蛹虫草等虫草的人工培养方法 本发明属于真菌培养领域。特别是关于稳定、连续、批量地培养日本棒束孢(Isaria japonica Yasuda)、虫花棒束孢(Isaria farinosa(Hol.)Fr.)、蛹虫草(Cordyceps militaris(L)Link)以及高雄山虫草(Cordycepstakaomontana(Yakushiji et Kumazawa))(以下统称“虫草”)的方法。
蛹虫草，自古以来就是中国的珍贵中药。近年来的大量研究表明，它还具有抗癌等重要的药用价值。此外，日本的学者通过研究发现，作为虫草属真菌之一的日本棒束孢和虫花棒束孢，也同样具有着增强免疫及抗癌的功能。因此，这些虫草在日本受到了人们的极大关注。
但是，由于这些虫草的野生量有限，且采集困难，所以人们早就开始了人工培养方面的研究。其中，在日本提出的方法有：
一、将“冬虫夏草”地菌丝或子座孢子接种在既成食品的大蒜、酱油及砂糖的灭菌液体培养基上，或者将该液体培养基附着在大米、麦子及玉米等谷物或蚕、蝉等节肢动物昆虫类的成虫、蛹及幼虫上进行固体培养的方法(日本专利、特開昭54-80486号公報)。
二、将“冬虫夏草”的菌丝体接种到由糖类、蛋白质类、维生素类及核酸类等其中的一种或数种物质为主要成分、并在其内加入谷物类而形成的立体固状培养基上进行培养，然后再将在该立体固状培养基上培养成的菌丝移植到由糖类、蛋白质类、维生素类及核酸类等其中的一种或数种物质为主要成分、并在其内加入氨基酸类的一种或数种物质、以水为基质PH值为4.0～7.0的液体培养基上进行静置培养，在液体培养基的表面形成菌座的培养的方法(日本专利、特公昭6153033号公報)。
三、将“冬虫夏草”的菌丝体直接接种在活着的昆虫上、或者含有三分之一量的昆虫组织体的琼脂纯粹分离培养基上的方法。这里所使用的活昆虫是吐丝前的蚕(日本专利、特開昭62-107725号公報)。
四、将在野外采集到的“冬虫夏草”，用琼脂培养基、液体培养基繁殖其菌丝和分生孢子，最后在野外进行大规模的栽培方法(日本专利、特開平6-233627号公報)。
五、以鳞翅目昆虫为“冬虫夏草”菌的寄主，特别是使用自然状态的地蚕蛾和蚕蛾类的方法(日本专利、特開平8-75号公報；特開平8-172903号公報)。
在上述培养的方法中，第三种方法的发明人指出了自己的第二种方法中的缺陷，即使用昆虫以外的成分为培养基，会出现药理活性减退的问题，作为连续的培养方法并非理想，同时提出了用与自然界中相同的活着的昆虫本体作培养基的方法。一般来讲，野外昆虫的体表和体内存在着各种杂菌，会降低虫草菌的感染率，所以第三种方法同样也不可能稳定地提供同一菌种。而上述的第四种方法中的野外栽培方式，也很难排除杂菌的感染，难以进行稳定的连续生产。同时，胞子的飞散还会给自然界造成影响。
在中国，至今也提出了很多人工培养的方法。其中，具有代表性的是中国专利CN1092105A。该专利申请在指出了专利CN1034390A中所存在的缺陷之后，提出了以桑叶育蚕蛹作为寄主，将蛹虫草菌液注入蛹体内，待蚕蛹僵硬后用煤渣等多孔材料覆盖其上，形成子实体的方法。
该方法由于使用的是桑叶育的蚕蛹，因此附着在桑叶以及蚕具上的杂菌，很容易使蚕蛹受到感染，从而引发蚕蛹的败血病。而将煤渣等多孔材料覆盖在蚕蛹上，又会给子实体收获的分离工作带来麻烦。此外，因受桑叶的季节限制，全年稳定、连续地提供蚕蛹将很困难。
在日本目前缫丝后的蚕蛹经洗净、烘干用作家畜饲料。但在洗净过程中所产生的清洗废液流入河川，引起了污染。因此如何妥善地处理缫丝后的废蛹已成了亟待解决的问题。
本发明的目的就在于要克服上述技术的不足，提出一个防止药理活性减退，提高虫草菌的感染率，并能稳定、连续、批量地生产虫草的方法。为此，提出了用以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养方法提供生产所需的孢子增殖源；以无菌蚕蛹作寄主进行继代培养的方法。现就具体内容说明如下：
本发明中所指的虫草，包括完全型的Cordyceps属和不完全型的Isaria属。将在野外采集到的天然成熟的虫草，用琼脂培养基按常法进行分离纯化，选出菌种。
一、以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养方法
作为液体培养基的成分所使用的蚕蛹，可以是吐丝后的活蛹，也可以是将茧干燥后的干燥蛹，或者是缫丝后的蛹。缫丝后的蛹中，除了含有60％的粗蛋白质及9％的氮元素外，还含有很多虫草发育所需要的无机盐、糖原等的营养成分。蛹可以不经处理直接使用，但将干燥的蛹粉碎后再进行抽出，效果则更好。
蚕蛹组成成分的抽出方法，有煮和使用高压灭菌器的方法。在沸腾以下的温度抽出时，可采用煮的方法。使用高于100℃的温度抽出时，可以使用高压灭菌器，这样能在短时间内抽出蛹的有效成分。抽出时蛹和水的比例为1∶2～5，用作培养液时，将此抽出液再用水稀释5～10倍。若不进行稀释，也可以直接用蛹的10～50倍的水进行抽出。如使用煮的方法，还要补加因蒸发而失去的水量。
在上述的蛹抽出液内，根据虫草的不同，需要加入适量的碳水化合物、氨基酸、无机元素以及维生素等物质。其添加量约为蛹抽出液的2～8％。作为碳水化合物的有：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等；作为无机元素的有：磷、钙、钾、钠、镁等。最后将配好的液体装瓶高温灭菌，待自然冷却后，即为液体培养基。
除了上述的抽出方法以外，还有将干燥蛹粉碎后灭菌，不经加热抽出，仅在其内加入灭菌水，即为液体培养基的方法。同样，根据虫草的不同，加入适量的碳水化合物、氨基酸类、无机盐类以及维生素类等营养物质，效果则更好。
在上述的液体培养基上，接种分离菌株。培养温度为15℃～25℃，湿度为75％～95％，自然光下进行。
以上仅对液体培养基作了说明，这对加入琼脂的固体培养基也同样适用。
二、以无菌蚕的蚕蛹作为培养基的培养方法
本发明中所说的无菌蚕，主要是指排除了引起蚕发病的主要病原体的蚕。通常采用人工饲料无菌养蚕法可以得到。即将蚕卵的表面消毒，在无菌的蚁蚕上，投放蒸煮灭菌后的饲料，并在无菌装置内进行饲养。当然，用其他方法得到的不含有病原体的蚕也可视为无菌蚕。
而用来作培养基的，是按上述方法饲养的蚕化蛹后的蛹(以下简称无菌蛹)。其中以复眼着色前的初化蛹为最理想。将菌株直接接种在蛹体上，在温度为15℃～25℃，湿度为75％～95％，自然光下培养。
以下结合具体的实施例作进一步的说明。
实施例1
用蛹抽出液为主要成分的液体培养基人工培养日本棒束孢。蛹抽出液是用干燥蛹的5倍量的沸腾水，煮2小时后得到的。然后，将此抽出液再稀释5倍制成液体培养基，在该培养基上接种日本棒束孢菌。接种2～3日后在液体培养基上开始形成菌丝，一周后形成菌丝层，两周后开始出现子座原基。45～60日后形成4～8厘米的子实体并成熟。培养温度为15℃～25℃、湿度为75％～95％、自然光照下进行。此外，在蛹抽出液内加入适量的葡萄糖和无机元素后，与不添加的相比子实体苗壮色艳。
用同样的方法，对虫花棒束孢也进行了培养。将虫花草棒束孢分离菌株接种3日后，开始形成白菌丝，11日后开始出现子座原基。45～50日后形成2～3厘米的细的子实体、呈淡黄色。此外，在该蛹抽出液内加入碳水化合物后，子实体可生长到3～4厘米，呈淡褐色，色泽鲜艳。
实施例2
回收上述方法得到的日本棒束孢孢子、制成菌液，接种在无菌蛹上。接种2～3日后蚕体变硬，从蛹体表的关节膜、气门处开始长出菌丝，感染率在99.5％以上。12～13日后出现子座原基，30～50日后形成5～7.5厘米长的子实体并成熟。此外，花草棒束孢也得到了相似的结果。
对用上述方法所得到的日本棒束孢的成分进行了分析，其结果如表1所示。作为比较例使用了中国西藏产的干燥后的冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk)Sacc)。对被认为具有抗癌效果和增强免疫功能的硒元素、β-葡聚糖和麦角甾醇进行了分析。
实施例3
比较了蛹虫草菌对无菌蛹和桑叶育蛹的感染率。将蛹虫草菌直接接种在无菌蛹和桑叶育蛹的蛹体上，培养条件与实施例1相同，其感染结果如表2所示。其中，无菌蛹的感染率非常高，接近100％，并形成了子实体。而桑叶育蛹的杂菌感染率却高达85％。通过分析认为这些杂菌主要是来源于桑叶和蚕具上的细菌，在上述的湿度温度条件下引起了蚕蛹的败血症。
实施例4
对人工饲料无菌养蚕法得到的熟蚕和无菌蛹接种，作了比较试验。使用的菌种为高雄山虫草菌，培养条件与实施例1相同，其结果是无菌蛹的感染率为100％，子实体形成率为97％。接种15日后开始出现子座原基，40～50日后形成子实体并成熟。子实体为棍棒形、呈淡黄色，平均高为5厘米左右。而熟蚕的感染率为80％，子实体形成率为66％，接种18日后开始出现子座原基，但60日后的子实体也仅为2厘米左右。
用同样的方法，对蛹虫草菌也进行了试验。其结果是无菌蛹的感染率为100％，子实体的形成率为99.5％。而熟蚕的感染率为82％，子实体的形成率为74％。
实施例5
对液体培养基中的蛹抽出液，作了抽出温度和时间的试验。在每单位的蛹中加入其5倍量的水加热抽出，然后将该抽出液再用8倍的水稀释，制成液体培养基。使用日本棒束孢菌的结果如表3所示。可以看出抽出温度为100℃、抽出时间在2小时以上的试验区的结果较好，5小时以上的区最理想。抽出温度高于100℃时，抽出时间至少需10分钟以上，其中以20分钟以上的区最理想。
实施例6
对缫丝后的湿蛹也作了抽出温度和时间的比较。在每单位的蛹中加入其3倍量的水加热抽出。然后将该抽出液再用2倍的水稀释，制成液体培养基。使用日本棒束孢菌的结果如表4所示。可以看出在抽出温度为100℃时、抽出时间为1～4小时、107℃时30～60分、120℃时20～40分的范围内，日本棒束孢的感染率均为100％，子实体的形成率达到98％以上，45～60日后形成4～8cm的子实体。
实施例7
在蛹的组成成分的抽出方法中，对干燥蛹里加水煮的方法、将蛹粉碎后再加水煮的方法、以及粉碎蛹里加水的方法进行了比较。
用煮的方法抽出时、是在每一单位的干燥蛹里加入其5倍量的水，热水抽出。然后将抽出液再用8倍的水稀释，制成液体培养基。粉碎蛹中加水的方法是先将蛹粉碎后，再高压灭菌，在灭菌蛹中加入蛹的40倍重的无菌水，即为液体培养基。培养方法等与实施例1相同。
结果表明，上述的每种方法都能形成良好的子实体，但以粉碎蛹里加无菌水的方法为最好，而用将干燥蛹粉碎后再煮的方法比直接煮干燥整蛹的方法所得到的结果好。
人工饲料无菌养蚕可以不受季节的限制，进行工厂化的高密度养蚕，目前在日本所进行的工厂养蚕中，每天都能获得一定数量的蚕蛹。以无菌蚕蛹作为寄主生产虫草的方法，可以防止杂菌的繁殖，提高虫草菌的感染率。该方法同野外栽培方式相比，一年中会获得其数万倍的产量。而且，在相同的空间、时间内所取得的效果，也是其他方法所不能比拟的。本发明中的液体培养方法，可以利用缲丝后的蚕蛹来降低虫草的生产成本，同时解决了药理活性减退的问题。按照本发明生产出的虫草可以直接进行干燥或制成干粉，也可以根据需要抽出其有效成分，提供高纯度的产品。此外，还可以从子实体的残渣及培养液中抽出有效的代谢成分。[表1]日本棒束胞和冬虫夏草的成分比较 分析项目 日本棒束胞 冬虫夏草 分析方法 硒 0.54ppm 0.06ppm萤光光度法 β-葡聚糖 5.1％ 10.5％ 酵素法 麦角甾醇 968mg/100g 311mg/100g HPLC法[表2]无菌蚕蛹和桑育蚕蛹对蛹虫草菌的感染蚕蛹试验蚕数对蛹虫草菌的感染数杂菌感染数 其他无菌蚕蛹 2000 1998 1 1桑育蚕蛹 1000 148 850 2[表3]蚕蛹的不同温度和时间的抽出对日本棒束孢成长的影响温℃ 时间 菌的感染 率(％)子实体形成率(％)干燥后的重量比(％)※ 子实体 的状态80 2小时 100 31.0 67 × 4小时 100 42.5 66 × 6小时 100 96.1 81 ◎ 8小时 100 92.9 68 △100 1小时 100 31.0 65 × 2小时 100 54.5 73 △ 3小时 100 89.0 72 △ 4小时 100 90.0 75 ○ 5小时 100 93.3 91 ◎ 6小时 100 93.3 88 ◎ 7小时 100 90.6 95 ◎107 10分 100 88.8 79 ○ 20分 100 90.2 87 ○ 40分 100 96.0 90 ◎ 60分 100 90.3 98 ◎ 90分 100 91.9 96 ◎ 120分 100 93.7 97 ◎120 5分 100 90.0 79 ○ 10分 100 90.0 83 ○ 20分 100 92.7 99 ◎ 30分 100 93.7 96 ◎ 40分 100 93.7 95 ◎ 60分 100 94.6 100 ◎ 90分 100 95.2 98 ◎※干燥后的重量比是将各试验区的菌丝体和子实体干燥后，以最重的区(120℃60分)为100，而求出的百分比。注：子实体的状态 平均高为7cm以上时为 ◎
4～6cm ○
2～4cm △
2cm以下时为 ×。[表4]缫丝后的蛹的不同温度和时间的抽出
对日本棒束孢成长的影响温度℃ 时间 菌的感染 率(％) 子实体的 形成率(％)子实体的状态100 1小时 100 99.2 ○ 2.5小时 100 97.3 ◎ 4小时 100 98.5 ◎107 10分 100 83.3 △ 20分 100 87.2 △ 30分 100 98.0 ◎ 40分 100 97.7 ◎ 50分 100 97.6 ◎ 60分 100 99.3 ◎120 10分 100 85.4 △ 20分 100 96.8 ◎ 30分 100 97.9 ◎ 40分 100 98.6 ◎ 50分 100 99.0 ○ 60分 100 99.0 ○注：子实体的状态平均为7cm以上时为 ◎
4～6cm ○
2～4cm △
2cm以下时为 ×。