一种禽流感疫苗及其制备方法.pdf

本发明属于基因工程疫苗技术领域，涉及一种病毒疫苗，具体涉及一种禽流感病毒疫苗及其制备方法，为了解决现有禽流感HA抗原疫苗难以口服或口服效果不佳的问题，本发明提供了一种禽流感病毒疫苗及其制备方法，该疫苗为口服剂，其有效成分包括固定成分及选择性加入成分，所述固定成分为HA抗原及由两亲性物质及辅助油制剂组成的油制剂，同时为了便于实施本发明，本发明还提供了一种制备禽流感疫苗的方法。

1.  一种禽流感疫苗，所述禽流感疫苗的有效成分包括固定成分及选择性加入成分，所述固定成分为HA抗原，其特征在于禽流感疫苗为口服剂，固定成分还包括油制剂，所述油制剂包括两亲性物质及辅助油制剂。

2.  根据权利要求1所述的一种禽流感疫苗，其特征在于所述辅助油制剂包括矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯，所述两亲性物质至少包括甘油磷脂类或鞘氨醇磷脂中的一种。

3.  根据权利要求1所述的一种禽流感疫苗，其特征在于所述选择性加入成分包括重组霍乱霉素B亚单位(rCTB)佐剂。

4.  一种权利要求1或2或3所述禽流感疫苗的制备方法，包括HA抗原的制备以及禽流感疫苗的制备，所述禽流感疫苗的制备包括：
①、将两亲性物质经超声处理分散在蒸馏水中，得到第一溶液；
②、向第一溶液中加入HA抗原或者由HA抗原和选择性加入成分构成的加入成分，从而得到第一混合物；
③、将第一混合物真空冻干，形成冻干粉，并向冻干粉中加入辅助油制剂得到第二混合物；
④、将第二混合物在室温下搅拌混合，直至变成清澈溶液，从而得到禽流感疫苗。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述HA抗原的制备包括重组杆状病毒的构建以及在重组杆状病毒的外壳制备HA抗原，所述重组杆状病毒的构建包括：
a、将含有白斑症病毒(WSSV)iel启动子的HA表达盒通过插入穿梭载体并与杆状病毒的基因组整合得到含重组杆状病毒基因组的重组质粒；
b、将a步骤得到的重组质粒转染昆虫动物细胞，培养分离该昆虫动物细胞得到重组杆状病毒。

一种禽流感疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，涉及一种病毒疫苗，具体涉及一种禽流感病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
流感是由流感病毒引起的一种严重威胁人类健康的传染病，是引起人类死亡的主要病原之一。1918年西班牙流感大流行曾夺去2000万人的生命；其后人类又遭受3次流感大流行，许多人丧命。而每年的小流行也不可小视，全世界每年由于流感病毒感染而死亡的人数超过50万。流感病毒也在动物中广泛存在，能引起猪、鸡、马等动物流感流行，导致动物大量死亡，造成巨大经济损失。从1997年开始在香港出现的一种新的H5N1型禽流感，到目前为止已有数百人死于H5N1型禽流感。疫苗是目前预防流感最普遍切有效的方法。
禽流感病毒属正黏病毒科，流感病毒属。根据抗原性的不同，可分为A、B、C三型。A型流感病毒可见于人类、多种禽类、猪和马及其他哺乳动物，B型和C型一般只见于人类。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性，将A型流感病毒分成不同的亚型。目前，有15种特异的HA亚型和9种特异的NA亚型。其中HA是病毒表面最多的糖蛋白，也是变异最大的基因，HA与宿主细胞表面受体的唾液酸残基末端的结合，可以调节病毒和细胞膜的融合，HA还是病毒主要的保护性抗原抗HA的抗体对病毒的感染具有中和作用。
然而现有技术中，大部分禽流感疫苗均以注射方式接种，接种复杂，顺应性低，如果能够将制得的包含HA抗原的疫苗直接以口服的方式接种，将是非常可取和方便的，因为，采用口服的方式接种疫苗即允许非侵入性自主接种，从而使激发包括肺部、呼吸道、肠道以及泌尿生殖系统在内的粘膜免疫系统成了可能，使疫苗的免疫效果更有效。然而将传统抗原疫苗进行口服直接接种并不是一个可取的办法，这是因为口服接种的疫苗在经过胃肠道时会遭到肠胃内环境的破坏，使疫苗失效，并最终导致口服耐受的发生或者需要更多剂量的疫苗来完成口服疫苗的接种工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有禽流感HA抗原疫苗难以口服或口服效果不佳的问题，并针对该问题提供一种禽流感疫苗。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
一种禽流感疫苗，所述禽流感疫苗的有效成分包括固定成分及选择性加入成分，所述固定成分为HA抗原，禽流感疫苗为口服剂，固定成分还包括油制剂，所述油制剂包括两亲性物质及辅助添加剂。
本发明所提到的禽流感疫苗正是基于对上述现有技术的改进，提出了一种新的抗原油载体，该载体为两亲性物质，即同时具有亲水性和亲油性，本发明所述的两亲性物质的分子中具有至少一个用于包裹HA抗原的两亲鞘，从而在本发明所述禽流感疫苗中，每个两亲鞘均与HA抗原建立一个类似反胶束的结构，由此，HA抗原即可在疫苗进入人体肠胃时，与肠胃内环境隔绝，使HA抗原顺利到达全身，从而被巨噬细胞摄取和处理。
同时为了配合两亲性物质作用的发挥，应当将禽流感疫苗制成油制剂口服疫苗，也即该疫苗必须无水，这样就使疫苗中有关的蛋白质变性和相分离等问题微乎其微，所以本发明所述油制剂还应当包括辅助油制剂，另外，利用包含的两亲性物质，油制剂可以自乳化，服食后，即可分裂成小液滴，容易通过淋巴管分散，从而减少服用疫苗后身体所产生的局部不良反应的发生。
所述两亲性物质，进一步的，至少包括甘油磷脂类(如磷脂酰胆碱)或鞘氨醇磷脂中的一种。
所述辅助油制剂可以是由矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯所组成的组成油。
正如本发明在对疫苗口服所能得到的益处讲到的一样，疫苗口服使激发包括肺部、呼吸道、肠道以及泌尿生殖系统在内的粘膜免疫系统成了可能，但在临床上，单独口服抗原并不能有效的激发粘膜免疫系统，从而不能保证人体在通过疫苗接种后获得长期有效的免疫力。在本发明之前，一些化学制剂通常也可以被用来提高人体的免疫反应，但事实上，大部分已经被证明是无效的。
基于这一点，本发明所述禽流感疫苗还包括选择性加入成分，该成分为重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)佐剂，该佐剂可以充分提高抗原特异性IgA的抗体反应，并且rCTB安全无毒，容易获准用于人体使用。
为了使本发明易于实施，本发明还提供了制备禽流感疫苗的方法，该方法包括HA抗原的制备以及禽流感疫苗的制备，所述禽流感疫苗的制备包括：
①、将两亲性物质经超声处理分散在蒸馏水中，得到第一溶液；
②、向第一溶液中加入HA抗原或者由HA抗原和选择性加入成分构成的加入成分，从而得到第一混合物；
③、将第一混合物真空冻干，形成冻干粉，并向冻干粉中加入辅助油制剂得到第二混合物；
④、将第二混合物在室温下搅拌混合，直至变成清澈溶液，从而得到禽流感疫苗。
所述HA抗原的制备可以采用现有方法进行，例如：
(1).接种鸡胚扩增病毒，通过收集尿囊液、差速离心浓缩的办法获得粗制病毒抗原，但该方法获得的抗原纯度不高，制备抗体针对性不强，需通过血凝、血抑等试验进一步筛选；
(2).通过基因工程技术，构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达，但原核表达缺乏翻译后加工系统，对表达的蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰，且有报道表明血凝素基因表达产物对大肠杆菌有毒性，无法保证蛋白的活性和满足大量生产的需要；
(3).构建真核表达载体并通过转染剂诱导或电转染的方法，转染真核细胞，获得瞬时表达，但是瞬时转染的方法也不适用于大量抗原制备，同时容易受到转染试剂、细胞状态等试验因素的影响；
(4).通过构建能够表达血凝素抗原的重组禽痘病毒载体，制备禽痘疫苗，虽然对禽类显示出较好的攻毒保护性，但不可能通过该方法获取大量血凝素抗原；
(5).将血凝素抗原在转基因马铃薯和枯草杆菌中表达，但显示出较低的表达量。
为了克服现有制备禽流感HA抗原的方法不能大量生产高纯度高生物活性的HA抗原，本发明在制备HA抗原时，采用了不同的技术方案，即所述HA抗原的制备包括重组杆状病毒的构建以及在重组杆状病毒的外壳制备HA抗原，所述重组杆状病毒的构建包括：
1、将含有白斑症病毒(WSSV)ie1启动子的HA表达盒通过插入穿梭载体并与杆状病毒的基因组整合得到含重组杆状病毒基因组的重组质粒；
2、将1步骤得到的重组质粒转染昆虫动物细胞，培养分离该昆虫动物细胞得到重组杆状病毒。
在制备HA抗原的过程中，本发明首先构建了包含白斑症病毒(WSSV)ie1启动子的表达载体表达H5N1禽流感病毒HA抗原的重组杆状病毒，所使用的(WSSV)ie1启动子已经在Microarray and RT-PCR screening for white spotsyndrome virus immediate-early genes in cycloheximide-treated shrimp，(Virology，334(2)，327-341(2005))中有所报道，本发明研究发现在WSSV ie1启动子的帮助下，重组杆状病毒能够高效率的生产HA抗原，同时所得到的HA抗原具有高生物活性。
另一方面，利用杆状病毒昆虫细胞表达系统生产流感疫苗是具有众多优点的，例如不需要在开发，制造，或管理中使用任何活流感病毒，从而提高疫苗的安全性。
又如，作为一种替代传统的鸡蛋为基础和哺乳动物细胞生产流感疫苗的方法，利用重组杆状病毒生产疫苗采用无血清悬浮培养昆虫细胞，简化培养和纯化程序，而且不需要进行灭活，通过重组杆状病毒制备的HA抗原也可以维持蛋白质天然构象，在宿主体内引发的更好的免疫反应。
此外，重组杆状病毒可以使循环病毒和疫苗抗原完全一致。作为一个DNA病毒，经过几代的扩增后，重组杆状病毒基因组仍然是稳定的，而流感病毒经常受到抗原变化和漂移。这一特点使重组杆状病毒高质量可靠的大规模生产流感疫苗成为现实。由于技术人员可灵活构建重组杆状病毒转移载体，杆状病毒载体可任意构建任意组合的流感蛋白质抗原。
得到的重组杆状病毒用于制备HA抗原，使用重组杆状病毒表面展示技术可以在杆状病毒外壳制备大量复杂抗原蛋白，并且保持蛋白的天然抗原性构象，良好的稳定性可以使通过表面展示技术制备的抗原蛋白在人体内的半衰期较普通抗原蛋白更长。
同时相比于通过其它重组杆状病毒策略在昆虫细胞内表达HA抗原这一手段来制备HA抗原，使用本发明所述重组杆状病毒表面展示技术制备HA抗原不存在HA抗原的纯化难题，而且得到的HA抗原纯度也比前者高。
需要说明的是，本发明也可以使用表达HA抗原的重组杆状病毒本身作为禽流感疫苗。
附图说明
图1是实施例1中口服免疫抗体测量实验所得到的血清血凝抑制滴度的结果(V表示油制剂，BacHA表示本发明制得的疫苗用HA抗原)；
图2是实施例1中口服免疫抗体测量实验所得到的H5HA抗原特异血清IgG滴度的结果(V表示油制剂，BacHA表示本发明制得的疫苗用HA抗原)；
图3是实施例1中口服免疫抗体测量实验所得到的H5HA抗原特异粘膜IgA水平结果(V表示油制剂，BacHA表示本发明制得的疫苗用HA抗原)。
具体实施方式
HA抗原的制备方法包括重组杆状病毒的构建以及在重组杆状病毒的外壳制备HA抗原，该方法以流行范围广致病能力强的H5N1禽流感病毒血凝素H5抗原作为靶标，选用杆状病毒昆虫细胞真核表达系统，生产用于疫苗的HA抗原，所述重组杆状病毒的构建包括：
a、将含有白斑症病毒(WSSV)ie1启动子的HA表达盒通过插入穿梭载体并与杆状病毒的基因组整合得到含重组杆状病毒基因组的重组质粒；
b、将a步骤得到的重组质粒转染昆虫动物细胞，培养分离该昆虫动物细胞得到重组杆状病毒。
其中a步骤可以根据Bac-To-Bac系统操作手册的指导进行操作，作为一种优选，a步骤中的内杆状病毒为DH10BAC^TM，所述穿梭载体为pFastBac1，而b步骤中的昆虫动物细胞可以为SF9细胞。
b步骤所述的培养分离可以采用常规的方法进行，例如a步骤得到的重组质粒转染昆虫动物细胞后，培养经过重组质粒感染的昆虫动物细胞，经过一定时间后，获取含有重组杆状病毒的上清，对上清进行离心。
测量离心后的产物的病毒滴度，用于疫苗的HA抗原由血凝滴度(HA)为log2⁸的病毒表达制备。
所述重组杆状病毒的HA基因部分由H5N1流感病毒的印度尼西亚菌株的HA部分扩增而来。作为一种优选，可以选用CDC/669/印度尼西亚/06或CDC/594/印度尼西亚/06，以获得的两种不同亚型(669clade 2.1.2及594clade2.1.3)
实施例1
1.禽流感疫苗的制备
1.1、重组杆状病毒的构建
从两种不同H5N1流感印度尼西亚病毒株(CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/Indonesia/06)扩增获得到HA基因全长开放表达盒，利用引物WSSVie1F-5′-CCTACGTATCAATTTTATGTGGCTAATGGAGA-3′和WSSVie1R-5′-CGCGTCGACCTTGAGTGGAGAGAGAGCTAGTTATAA-3′从WSSV DNA扩增得到Ie1启动子。
原始杆状病毒转染载体pFASTBac1(也即穿梭载体，购自美国Invitrogen公司)先进行了如下修饰：删除多角蛋白启动子系列，包括His标签、ATG、RsrII与HindIII限制性内切酶多克隆位点，然后pFASTBac1通过HA表达盒上的AccI和RsrII限制位点插入，从而使扩增的HA基因位于pFASTBac1载体SV40终止子上游和WSSVie1启动子下游，形成构建物。
根据Bac-To-Bac系统实验手册，通过定点转座将构建物整合进入DH10Bac^TM(购自美国Invitrogen公司)的杆状病毒基因组，得到含重组杆状病毒基因组的重组质粒，然后将该质粒感染200mi细胞密度为2×10⁶cells/ml Sf9细胞，并使复合感染率(MOI)为0.5，使用SF-900II SFM(购自美国Gibco BRL公司)培养基，27℃条件下扩增重组杆状病毒。
扩增得到的重组杆状病毒释放至培养基中，收集4dpi时的成熟病毒颗粒，并对收集得到的成熟病毒颗粒用0.22μm滤器过滤，利用噬菌斑方法测定病毒滴度，病毒储液4℃保存。
重组杆状病毒大量扩增，通过两轮蔗糖梯度离心收集病毒，实验按照标准方法进行(O′Reilly et al.，1992)。
利用单一反射免疫扩散方法(SRID)测定重组杆状病毒HA含量，疫苗按照log2⁸血凝集滴度(HA)制备。
1.2、口服油制剂疫苗的制备
在2-8℃下，用探头超声将两亲性磷脂酰胆碱超声10min，并将其分散在蒸馏水中，形成的溶液浓度为100mg/ml。将100μl该溶液加入2ml带螺帽玻璃小瓶，然后单独加入来自重组杆状病毒的150μg HA蛋白(来自CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/Indonesia/06 H5HA各75μg)，得到的第一混合物在4℃下真空冻干过夜，得到冻干粉；
将1ml由矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯所组成的辅助油制剂，其中矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯的体积比为3∶1∶1∶2∶1。
添加到冻干粉，在室温下搅拌混合，直至变成清澈溶液，即为口服油制剂疫苗，疫苗-20℃储藏备用。
口服油制剂疫苗也可以这样制备：
在2-8℃下，用探头超声将两亲性磷脂酰胆碱超声10min将其分散在蒸馏水中，浓度为100mg/ml。将100μl该溶液加入2ml带螺帽玻璃小瓶。然后加入来自重组杆状病毒的150μg HA蛋白(来自CDC/669/Indonesia/06和CDC/594/Indonesia/06H5HA各75μg)和100μg rCTB，得到的第一混合物在4℃下真空冻干过夜，得到冻干粉；
将1ml由矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯所组成的辅助油制剂
添加到冻干粉，在室温下搅拌混合，直至变成清澈溶液，即为口服油制剂疫苗，疫苗-20℃储藏备用。
所述重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)由上海联合赛尔生物工程有限公司提供。
2.禽流感疫苗的免疫性实验
所有活病毒实验均在符合疾病预防控制中心/美国国立卫生研究院和世界卫生组织建议的生物安全3级(BSL-3)实验室进行。
2.1、1.0高致病性禽流感H5N1型病毒的扩增
对于本实施例所述疫苗的效果用1.0高致病性禽流感H5N1型流感毒株进行宿主挑战实验来评价，该病毒是由下列方法扩增得到：
H5N1A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因序列信息来源NCBI流感数据库，由美国GenScript合成，将合成的HA和NA基因克隆到双启动子质粒，用于甲型流行性感冒反向遗传学操作，用Lipofectamine 2000转染剂将包含HA和NA的质粒及来自于甲型波多黎各Rico/8/34(H1N1病毒)的六个基因质粒(PB 1、PB2、PA、NP、M、NS)转染至293T和MDCK细胞共培养物，使该重组病毒获得拯救，随后向鸡胚胎接种，接种48小时后收获尿囊液，用血凝实验检测病毒滴度。
然后在4℃，将尿囊液20,000×g离心20min，弃沉淀，接着上清液在4℃，100,000×g超速离心2h，得到1.0高致病性禽流感H5N1型流感毒株，在-80℃下储存。
2.2、H5N1病毒感染挑战试验
事先测定小鼠鼻腔流感病毒挑战试验所需半数致死剂量，SPF级雌性BALB/c小鼠(6周龄)末次接种疫苗4周后，将小鼠转移至动物BSL3环境，每组5只小鼠通过鼻腔给予5MLD50(小鼠半数致死剂量)的异源1.0高致病性禽流感H5N1型病毒进行挑战试验，对于SPF级雌性BALB/c小鼠(6周龄)1.0高致病性禽流感H5N1型流感毒株的半数致死剂量为10ul 2⁸HA的病毒。每日观察小鼠体重和死亡率，直到所有的动物死亡，或直至挑战试验后第14天，所有挑战试验在第3级动物生物安全控制设施中进行，所有实验动物均按照国家传染病研究所(NIID)动物实验指南繁殖培育，下表为H5N1病毒感染挑战试验的结果，在该表中存在不同的分组，如在14天之内该组所有的动物死亡，则数据纪录到当时为止，若尚有幸存者则继续记录至14天为止。
挑战试验表
疫苗分组           存活率^＊      体重减轻百分比^＊＊
Voil+BacHA+rCTB    100％        4.6％
Voil+BacHA         100％        8.4％
Voil+rCTB          20％         25.17％
Voil单独           0％          26.86％
BacHA+rCTB         60％         18.76％
BacHA单独          60％         21.54％
rCTB单独           0％          25.55％
对照               0％          27.54％
^*5MLD50剂量的存活率；
^**体重减轻百分比；
Voil表示油制剂，BacHA表示本发明制得的疫苗用HA抗原；
对照即不对小鼠进行任何免疫。
另外，BacHA单独的或者加有rCTB的油制剂免疫的组在挑战后第3天体重降低8％，并获得100％对H5N1病毒的保护。并且同时服用BacHA和rCTB的油制剂小鼠体重很快恢复(5天内)。然而，BacHA单独的或者加有rCTB的非油制剂组的小鼠在挑战试验后第6天体重分别降低约22％和18％，并且这两组小鼠对5MLD50高致病性禽流感H5N1病毒仅表现出了60％的保护作用。
2.3、口服免疫抗体测量实验以及测量方法
2.3.1抗体的采集
SPF级雌性BALB/c小鼠(6周龄)，免疫前，所有免疫小鼠禁食2h，其余时间自由饮水和进食。每组10只小鼠(n＝10/组)，分别在0，7和14日用100μl选择性的含有log2⁸HA滴度(15μg)重组杆状病毒血凝素、10μg rCTB以及由矿物油、角鲨烯、叶绿醇、合成中链甘油三酯M818及M840丙二醇酯所组成的辅助油制剂的疫苗灌胃免疫，分别在第14天采集各组(每组随机选5只)小鼠血清，来自同一组的另5只小鼠在28天处死，采集血清和粘膜拭子。
2.3.2抗体的检测方法
本实施例采用间接酶联免疫吸附测定方法(间接ELISA法)检测抗H5HA型特异性抗体(粘膜IgA以及血清IgG)浓度：
96孔酶联免疫吸附试验板用经纯化、碳酸盐缓冲液配制最佳浓度为400ng/孔的重组H5HA包被；
测试血清样品用含有0.05％吐温20的3％脱脂奶粉/磷酸盐缓冲液(PBS-T)连续稀释2倍，粘膜冲洗液直接按1∶20稀释；
然后，在各孔添加与辣根过氧化物酶交联的羊抗鼠IgG(来自Sigma公司，USA)和山羊抗鼠IgA(来自Bethyl Lab)，随后加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(来自Sigma公司，USA)，即可显色检测，用25μl 1M硫酸停止反应，450nm酶标仪测量吸光值。
本实施例采用血凝抑制试验检测抗体反应抑制HA的效果：
受体破坏酶处理过的血清在V型底96孔板连续稀释2倍，室温下，约4HA单位病毒抗原与血清孵育30分钟，然后添加1％cRBCs，并在室温孵育40分钟，抑制血凝的最高血清稀释度作为血清血凝抑制滴度。
2.4、对2.3口服免疫抗体测量实验的结果分析
2.4.1口服疫苗后全身性抗体反应
血清HA特异性IgG抗体反应表明，口服BacHA油制剂免疫小鼠组特异性IgG抗体滴度比无油BacHA组显著增强。
然而，拥有rCTB佐剂的BacHA油制剂相比于无佐剂BacHA油制剂，IgG抗体滴度并无显著提高。
HI滴度结果表明，与无佐剂BacHA油制剂相比，加有佐剂(rCTB)的BacHA油制剂口服免疫小鼠第14天和42天血清HI滴度显著提高。然而，单独用BacHA或加入rCTB的BacHA无油制剂仅表现较低HI滴度。
2.4.2粘膜免疫反应的口服给药
在第42天(末次免疫后4个星期)用间接ELISA法确定HA特异性粘膜IgA水平。与无佐剂BacHA油制剂免疫的小鼠相比，加有佐剂(rCTB)的BacHA油制剂免疫的小鼠粘膜IgA明显要高(P＞0.05)。BacHA单独的或者加有rCTB的BacHA无油制剂仅诱导非常低的HA特异粘膜IgA抗体反应。