海藻糖、蔗糖，或者优选的甘露糖醇。
除了上面描述的可直接用于治疗人体或动物体的组合物以外，本发明还涉及在人或动物活体外治疗用的药物组合物，这些组合物主要用作为血液的抗凝固添加剂，该血液用于体外循环或治疗（例如人工肾脏的体外循环或透析），保存或修饰（例如血分离）。这样的组合物，例如贮存原液或另一种剂量形式的组合物在组成上与上面介绍的注射用组合物相似;但是，活性成分的量或浓度较有利的是根据待处理的血液体积而定，或者更精确地是根据其凝血酶含量而定。关于这一点必须记住本发明的活性成分（游离形式）可使约5倍重量的凝血酶完全失活，并且在相对高剂量时也无生理毒性，并甚至在高浓度时也能快速地从血液循环中清除，从而在例如输血期间没有剂量过大的危险。依据特定目的，合适的剂量为每升血液约0.01至约1.0mg的活性成分，但仍可超过该上限值而无危险。
附图简介
在下面实施例部分参照附图对本发明的各种实施方案进行描述，其中：
图1 图解说明Cys33HV1-Cys33HV1二聚体的重折叠过程。
如果没有另外说明，所有DNA操作都是根据标准方法完成（例如Maniatis，T.et al，：Molecular cloning：a laboratory man-ual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York（1982））。
实施例1
质粒pDP34/GAPFL-YHIR（CYS33）的构建
通过改变编码脱硫水蛭素的核苷酸序列可以在酵母（啤酒酵母）中表达脱硫水蛭素-Cys33，一种在第33位氨基酸处由半胱氨酸替代天冬氨酸得到的重组脱硫水蛭素衍生物1突变体（HV1）（J.Dodtet al.，FEBS Lett.165（1984），180-184）。为了得到该脱硫水蛭素突变体，使用聚合酶链反应（PCR）法（“PCR方法：方法和使用指南”M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，T.J.White（eds）.Academic Press，New York，1990），在表达盒中用TGT替代GAC。TGT编码Cys，因而导致表达出脱硫水蛭素-Cys33（Cys33HV1）。
使用下列PCR引物：
（SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，）
与模板DNA的核苷酸
位置互补
(1) 5'-TCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCG-3' 7492-7494,1-21
(2) 5'-TTGGGTTCTTGTGGTGAAAAGAACCAATGTG-3' 626-656
(3) 5'-CTTTTCACCACAAGAACCCAAGATACACTTG-3' 646-616
(4) 5'-GCCAAGCTTGGCTGCAGATTTTAATC-3' 1122-1100
这些寡聚氧核苷酸引物与模板DNApJDB207/GAPFL-YHIR-YHIR（EP-A-340 170）SEQ ID NO：5，的核苷酸序列（见上文）互补。引物（1）和（4）是用于扩增模板DNA的上游和下游引物;引物（2）和（3）是互相部分互补的内部引物，并且两引物覆盖了突变位点（底下划线处）。在不同反应中成对地使用引物（1）和（3）以及引物（2）和（4）以扩增部分模板DNA并引入突变。两种PCR产物都重叠覆盖了突变区。在二级反应中将产物混合并且用引物（1）和（4）扩增。
根据标准PCR方法，将0.1mg质粒pJDB207/GAPFL-YHIR（EP-A-340 170）模板DNA与各1mg的引物（1）和（3）分别混合或者与各1mg的引物（2）和（4）分别混合，以扩增相应的DNA片段，该标准方法包括30个循环，每个循环在72℃进行1分钟合成DNA，在93℃进行20秒分离DNA链，在50℃经过20秒退火。利用酚萃取法纯化该DNA片段，并用乙醇沉淀。
第二个重迭-延伸反应包括第一次反应（见上文）中扩增的各0.1mg的PCR产物以及各1mg的PCR引物（1）和（4）。同样扩增30个循环，其中每个循环包括在72℃进行1.5分钟用于合成DNA，在93℃进行20秒用于分离DNA链，以及在50℃进行40秒用于退火。
用salⅠ和HindⅢ限制性切割扩增的DNA片段。将1.1kb SalⅠ-HindⅢ片段克隆到SalⅠ，HindⅢ切割的pUC9载体（Sigma）。采用限制性切割分析法检查几个克隆并将一个正确克隆的插入片段进行测序。该克隆的编码序列含有编码Cys33的TGT密码子。
1.1kb SalⅠ-HindⅢ插入片段是脱硫水蛭素的表达盒，它包括pBR322的276bp SalⅠ-BamHⅠ片段，一个BamHⅠ/BglⅡ接头以及在-5位的带有EcoRⅠ接头的194bp GAPFL启动子。该EcoRⅠ位点将启动子与PHO5信号序列以及[Cys33]HV1的编码序列连在一起。3′端BamHⅠ位点后面与377bp PHO5转录终止子和一个HindⅢ位点相连接。
将1.1kb表达盒以SalⅠ平齐末端片段形式克隆到已用BamHⅠ（由Klenow聚合酶转化为平齐末端）和SalⅠ切割的高拷贝数酵母表达载体pDP34（DSM 4473）上。将得到的质粒称作为pDP34/GAPFL-YHIR（CYS33）。在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中给出了Cys33HV1部分的序列以及相应的蛋白质序列。
实施例2
酵母转化和发酵
按照EP-A-341 215中公开的方法构建啤酒酵母菌株TR1456。在两个依次相连的实验中，以啤酒酵母H449菌株（DSM4413）作为起始材料，通过破坏其编码基因KEX1和PRC1分别从H449菌株中除去两个羧肽酶yscα和yscY。首先，破坏编码yscα基因，KEX1。为此，用编码KEX1基因的DNA片段（在该KEX1编码区的中间插入了全长的URA3基因）转化H449菌株。筛选出尿嘧啶原养型转化体并检测其是否没有yscα活性。接着，通过用含有一个被破坏的URA3基因的变体，ura3△5的质粒（参见EP-A-341 215）进行转化而破坏在KEX1位点处插入的URA3基因。筛选出尿嘧啶营养缺陷型转化体，在下一个步骤中破坏其内源的编码羧肽酶yscY的PRC1基因。基本上按前面描述的破坏KEX1的类似方式完成该试验。将最后得到的H449菌株的同系衍生物称之为TR1456并且具有下列基因型：
利用Hinnen et al.的转化方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75（1978）1929-1933）用质粒pDP34/GAPFL-YHIR（CYS33）转化酵母菌株TR1456。按尿嘧啶选择法培养转化酵母细胞。将经转化的单个酵母菌落称作为：
啤酒酵母TR1456/pDP34/GAPFL-YHIR（CYS33）
将转化体在不含尿嘧啶的10ml基本培养基上发酵两个连续的预培养期，在没有选择性的完全培养基中发酵进行实际的生产操作。按EP-A-340 170描述的方法从培养肉汤中分离出粗制[Cys33]HV1。
实施例3
Cys33HV1的制备，未折叠以及重新折叠
按照生产天然水蛭素的方法（Meyhack et al.（1987），Thromb.Res.Suppl.，Ⅶ33）在酵母中表达[Cys33]HV1并将其分泌到培养基中。通过离心除去细胞，并采用XAD-7树脂吸附法，从上清中取出显示有抗凝血酶活性的蛋白质。用醋酸铵缓冲液（0.2M，pH8.5）洗脱活性蛋白质混合物，并上样到Q-Sepharose快流速离心交换柱上。使用在50分钟内由0%A（用甲酸将缓冲液pH调至5.0）变化至85%B（用甲酸将缓冲液pH调至3.0，并且含有0.5MNaCl）的甲酸铵缓冲液（25mM）梯度对该柱进行洗脱。将显示有抗凝血酶活性的组分收集在一起并冷冻至干燥。
在0.75ml的含有5M盐酸胍（GdmCl）和0.1M二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲液（0.5M，pH8.4）中，23℃将粗制[Cys33]HV1（4mg）还原2小时。将样本传递过在50mM碳酸钠缓冲液pH8.3中平衡的PD-10柱（pharmacia）。收集1.2ml经还原/变性的样本，并立即用同样的碳酸钠缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml（140mM）。折叠步骤是在23℃进行的，并且通过用2倍体积的4%三氯醋酸将折叠样本酸化，监测时间进程，在适当的时间收集折叠中间产物。
实施例4
用HPLC法鉴定折叠中间产物的特性
将[Cys33]HV1在50mM NaHCO3（pH8.3）中，23℃时重新折叠（见图1）。按一定的时间进程通过酸化而收集折叠中间产物并采用下列条件进行HPLC分析：
柱：用于肽和蛋白质分析的Vydac D-18，5mm;
溶剂A：含0.1%三氟醋酸的水;
溶剂B：含0.1%三氟醋酸的乙腈/水（9∶1，V/V）。
梯度：20分钟内24%变化至43%溶剂B线性。
检测：在214nm处。
在17.7分钟内洗脱经还原/变性的（R）Cys33HV1。
“NM”是活性Cys33HV1单体（13.5分钟）。
“ND”是Cys33HV1二聚体。
图1中插图是由相同HPLC条件分析的粗制[Cys33]HV1。
粗制产物的不均匀性是生物合成后的不正确折叠或纯化过程中样本破坏造成的。
在上面描述的条件下，用第一种速率常数0.05+/-0.01分钟-1首先形成活性[Cys33]HV1单体（NM）（图1）。随后在二个活性[Cys33]HV1单体之间产生氧化作用并且产生二聚体。折叠高效率地进行，并且产量高于85-90%。在pH高于8.3时，折叠反应以更高速度进行。
实施例5
[Cys33]脱硫水蛭素单体和二聚体的特性
采用二甲基氨基偶氮苯磺酰基（dabsyl）氯化物方法（Chang et al.Anal.Biochem.（1991），197，52-581测定氨基酸组成，该方法可直接确定二硫键的含量。利用一个Applied Biosystem Inc.470A蛋白质测序仪分析氨基酸序列。使用公开描述的方法（Stone et al.Biochemistry（1986），25，4622-4628;Chatrenet et al.J.Biol.Chem.（1992），267，3038-3043），根据其抑制消化的Chromozym TH（Boehringer Mannheim）中α-凝血酶的能力估测脱硫水蛭素衍生物的抗凝血酶活性。利用国产仪器以及激光解吸附离心化质量分光光度法（Boernsen et al.Chimia（1990），44，412-416）测得脱硫水蛭素的分子量是13916。
由氨基酸分析法证实[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体不含有游离的Cys。
在1nm脱硫水蛭素以及1.5nMα-凝血酶浓度下检测凝血酶抑制作用，在重量相等情况下，该二聚体显示出基本上与野生型脱硫水蛭素具有相同抑制活性（82±5%）。
实施例6
二聚体和单体是内部可转变的
与脱硫水蛭素的三个内部二硫键不同，由于非共价键相互作用，该二聚体的Cys33-Cys33键是不稳定的。因此可以在温和还原条件下选择性地切割Cys33-Cys33键而不破坏活性中心区内的三个二硫键。进行该实验是为了找到使二聚体定量转变为单聚体的最佳条件。在室温下使用0.5至2.5mM的β-巯基乙醇可完成该试验。在更高浓度的β-巯基乙醇时，由于Cys6-Cys14，Cys16-Cys28以及Cys22-Cys39二硫键发生还原使单体快速分解。
实施例7
适用于非肠道给药的含有脱硫水蛭素二聚体的药物组合物
将实施例3的冻干的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体溶解于0.9%NaCl溶液中至终浓度为0.2mg/ml或2mg/ml。通过超滤（用0.22μm孔径的膜）将这些溶液灭菌。
该无菌溶液可直接使用，例如用于静脉给药。
实施例8
皮下给药的水蛭素HV1和[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体对大鼠体外血浆APTT的影响（APTT二激活部分凝血酶的时间）
将[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体溶解于盐水中至浓度为4.5mg/ml，并将未经修饰的水蛭素单聚体溶于盐水中至浓度为3.0mg/ml（这些剂量选择是基于体外结果而定，以便在1小时内它们对APTT的影响相似）。将该溶液皮下注射到大鼠（1ml/kg）。在给药后不同时间，通过心脏穿刺直至收集血液（2ml）到1/10体积的柠檬酸三钠溶液（3.8%W/V）中并立即混合。将该抗凝固血液在2500g离心20分钟，得到无血小板的血浆。
利用标准方法在Instrumentation Laboratory ACL 300R血凝度计上检测血浆样本的APTT。该APTT测定方法利用了Instrumentation Laboratory鞣花酸检测盒一将血浆（50μl）与鞣花酸激活剂（50μl）在37℃保温5分钟，然后加入氯化钙溶液（50μl的25mM溶液），并且自动记录获取血浆凝块的时间，当血纤维蛋白网状构造形成时，用散射光光学方法测定该关键点（见表1）
该结果表示为对照的平均APTT值的倍数，并描述为平均值±该平均值的标准误差（n＝5）
实施例9
药物组合物
溶液A含有溶于水中的2.43M ZnCl2，和0.455M Na2HPO4，pH为2.5，用HCl调节pH。溶液B由0.6M NaOH，0.25M NaCl组成。通过将2份溶于水的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体的贮存液（80mg/ml）与1.05溶液A混合（比例为2∶1.05，V/V）而制备溶液C。将水，溶液B和溶液C分别按0.66∶0.1883∶0.4的重量比混合而制备药剂。
利用CaCl2或MgCL2代替ZnCl2制备相似的混合物。
实施例10
药物组合物
溶液A1含有溶于水中的165mM ZnCl2，2.11mM Na2HPO4以及37.8mM HCl。溶液B1含有0.6N NaOH。将[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体（粉状）加到31.7倍体积的溶液A1中，接着加入55倍体积的甘露醇溶液（198mM），然后加入13.3倍体积的溶液B1。当形成沉积时该溶液变得浑浊。该[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体以每ml水中含20mg的浓度使用，不需要调节pH。
实施例11
由[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体抑制人凝血酶的动力学参数的检测
按照Wallace等人，Biochemistry（1989），28，10079-10084描述的方法，在200μM D-Val-Leu-Arg-p硝基酰基苯胺存在下，滴定抗2.0nM凝血酶的值而测出水蛭素浓度。
根据重量以及一个亚单位的分子量为7000，活性分子的反应为0.97。结果证明二聚体的二个分子均是有活性的。
按照Stone et al.Biochemistry（1986），25，4622-4628和Braun et al.Biochemistry（1988），27，6517-6522描述的方法，由进度曲线试验测定[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体的动力学参数。对于每项测定，都在六个检测试验中监测从D-Phe-派可酸基-Arg-p-硝基酰基苯胺形成的对-硝酸苯胺，这六个测试中的一个没有抑制剂，其他测试有范围从10-60pM的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体的不同浓度的抑制剂存在。底物浓度为100μM，而酶浓度是20pM。
动力学参数测定两次，列于表2中的值代表测得数值的平均值。
表2
抑制剂 参数
108k1K1
(M-1s-1) (pM)
[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚体 (0.51±0.03) 0.330±0.038
HV1 (1.37±0.03) 0.237±0.006
微生物寄存
下列微生物菌株寄存于德国微生物收集中心（DSM），Mascheroder Weg 1b，D-3300 Braunschweig（给出了寄存日期及保藏号）：
酿酒酵母H449：1988年2月18日寄存，DSM 4413;
大肠杆菌JM 109/pDP34：1988年3月14日寄存，DSM 4473;
【序列表】
（1）一般资料：
（ⅰ）申请人：
（A）名称：CIBA-GEIGY AG
（B）街道：Klybeckstr.141
（C）城市：Basel
（E）国家：瑞士
（F）邮编（ZIP）：4002
（G）电话：+41 61 69 11 11
（H）传真：+41 61 696 79 76
（I）电传：962 991
（A）名称：UCP GENP-Pharma AG
（B）街道：Solothurnerstrasse 24
（C）城市：Kirchberg
（E）国家：瑞士
（F）邮编（ZIP）：3422
（ⅱ）发明名称：高分子量水蛭素
（ⅲ）序列数：8
（ⅳ）计算机可读形式：
（A）介质类型：软盘
（B）计算机：IBM PC兼容
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25（EPO）
（2）SEQ ID NO：1的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：24个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（Ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..24
（D）其他资料：/产品＝“合成的PCR产物”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：1：
TCGGTCGACG CTCTCCCTTA TGCG 24
（2）SEQ ID NO：2的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：31个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..31
（D）其他资料：/产品＝“合成的PCR引物”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：2：
TTGGGTTCTT GTGGTGAAAA GAACCAATGT G 31
（2）SEQ ID NO：3的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：31个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..31
（D）其他资料：/产品＝“合成的PCR引物”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：3：
CTTTTCACCA CAAGAACCCA AGATACACTT G 31
（2）SEQ ID NO 4的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：26个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..26
（D）其他资料：/产品＝“合成的PCR引物”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：4：
GCCAACTTG GCTGCAGATT TTAATC 26
（2）SEQ ID NO 5的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：1130个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..1130
（D）其他资料：/功能＝“pJDB207的起始1130核苷酸/GAPFL-YHIR（EP-A-340170）”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1..276
（D）其他资料：/产物＝“pRB322的SalⅠ-BamHⅠ片段”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：277..284
（D）其他资料：/功能＝“BamHⅠ/BglⅡ连接子”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：启动子
（B）位置：285..478
（D）其他资料：/功能＝“GAPFL启动子”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：479..484
（D）其他资料：/产物＝“EcoRⅠ连接子”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：488..538
（D）其他资料：/功能＝“PH05信号序列”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：539..733
（D）其他资料：/功能＝“水蛭素HV1”/标准名称＝“HV1”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：终止子
（B）位置：737..1113
（D）其他资料：/标准名称＝“PHO5终止子”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：1117..1122
（D）其他资料：/功能＝“M13克隆位点”
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc_feature
（B）位置：734..736
（D）其他资料：/功能＝“转译终止子”/标准名称＝“TAG”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：5：
（2）SEQ ID NO：6的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：65氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：蛋白质
（B）位置：1..65
（D）其他资料：/注＝“水蛭素变异体（HV1）”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：6：
（2）SEQ ID NO：7的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：195个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：mat_peptide
（B）位置：1..195
（D）其他资料：/产物＝“[33-Cys]HV1）”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：7：
（2）SEQ ID NO：8的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：65氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链数：单股
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：蛋白质
（B）位置：1..65
（D）其他资料：/注＝“[33-Cys]HV1）”
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：8：