一种靶向于人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的抗肿瘤小分子化合物 【技术领域】
本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及一种基于生物信息学和计算机技术，经虚拟筛选得到的特异性抑制hPEBP4蛋白的小分子化合物，该小分子化合物具有靶向性抗肿瘤细胞hPEBP4蛋白功能、抑制肿瘤细胞生长和导致肿瘤细胞凋亡的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该小分子化合物的药物组合物，并公开了将该化合物药物用于疾病治疗的方法，特别是在恶性肿瘤的治疗中的用途。
背景技术
肿瘤是当今人类面临的第二大杀手。随着肿瘤分子生物学的发展和基因信息的解码，科学家已经揭示了大量在肿瘤发生中起作用的分子。在这基础上，肿瘤靶向治疗应运而生。靶向治疗让海量的基因数据从实验室走向临床为病人服务，成为肿瘤学研究中最为激动人心的领域之一。可以说近二十年来肿瘤治疗领域取得的最显著的进展就在于多个靶向药物的投入使用。计算机辅助药物筛选借助软件在蛋白质三维结构图上直接与化合物实现对接和筛选，不仅大大缩短了传统药物研发的周期，而且具有针对性强，生物耐受性好，起效迅速，细胞渗透性强的优点，是肿瘤靶向治疗的一支生力军。
人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)是新近发现的一个新基因。它在卵巢、乳腺、前列腺、和B淋巴系肿瘤中普遍高表达，而在正常组织未见表达。王晓健等在2004年第一次报道该基因的过表达与乳腺癌细胞抗TNF-α引起的凋亡有关，其抑制凋亡的机制和hPEBP4结合Raf-1和MEK而阻断下游信号的活化有关(Wang X等，J Biol Chem，2004，279：45855-45864)。
另有实验表明hPEBP4可能也参与抑制了TRAIL引起的前列腺癌的凋亡。肿瘤发病机制经过一百多年的探索至今尚未彻底阐明，但对凋亡信号的逃逸(“evasion of apoptosis”)参与了细胞癌变过程的观点已被广泛接受(Hanahan，D.&Weinberg，R.A.Cell，2000，100：57-70)。
既然hPEBP4只是特异性地在肿瘤细胞高表达，而且参与了肿瘤对凋亡信号的抵抗，因此针对该分子的小分子化合物可能能够取消其凋亡抑制功能，并将有可能和TNF-α等药物联用，开辟一条治疗肿瘤的新路。
目前，虽然已经开发了一些抑制肿瘤生长的化合物，然而人们仍需要开发新的具有抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞调亡活性的化合物。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种具有抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞调亡活性的化合物。本发明的另一目的就是提供所述化合物的用途。
在本发明的第一方面中，提供了化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮[3-(2-(2-hydroxy-5-nitrophenyl)-5-phenyl-1H-imidazol-4-yl)phenyl)(phenyl)methanone]、其药学、保健品学或食品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物的用途，其用于制备治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、和/或诱导肿瘤细胞调亡的物质。
在本发明的一个实施方式中，所述物质是药物组合物、保健品组合物或食品添加剂。
在本发明的另一个实施方式中，所述化合物、其药学上或保健品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物占所述物质总重量的0.001-100wt％。
在一个优选例中，所述化合物、其药学上或保健品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物占所述物质总重量的1-95wt％，优选5-90wt％，更优选10-80wt％。
在另一优选例中，所述物质仅含化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮、其药学、保健品学或食品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物。
在另一优选例中，所述组合物含有药学、保健品学或食品学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中所述化合物、其药学上或保健品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物的含量为0.05-50000mg/剂，优选0.1-10000mg/剂，更优选0.5-5000mg/剂。
在本发明的另一个实施方式中，所述的组合物还含有其它抑制肿瘤的药物。
在一个优选例中，所述其它抑制肿瘤的药物选自：致凋亡药物、肿瘤血管抑制药物或免疫调节药物，优选致凋亡药物。
在一个优选例中，所述致凋亡药物选自：肿瘤坏死因子或TRAIL，优选肿瘤坏死因子，更优选人TNF-α。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物的剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。
在本发明的另一个实施方式中，所述的肿瘤或肿瘤细胞是表达人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的肿瘤或肿瘤细胞。
在一个优选例中，所述肿瘤或肿瘤细胞选自：乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、或B淋巴系肿瘤，优选乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、或肝癌，更优选乳腺癌。
在另一优选例中，所述肿瘤或肿瘤细胞的人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4表达量高于正常细胞，优选高出30％、更优选高出50％。
在本发明的第二方面中，提供了一种组合物，所述的组合物含有：
(1)化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮、其药学、保健品学或食品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物；
(2)致凋亡药物；以及
(3)药学、保健品学、或食品学上可接受的载体或赋形剂。
在一个优选例中，所述组分(1)与组分(2)的重量比为1∶1000至1000∶1，优选1∶500-500∶1，更优选1∶100-100∶1，再优选1∶50-50∶1。
在另一个优选例中，所述组分(1)占组合物总重量的0.001-99.9wt％，优选1-95wt％，更优选5-90wt％，再优选10-80wt％。
在本发明的另一个实施方式中，所述的致凋亡药物是肿瘤坏死因子。
在一个优选例中，所述的组合物还含有选自下组的治疗剂：化疗药，如鸦胆子乳、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、双呋喃氟尿嘧啶、三尖杉酯碱、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、氟他胺、异环磷酰胺、脱氧氟尿苷、洛波铂、来屈唑或替尼泊甙等；肿瘤血管抑制药物，如血管他丁、内皮他丁等；或免疫调节药物如云芝糖肽、香菇多糖等。
在本发明的第三方面中，提供了化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮、其药学、保健品学或食品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物的用途，其用于制备人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的抑制剂。
在本发明的第四方面中，提供了一种由化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮、其药学、保健品学或食品学上可接受的盐或酯、或它们的混合物与肿瘤坏死因子构成的混合物的用途，其用于制备治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、和/或诱导肿瘤细胞调亡的组合物。
在本发明的另一方面中，提供了一种由(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮和肿瘤坏死因子构成的混合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、和/或诱导肿瘤细胞调亡的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还含有致凋亡药物，更佳地为人TNF-α。
在另一优选例中，所述的药物组合物剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤或肿瘤细胞是表达hPEBP4蛋白的肿瘤或肿瘤细胞。较佳地，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌等；更佳地，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌。
在本方面的另一方面中，提供了一种组合物，所述的组合物含有药学上可接受的载体以及(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮和致凋亡药物。
在另一优选例中，所述的致凋亡药物是肿瘤坏死因子。
在另一优选例中，所述的组合物还含有选自下组的治疗剂：鸦胆子乳、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、双呋喃氟尿嘧啶、三尖杉酯碱、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、氟他胺、异环磷酰胺、脱氧氟尿苷、洛波铂、来屈唑或替尼泊甙、血管他丁、内皮他丁、云芝糖肽、香菇多糖。
在另一优选例中，所述的(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮和致调亡药物之间重量比为1∶1000至1000∶1。
在本方面的另一方面中，提供了一种(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮的用途，用于制备人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的抑制剂。
在本方面的另一方面中，提供了一种由(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮和肿瘤坏死因子构成的混合物的用途，用于制备治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、和/或诱导肿瘤细胞调亡的组合物。
在另一优选例中，本发明所针对的肿瘤是生长过程中hPEBP4表达异常的肿瘤，如乳腺癌。
在本方面的另一方面中，提供了一种治疗肿瘤的方法，它包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用本发明的小分子化合物。
在另一优选例中，该方法还包括在施用本发明小分子化合物之前、之中或之后施用其它的肿瘤药物，尤其是肿瘤坏死因子等致调亡药物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
以下结合附图对本发明进行进一步阐述。
图1显示了DC240016和hPEBP4体外结合的表面等离子体子共振结果；
图2显示了DC240016增强TNF-α引起的细胞生长抑制，其中所用化合物浓度为5μM，TNF-α浓度为20ng/ml；
图3显示了DC240016增强TNF-α诱导的细胞凋亡，其中所用化合物浓度为5μM，TNF-α浓度为20ng/ml。
【具体实施方式】
本发明人经过广泛而深入的研究，发现部分肿瘤细胞内hPEBP4的表达往往升高，抑制hPEBP4的表达和功能可以抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤活性。为此，本发明人运用软件从数万个候选化合物中筛出了若干可能会和hPEBP4蛋白结合的小分子化合物；随后运用体外结合实验和MTT的方法对这些化合物进行了第二轮筛选，首次得到一个可以强烈增强TNF-α对乳腺癌细胞系MCF-7增殖抑制作用的化合物DC240016，即小分子化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮。在此基础上完成了本发明。
具体而言，本发明人的研究表明，hPEBP4在乳腺癌肿瘤组织中的选择性高表达，而在正常乳腺组织中未见表达，提示hPEBP4可能与肿瘤发生及生长密切相关。
在L929细胞系内，hPEBP4的过表达可明显抵制TNF-α诱导的凋亡，促进细胞生长，提示其可能是一个具有抗凋亡作用的分子。
本发明人的研究还发现，在高表达hPEBP4的乳腺癌肿瘤细胞内，抑制hPEBP4的表达可增强乳腺癌肿瘤细胞对TNF-α诱导凋亡的敏感性，抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。提示hPEBP4很可能是治疗乳腺癌的作用靶点。
本发明人的研究表明，抗凋亡作用的的分子hPEBP4在细胞生长调控、细胞凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要的作用。因此，hPEBP4很可能在临床肿瘤的诊断和治疗中作为潜在的候选靶标。
在此基础上，本发明人筛选了大量的化合物，从而获得了一种可有效抑制肿瘤的小分子化合物，所述的小分子化合物特异性地在蛋白水平靶向抗凋亡分子——hPEBP4蛋白，对表达hPEBP4的肿瘤细胞的生物学行为进行干预，从而有效抑制hPEBP4的功能，达到抗肿瘤效果。
活性成分
如本文所用，术语“本发明的小分子化合物”、“化合物DC240016”或“本发明化合物”、“本发明的(苯基)甲酮衍生物”可互换使用，都指出小分子化合物(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮及其药学上可接受的盐和活性衍生物。
(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮是一种靶向于人磷脂酰乙醇胺结合蛋白(hPEBP4)的先导化合物，其结构式如下：
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(式I)
(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮是一种已知化合物，可从商业途径购买到(如可购自从荷兰Specs公司)，也可常规的有机合成方法制备获得。
在本发明中，优选的“活性成分”指这样的小分子化合物：所述的化合物与人hPEBP4蛋白能够相互结合，并且所述的化合物与TNF-α联合可使乳腺癌MCF-7细胞的生长降低到40％以下(即降低至少60％)，优选降低到38％以下，更优选降低到35％以下，或降低到以以上数值为端点的范围之间。
如本文所用，本发明中所用的(苯基)甲酮衍生物可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)：与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、或磷酸；与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸或马来酸；以及其它盐，包括但不限于：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。一类特别优选的盐是钠盐或钾盐。
本发明还包括以酯(例如氨基甲酸酯)或其它常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)存在的本发明化合物。
本发明的小分子化合物能有效抑制人hPEBP4蛋白的功能，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。具体地，本发明的小分子化合物在分子水平针对人hPEBP4蛋白，对阳性表达人hPEBP4蛋白的肿瘤细胞的生物学行为进行逆转。实验已证明：(1)抑制hPEBP4的表达和功能可抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡；(2)体内抑制hPEBP4的表达和功能可抑制肿瘤细胞的体外致瘤性；(3)抑制hPEBP4的表达和功能可抑制肿瘤细胞体内的生长。
药物组合物
本发明还包括含有(苯基)甲酮衍生物及其药学上可接受的盐或酯的药物组合物。本发明的(苯基)甲酮衍生物及其药物组合物可用于治疗癌症肿瘤，即给哺乳动物施用安全有效量的(苯基)甲酮衍生物。
本发明化合物可与其它治疗剂联用，如致凋亡药物TNF-a、TRAIL、鸦胆子乳、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、双呋喃氟尿嘧啶、三尖杉酯碱、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、氟他胺、异环磷酰胺、脱氧氟尿苷、洛波铂、来屈唑或替尼泊甙等；肿瘤血管抑制药物血管他丁、内皮他丁等；免疫调节药物云芝糖肽、香菇多糖等，可通过抑制hPEBP来控制、缓解或治愈的疾病的治疗，例如乳腺癌等癌症。此外，本发明的化合物还可与抗肿瘤的中药(或其制剂)合用。
一种优选的药物组合物还含有致调亡药物，尤其是肿瘤坏死因子，如人肿瘤坏死因子α等。
当(苯基)甲酮衍生物或其药学上可接受的盐或酯用于治疗肿瘤时，它可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。
液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。
通常，本发明的药物组合物包括以下剂型：口服给药剂型：如片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05-5％悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)；或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05-5％助溶剂)进行非肠胃道给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合的约0.001-99.9wt％，优选0.5-99.5wt％，较佳地2.5-90wt％，更佳地5％-60wt％(重量)的活性成分((苯基)甲酮衍生物或其药学上可接受的盐或酯)，按组合物的总重量计。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。优选静脉给药方式。
本发明所用的(苯基)甲酮衍生物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
在使用本发明所述的(苯基)甲酮衍生物时，还可与其它肿瘤治疗手段(如放疗)或其它治疗剂(如TNF-α等)联用。
所用活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明化合物每天以约0.01-100mg/kg动物体重(较佳地0.02-20mg/kg体重，更佳地0.1-10mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-4次的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为5-5000mg或更高，较佳地10-1000mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物。(苯基)甲酮衍生物的静脉给药是优选的。
保健品组合物
除了制备药物组合物用于治疗肿瘤之外，在本发明中，还可将(苯基)甲酮衍生物或其保健品学上可接受的盐或酯或提取物用于制备保健品组合物，从而用于辅助治疗肿瘤。
在本发明中，保健品组合物含有安全有效量(如0.01-99wt％)的(苯基)甲酮衍生物或其保健品学上可接受的盐或酯、或提取物和保健品学上可接受的载体。
本发明的保健品组合物可与药物组合物一样含有相同含量的(苯基)甲酮衍生物或其保健品学上可接受的盐或酯或提取物。通常，保健品组合物中(苯基)甲酮衍生物的含量可略低一些，例如含0.01-50wt％(苯基)甲酮衍生物或其保健品学上可接受的盐或酯。
本发明的保健品组合物，可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式，优选的是片剂、口服液、颗粒剂和胶囊制剂。
食品添加剂
除了制备药物组合物用于治疗肿瘤之外和作为保健品组合物用于辅助治疗肿瘤以外，在本发明中，还可将(苯基)甲酮衍生物或其食品学上可接受的盐或酯或提取物用于制备食品添加剂，从而用于加入食品中，提高对象的抗肿瘤能力并辅助治疗肿瘤。
在本发明中，食品添加剂可含有安全有效量(如0.01-99wt％)的(苯基)甲酮衍生物或其食品学学上可接受的盐或酯或提取物，和食品学上可接受的载体。
本发明的食品添加剂可与药物组合物或保健品组合物一样含有相同含量的(苯基)甲酮衍生物或其食品学上可接受的盐或酯或提取物。通常，食品添加剂中(苯基)甲酮衍生物的含量可低于保健品中的含量，例如含0.01-50wt％(苯基)甲酮衍生物或其食品学上可接受的盐或酯。
此外，在适当的情况下，将本发明的(苯基)甲酮衍生物或其食品学上可接受的盐或酯或提取物直接作为食品添加剂使用也是可行的，只要它们不会影响食品的口味和/或外观。
本发明的食品添加剂，可以通过常规方法制成任何常规的形式，例如溶液、粉末、糖浆等。
本发明的主要优点在于：
(a)本发明针对人hPEBP4蛋白的结构所设计的小分子化合物，可有效靶向抑制抗凋亡分子——hPEBP4蛋白，从而用于癌症治疗；
(b)本发明的小分子化合物还可以与其它药物和治疗手段联合，用于恶性肿瘤的治疗。
(c)本发明的小分子化合物具有渗透性好，毒副作用小，结构简单，易于合成等优点。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
细胞系
MCF-7细胞系：ATCC：HTB-22(购自ATCC)，这是一种阳性表达hPEBP4的乳腺癌肿瘤细胞系。
MCF-7细胞系的培养方法如下：将细胞接种于含10％小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培养液中，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO
2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。
实施例1.小分子化合物(DC240016)的筛选
采用计算机辅助的虚拟筛选方法进行。
首先，用生物信息学的方法，利用计算机软件(所述软件为Modeller8.0)建立hPEBP4的三维结构模型。然后，用DOCK 4.0软件(美国Kuntz实验室)对购自荷兰Specs公司的化合物库(约28万个化合物)进行筛选，根据打分选取最好的8700个。
1.继续使用Flex X软件(购自BioSolveIT公司)进行对接，根据Flex X打分取前600个。接着，使用市售的autodock 3.05软件(美国Scripps大学奥尔森实验室)以Flex X对接的构象为起始构象进行对接。对接的结果结合类药性(druglikeness)分析和肉眼观察除去多余的相似化合物和明显不合理的，最后选取100个化合物。
其中，DC240016小分子化合物结构式如式I所示，即(3-(2-(2-羟基-5-硝基苯)-5-苯基-1氢-咪唑-4-基)苯基)(苯基)甲酮：
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(式I)
实施例2.小分子化合物(DC240016)与靶标hPEBP4蛋白的体外结合实验
对于选出的DC240016(购自荷兰Specs公司)，通过基于表面等离子体子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术的Biacore 3000仪器(Amersham公司)，实时跟踪生物分子间的相互作用。
结果证实DC240016与hPEBP4在体外有结合，图1所示为DC240016的hPEBP4体外结合曲线。
由分析软件计算出来得到其解离常数R＝10e-6。
实施例3.小分子化合物(DC240016)对肿瘤细胞的生长抑制
本实施例采用了常规的MTT法。具体方法如下：
将MCF-7细胞以3000个细胞/孔的密度铺96孔板培养过夜。然后，把小分子化合物DC240016以不同浓度(1.25、2.5、5、10、25、50μM)单独或与20ng/ml终浓度的人TNF-α联合加入孔中。44小时后，在每孔中加入MTT(5mg/ml)10μl，37摄氏度孵育4小时后吸弃上清。用150μl二甲基亚砜溶解紫色结晶后，置于酶标仪(Bio-Rad公司Model 680)，检测570nm处的吸光度。
结果显示，DC240016可以在5μM终浓度显著增强TNF-α(20ng/ml)对细胞增殖的抑制，而其单独应用未对细胞造成显著的毒性作用(图2)。
实施例4.DC240016化合物对TNF-α杀伤肿瘤细胞的增强效应的检测
将乳腺癌细胞系MCF-7细胞以30000个/孔的密度铺到24孔板中，孵育16-24小时后，加入DC240016至终浓度5μM。4小时后，再加入TNF-α至终浓度20ng/ml或50ng/ml。作用48小时后，用荧光染料罗丹明123(R-123)和碘化丙锭(PI，Invitrogen公司)标记凋亡细胞后用流式细胞仪(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)检测。R-123/PI双阴性的细胞代表了早期凋亡的细胞，R-123阴性而PI阳性的细胞代表晚期凋亡和死亡的细胞。
结果如图3所示：联用了TNF-α(20ng/ml)和DC240016(5μM)的细胞凋亡率(约45％)显著性高于单独用TNF-α的细胞(约14％)。此外，与MTT结果一致：单独应用化合物并未引起显著的细胞的凋亡(6％)。
本发明的化合物可特异性抑制人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)，因此可用于治疗高表达该蛋白的肿瘤，如乳腺癌。本发明上述的实施例的结果表明，本发明化合物可稳定地抑制hPEBP4，协同TNF-α杀伤肿瘤细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。