可调控肝损伤动物模型的制作方法及其专用DNA片段 【技术领域】
本发明涉及一种可调控肝损伤动物模型的制作方法及其专用DNA片段。
背景技术
乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)严重威胁人类的健康，全球约有3.6亿乙肝患者和1.7亿丙肝患者，每年约有150万患者死亡。过去的十年里，在治疗这些疾病方面已经取得了很大的进步，但是仍然没有建立有效的治愈手段，且现有的治疗方法通常伴有副作用，发展更好的抗病毒药物仍然是当务之急。
目前，新的抗病毒药物主要在细胞水平对进行测试和评价，用于临床之前，必须在动物模型上测试其活性和毒性。抗HBV和HCV的药物只能用黑猩猩进行体内研究，因为经济和道德方面的原因，黑猩猩试验具有一定局限性，所以人们试图建立肝脏人源化的小鼠模型用于HCV和HBV药物和疫苗的开发，取得一些进展，如用人源肝脏细胞重建Alb-uPA转基因小鼠的肝脏，这样的小鼠可以被HBV和HCV感染。
为了研究体内的凝血溶血系统，Janice L.Hechei等人构建了白蛋白启动子驱动uPA的转基因小鼠，该转基因小鼠的肝细胞中过量表达uPA，血浆中的uPA上升，在新生小鼠中容易引发内出血致死。有两个uPA表达水平较低的品系得以存活，但后代中大约一半转基因鼠出生后死亡。转基因小鼠体内的uPA的表达本应是稳定的，但在两个品系的小鼠的血液内的检测到的uPA的活性是随时间逐渐下降的，并且凝血能力也逐渐恢复，约1-2个月以后，小鼠凝血能力完全恢复。一周龄的转基因小鼠的肝脏是全白的；到3-5周龄时，肝脏里出现了一些散在的1mm-1cm的红色区域；6-8周能观察到连成片的红色区域。两个品系都是这种情况，说明与转基因的整合位点无关。这些现象表明白色的组织是原有的，红色的斑点是后来出现的。深入研究发现一些细胞通过同源重组删去了外源基因，通过扩增最终能够重建整个肝脏，这说明肝脏细胞具有强大的增殖能力，为外源肝细胞重建小鼠肝脏提供了依据。将Alb-uPA小鼠回交到免疫缺陷小鼠scid/bg背景上，把从肝切除病人分离的无病毒感染的肝脏细胞被移植到Alb-uPA杂合和纯合的小鼠肝脏，发现人源肝脏细胞能够在转基因纯合的小鼠体内达到较高程度的重建，并且能被HBV和HCV感染，而在转基因杂合的小鼠肝脏内几乎看不到人源的肝脏细胞。
另一个用于移植研究的重要模型是Fah-/-小鼠，Fah缺陷的小鼠会发生酪氨酸血症，酪氨酸血症是一种遗传性氨基酸代谢疾病，患者体内缺乏FAA水解酶，酪氨酸在体内代谢时，由于FAA不能水解而积累，从而引起肝脏细胞的损伤。NTBC是4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase抑制剂，可以阻止FAA的积累，因此服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血症的症状。这种小鼠通过喂食NTBC可以正常生长繁殖。因为FAH缺陷可以导致肝细胞的死亡，所以这个模型理论上可以作为肝细胞移植的模型。有报道说将1000个正常的小鼠肝脏细胞移植到FAH小鼠，就可以重建Fah-/-小鼠的肝脏。但是在很长的一段时间里，都没有使用Fah-/-模型进行肝脏人源化的报道。
虽然人源肝脏细胞在Alb-uPA小鼠能够很好的重建，但是这种小鼠有几个缺点阻碍了它的应用：1)繁殖困难：转基因杂合地小鼠出生后，约有半数致死，纯合子小鼠在一个月内全部死亡，只能通过杂合小鼠的交配来获得纯合的小鼠，根据遗传规律，后代约有1/4的小鼠是纯合子，除去新生致死的，很难得到纯合小鼠。2)移植窗口小；纯合子的小鼠在一个月左右会死亡，所以必须尽早重建小鼠的肝脏，移植时间通常在出生后7-14天。3)手术不方便，7-14天的小鼠不易于手术操作。
大肠杆菌E.coli里，TetR(Tet repressor)是负调控四环素抗性操纵子。TetR在没有四环素时，结合到Tet操纵子序列上阻断基因的表达。在有四环素时，TetR从操纵子序列上释放，基因开始表达，这就是Tet-off系统。与Tet-Off系统不同，Tet-On系统使用带有两个突变的反式Tet抑制子rTetRs(reverse Tetrepressors)，rTetRs的结合区和VP16的激活区融合，高级tet-on系统用的是最小的VP16激活区。在有强力霉素(Doxycycline四环素衍生物)或四环素时rTetRs的结合区与tet操纵子序列结合，启动目的基因的表达。通过对tet-on系统的优化得到的高级tet-On系统提高了目的基因的表达，毒性降低，更容易获得稳定表达蛋白的细胞系。高级tet-On系统相具有如下优点：1)非常严紧的调控：由于优化的rtTA和TRE-Tight，目的基因的本底表达水平低。2)无副作用：因为真核基因组里没有对应的序列，在哺乳动物细胞内rtTA-Adavanced的结合区非常特异的作用于TRE-Tight的tetO序列。3)高效快速的诱导作用：Dox能够在30分钟内将目的基因的表达提高1000倍，而其他的诱导系统速度慢，不能完全诱导。4)绝对表达水平高：Tet系统的最高表达水平甚至高于CMV启动子的直接启动，有报道说HeLa细胞里的Tet-Off瞬时表达比CMV强35倍。5)诱导药物：Tc和Dox价格相对便宜，无毒，结果重复性高。基于以上优点，我们使用高级tet-on系统来建立模型。
腺病毒载体是近年来发展的一种用于转基因治疗的载体，它具有毒性低，效率高和不整合的特点。研究发现，通过血液导入小鼠体内的腺病毒，主要感染肝脏细胞。因此可以使用腺病毒载体将外源基因导入小鼠肝脏。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种可调控肝损伤动物模型的制作方法及其专用DNA片段。
本发明提供的DNA片段I，自上游至下游依次包括：肝脏特异启动子、Tet-on基因表达系统的反义四环素激活子编码基因。
所述肝脏特异启动子可采用多种启动子，如小鼠白蛋白启动子。
所述DNA片段I还包括位于小鼠白蛋白启动子上游的增强子，所述增强子和所述小鼠白蛋白启动子形成如下1)或2)或3)或4)的融合DNA：
1)序列表中序列3自5′末端第29-2364位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
4)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
所述反义四环素激活子是如下5)或6)的蛋白质：
5)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
6)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有反义四环素激活子功能的由序列2衍生的蛋白质。
所述DNA片段I还包括位位于反义四环素激活子编码基因下游的polyA，所述连接polyA的反义四环素激活子编码基因是如下7)或8)或9)的DNA分子：
7)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述反义四环素激活子的DNA分子；
9)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有反义四环素激活子功能的蛋白质的DNA分子；
含有所述DNA片段I的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
本发明还保护由Tet-off/Tet-on基因表达系统的四环素反应因子(TRE)、启动子和尿激酶原激活剂编码基因按上游至下游的顺序依次连接而成DNA片段II。
所述尿激酶原激活剂是如下10)或11)的蛋白质：
10)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
11)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有尿激酶原激活剂功能的由序列5衍生的蛋白质。
所述尿激酶原激活剂的编码基因是如下12)或13)或14)或15)的DNA分子：
12)序列表中序列4自5′末端第44-1346位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
13)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
14)在严格条件下与12)或13)限定的DNA序列杂交且编码所述尿激酶原激活剂的DNA分子；
15)与序列4限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有尿激酶原激活剂功能的蛋白质的DNA分子。
所述启动子是如下16)或17)或18)的DNA分子：
16)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子；
17)在严格条件下与16)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
18)与序列表中序列6限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
所述四环素反应因子(TRE)是如下19)或20)或21)的DNA分子：
19)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
20)在严格条件下与19)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
21)与序列表中序列7限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
含有所述DNA片段II的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体可将所述DNA片段II导入腺病毒表达载体得到。
所述重组表达载体具体可为Adeno-TRE-uPA，所述Adeno-TRE-uPA是将所述DNA片段II导入Adeno-X载体得到的。
在哺乳动物细胞中培养所述重组表达载体得到的重组腺病毒也属于本发明的保护范围。
所述哺乳动物细胞具体可为HEK293细胞。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明还保护一种肝损伤动物模型的制作方法，包括以下步骤：
1)将所述的DNA片段I导入动物中，得到转基因首建者动物；
2)将所述转基因首建者动物与scid/bg动物回交，得到scid/bg背景的携带有DNA片段I的动物；
3)用所述重组腺病毒注射scid/bg背景的携带有DNA片段I的动物，得到可调控的肝损伤动物模型。
所述动物具体可为小鼠。
通常3次回交后，可得到免疫缺陷的背景的小鼠。实际操作中，可回交3-5次。
应用本发明的方法得到的肝损伤模型小鼠，克服了Alb-uPA小鼠的缺点，基因的表达由强力霉素(四环素的衍生物)激活，表达强度随Dox的剂量变化而改变，最大表达强度与CMV启动子直接启动相当。这个系统特异性非常高，几乎没有非特异性的作用。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
【附图说明】
图1为PCR扩增uPA基因的电泳图。
图2为pGEMT-uPA质粒的酶切鉴定图。
图3为PTRE-uPA的酶切鉴定图。
图4为Adeno-TRE-uPA的酶切鉴定图
图5为Alb-rtTA片段的电泳结果。
图6为转基因小鼠的PCR鉴定结果。
图7为转基因小鼠的RT-PCR鉴定。
图8为模型小鼠的免疫组化分析结果。
图9为模型小鼠的RT-PCR分析结果。
图10为模型小鼠的HE染色结果。
图11为本发明的肝损伤小鼠模型外源肝细胞重建的鉴定。
【具体实施方式】
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、pAlb-rtTA-polyA质粒的构建
一、Psk-rtTA-polyA质粒的构建
1、用限制性内切酶EcorI和HindIII 37℃酶切pTet-On-Advanced载体(Clontech公司，Catalog No.：630930)过夜，酶切结束后，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用鼎国胶回收试剂盒回收约1.2kb的rtTA-polyA片段。回收的DNA片段溶于10ul超纯水。将回收的DNA片段进行测序，见序列表中的序列1，rtTA基因编码的氨基酸序列见序列表中的序列2。
2、用限制性内切酶EcorI和HindIII 37℃酶切pBluscript载体(Fermentas公司)过夜，酶切结束后，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用鼎国胶回收试剂盒回收约3kb的pSK载体骨架。回收的DNA片段溶于10ul超纯水。
3、将步骤1得到的rtTA-polyA片段和步骤2得到的pSK载体骨架16℃孵育2h，进行连接。
4、取1管(100ul)TOP10感受态细胞(天根生化科技有限公司，CB104-03)，置冰上缓慢解冻，加入10ul步骤3的连接产物，混匀；冰水浴中继续放置30min；42℃水浴静置热激90sec；迅速转移至冰水浴中冷却1-2min；加入600ul不含抗生素的LB培养基，轻轻拍打混匀，置37℃摇床温育45min。取两个氨苄抗性的LB固体培养基平板(Amp，125U/ml)，各涂100ul菌液；室温静置待菌液吸收后，37℃温箱倒置培养10-15hr。
5、从转化的琼脂平板中挑单菌落接种到氨苄抗性的LB固体培养基(Amp，125U/ml)中37℃培养。
提取在培养基上生长的菌落的质粒，用限制性内切酶HindIII和HEcorI进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶上显示约1.2kb和约3kb的条带。将酶切阳性的质粒进行测序，结果表明获得了目的质粒，将其命名为Psk-rtTA-polyA。
二、pAlb-rtTA-polyA质粒的构建
1、Alb启动子/增强子的获得
将位于小鼠白蛋白基因5’上游10.4-8.5kb之间的1.99kb的增强子片段和0.33kb的启动子片段在pAlb-hGH中融合成长度为2.3kb的Alb启动子/增强子，具体实验方法参见文献(Pinkert CA et al.An ALB enhancer located 10 kb upstreamfunctions along with its promoter to direct efficient，liverspecificexpression in transgenic mice.Genes Dev 1987；1：268-276.)(北京大学)。获得的Alb启动子/增强子序列见序列表中的序列3。
2、用限制性内切酶BamH I酶切pAlb-Hgh 3-4小时；然后加入T4 DNA聚合酶，平滑末端；然后加入限制性内切酶Sac I进行酶切，得到2.3kb的Alb启动子/增强子片段。
3、用限制性内切酶EcorI酶切Psk-rtTA-polyA 3-4小时；然后加入T4 DNA聚合酶，平滑末端；然后加入限制性内切酶Sac I进行酶切，得到4.2kb的载体片段。
4、将步骤2制备的Alb启动子/增强子片段和步骤3制备的载体片段混合孵育，进行连接。
5、用连接产物转化TOP10感受态细胞(天根生化科技有限公司，CB104-03)。取氨苄抗性的LB固体培养基平板(Amp，125U/ml)，涂100ul菌液；室温静置待菌液吸收后，37℃温箱倒置培养10-15hr。
6、从转化的琼脂平板中挑单菌落接种到氨苄抗性的LB固体培养基(Amp，125U/ml)中37℃培养。
提取在培养基上生长的菌落的质粒，用限制性内切酶SacI和KpnI进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶上显示约3.5kb和约3kb的条带，表明获得了目的质粒，将其命名为pAlb-rtTA-polyA。
实施例2、制作TRE-PminCMV-uPA腺病毒
一、扩增尿激酶原激活剂(uPA)基因
根据Gene bank中小鼠的uPA mRNA序列(NM_008873)设计一对引物如下：
上游引物(29bp)：5’-GGCGCTAATGAAAGTCTGGCTGGCGAG-3’；
下游引物(29bp)：5’-TCTGGTACCGAGAGGACGGTCAGCATGGG-3’。
以上引物中，下划线标注的为酶切位点，斜粗体为Kozak序列用于增强表达。上游引物位于uPA mRNA起始ATG，含有NheI酶切位点。下游引物位于终止密码子下游76bp处，含有Kpn I酶切位点。
1、提取CD-1小鼠(购自维通利华)肾脏RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用上述引物，使用TaKaRa的Pyrobest DNA Polymerase进行PCR反应。
2、PCR产物经凝胶电泳后，应用DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物公司，cat.no A014-1)回收，紫外分光光度计测定A260/280 OD，估计PCR产物的浓度与纯度，回收的DNA储存于-20℃备用。PCR产物的电泳图见图1。
3、回收的PCR产物经体外加A反应后，连入pGEM-T载体(购自Promega，产品目录号：A3600)。
①加A反应
在200ul PCR管中加入以下溶液(总体积10ul)：
PCR产物 7.2ul
10×PCR buffer 1ul
dNTP(2.5mM) 0.8ul
Taq DNA聚合酶(Takara货号DRR001A) 0.2ul
70℃条件下反应30分钟。
2)将PCR产物克隆入pGEM-T载体
①连接反应在1.5ml离心管中加入以下溶液至终体积10ul：
2×T4DNA Ligase buffer 5ul；
pGEM-T(50g/ul) 0.5ul；
加A后的PCR产物 3.5ul；
T4 DNA连接酶(Promega M1801) 1ul；
室温孵育1小时后，用于转化实验。
②转化
取5ul连接产物加入到100ul Top10感受态中，冰浴30分钟，42℃孵育90秒，再冰浴2分钟后，将其转移至0.5ml LB培养液中，37℃、100rpm条件下培养45分钟，然后吸取50ul均匀涂布于经过IPTG和X-gal处理的10cm LB平板上，37℃条件下培养18小时。
③重组阳性菌落的挑选和鉴定
挑选8～10个分散良好的白色单菌落分别入5ml液体LB培养基中，37℃、250rpm条件下培养12小时，待培养基变得混浊时，分取1ul菌液用于PCR鉴定重组，其余菌液4℃条件下保存。
应用Promega公司的Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒提取PCR鉴定阳性菌株的质粒，用限制性内切酶M1uI和NheI进行鉴定。出现3kb和1.3kb两条DNA条带的质粒为阳性质粒。结果见图2。图2中，M：marker；1：阳性菌株的质粒；2：pGEM-T载体(阴性对照)。将阳性质粒命名为pGEMT-uPA。
将pGEMT-uPA质粒送北京三博远志生物有限责任公司进行测序，测序结果表明得到了正确的uPA。
二、制备Adeno-TRE-uPA腺病毒
所用系统为Clontech公司的Adeno-X Tet-on expression system，货号631050。
1、构建pTRE-uPA
用NheI和KpnI将uPA片段从pGEMT-uPA质粒上切下来，连接到用NheI和KpnI消化过的pTRE-Shuttle2载体(Clontech，Adeno-X Tet-on expression system，货号631050)的骨架上。转化反应同前。挑取卡那抗性的菌落培养，酶切筛选阳性克隆(见图3)，即为pTRE-uPA。
2、构建Adeno-TRE-uPA
用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I将3kb的TRE-PminCMV-uPA片段从pTRE-uPA上切下来，克隆到腺病毒载体Adeno-X(Adeno-X Tet-on expressionsystem，货号631050)中，得到Adeno-TRE-uPA。连接产物转化之前，用swaI消化连接产物消除背景。挑取Amp抗性的菌落培养，PCR筛选阳性克隆，阳性克隆用酶切确认(见图4)。
3、包装生产Adeno-TRE-uPA腺病毒
1)转染之前12-24小时，在6cm培养皿里接种(1-2)×106HEK293细胞(Adeno-XTet-on expression system，货号631050)，为了提高效率，在细胞50％-70％时转染。
2)细胞在37℃、5％CO2条件培养。
3)每个6cm培养皿用磷酸钙或者脂质体转染10ug Pac I消化的Adeno-TRE-uPA。
4)一天后，每天检测细胞病变反应。
5)一个星期后，转移细胞到15ml离心管(切记不要使用胰酶消化)，贴得近的细胞可以轻轻的刮下来转移。
6)室温1500g×5min离心富集细胞。
7)弃去上清，重悬沉淀于500ul无菌PBS中。
8)反复冻融三次裂解细胞：在干冰/乙醇浴中冻，37℃水浴中溶，但不要达到37℃，每次融化后涡旋震荡细胞。
9)冻融三次后，冻存于-20℃，或用于第10步。
10)在一个6cm的培养皿中加入250ul细胞裂解物，直接把裂解物加到培养基里，一个周以后应该可以见到细胞病变反应。
11)如果50％以上的细胞从培养皿上脱落，-70℃冻存前面的细胞裂解物，如果没有见到细胞病变反应，说明病毒滴度太低。
4、扩增重组腺病毒
1)感染前24小时接种HEK 293细胞到T75培养瓶，细胞长到培养瓶的50-70％时感染。
2)细胞在37℃、5％CO2条件培养。
3)第二天，用含有腺病毒的培养基换液，每个细胞对应1-5pfu的病毒。
4)37℃、5％CO2条件培养90分钟。
5)换10ml新鲜的生长培养基。
6)37℃、5％CO2条件培养3-4天。
7)检测细胞病变反应，当50％细胞脱落，转移细胞悬液倒15ml离心管，切记不要使用胰酶消化，贴得近的细胞可以轻轻的刮下来转移。
8)冻融法收获病毒。
9)用Adeno-X Rapid Titer Kit(Clontech，Cat.No.631028)测定病毒滴度。
实施例3、肝损伤小鼠的制备
一、Alb-rtTA小鼠的制备
(一)Alb-rtTA片段的酶切、回收和纯化
1、用限制性内切酶SacI和KpnI 37℃酶切pAlb-rtTA-polyA质粒过夜。
2、酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图5。切下3.5kb大小的条带，用DNA胶回收试剂盒(鼎国)回收DNA。
3、用Promega Wizard DNA clear-up kit(Cat：A 7280)进一步纯化DNA片段。
4、TE(7mM Tris-HCl，0.15mM EDTA，pH 7.5)溶解纯化后的DNA。
(二)制备供原核注射的DNA样品
测定DNA样品的OD值，将DNA用TE稀释至2-5ng/ul；12000g×10min(4℃)离心；将离心后的上1/3部分溶液小心吸出，分装于若干离心管中，冻存于-20℃冰箱。
(三)原核显微注射法制作Alb-rtTA转基因小鼠
将按如上步骤纯化好的pAlb-rtTA线性化DNA片段应用原核显微注射法制作pAlb-rtTA转基因小鼠，具体实验步骤如下：
1、选取4～5周龄雌性ICR小鼠(购自维通利华)，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)；
2、47～48小时后，每只小鼠腹腔注射10 IU的人促绒毛膜性腺激素HCG，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，选取阴道口潮红的发情母鼠，与结扎公鼠合笼；
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施；
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入含有0.05％透明质酸酶M2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出；
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5％CO2，37℃培养箱培养；
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用；
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5％CO2，37℃培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1％戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19～21天仔鼠分娩，即为转基因始建(Founder)小鼠。
(四)阳性的小鼠的鉴定
1、PCR鉴定
对阳性小鼠尾基因组DNA进行PCR分析，鉴定其是否为转基因阳性小鼠。
采用Alb-rtTA跨基因引物进行PCR检测。上游引物基于Alb启动子序列(Alb/p)，下游引物(primer II)基于rtTA基因序列，目标片段为700bp。引物序列如下：
上游引物(primer I)：5’-tgg ctg aaa gtt act gtg gga-3’；
下游引物(primer II)：5’-aga tgg tgc gct cct gga cgt-3’。
32只阳性小鼠中，共有4只PCR鉴定为阳性，为转基因小鼠。4只转基因小鼠的PCR鉴定结果见图6。图6中，PC：质粒pAlb-rtTA-polyA(阳性对照)；1-5、2-9、2-10、4-6：4只转基因小鼠；NC：ICR小鼠(阴性对照)。
2、RT-PCR鉴定
原核注射转基因的方法，目的片段是随机整合的，有时会发生转基因沉默和表达谱错误的情况，为了确认获得转基因小鼠的rtTA是否表达及表达谱是否正确，采用RT-PCR的方法在mRNA水平上对小鼠的心、肝、肺、肾和胰的组织进行检测。
4只转基因小鼠均表达rtTA，并且表达谱正确，强烈特异的在肝脏表达目的基因，除了肝脏，只有肾脏有微弱表达。其中一只转基因小鼠的鉴定结果见图7。
二、回交获得免疫缺陷背景的Alb-rtTA转基因小鼠
为了能够接受外源肝脏细胞，需要将该模型转换到免疫缺陷的小鼠背景，并且只有免疫缺陷的小鼠才能被腺病毒反复感染。Scid/bg是一种免疫缺陷小鼠，体内无成熟的T细胞和B细胞，NK细胞缺失。这种小鼠能够接受外源细胞和组织，因此我们将Alb-rtTA小鼠经过多次回交，转换为Scid/bg背景。
(一)把普通环境下的Alb-rtTA转基因小鼠通过剖腹产净化转移到SPF环境
1、选择6～8week龄未交配过的Alb-rtTA转基因小鼠作剖腹净化对象。交配后第二天连续数天后观察阴栓，并记录阴栓出现日期，作为受孕日期，妊娠19±1d作为预产期，即剖腹产日期。
2、到预产期的孕鼠，断颈椎处死后，立即用2％过氧乙酸浸泡2～3s，即在手术台上固定、剖腹，用无菌止血钳夹住近肛门处子宫颈，再用无菌剪子从止血钳的肛门一侧剪断子宫，取出整子宫后，置2％过氧乙酸液浸泡1～2s，迅速从手术隔离器的渡槽液(消毒液)内将子宫转移至无菌手术隔离器内，切开子宫，取出幼仔，用无菌纱布将小仔全身擦干净，再至小仔全身鲜红，能自由呼吸为止。
3、把剖腹产所得的活幼仔，放入保姆鼠(维通利华实验动物中心饲养的无菌ICR小鼠，交配比剖腹的Alb-rtTA小鼠提前3～4d)盒内，每只保姆代乳8只左右，并与保姆所产小仔充分接触后，处死保姆所产小仔。
4、从手术隔离器转移至无菌隔离器饲养，21d离乳。经各项微生物检测合格后，转移至SPF屏障系统内饲养。
5、已转入SPF屏障系统内饲养的Alb-rtTA小鼠，每季度送检一次(5～10只)，作各项微生物检测。
(二)获得scid/bg背景的Alb-rtTA转基因小鼠
将净化的转基因小鼠与scid/bg小鼠(购自维通利华)在SPF环境下进行回交，每次回交后通过PCR的方法检出转基因阳性的小鼠与scid/bg小鼠进行下一次回交。3次回交后，对小鼠的scid基因检测发现，转基因小鼠已经携带纯和的scid位点，对IgG检测发现含量远低于正常小鼠，说明小鼠已经获得免疫缺陷的背景。为了进一步降低小鼠的免疫力，对小鼠继续回交。5次回交后获得的scid/bg背景的Alb-rtTA小鼠进行步骤三的试验。
三、肝损伤模型小鼠的获得
将10只免疫缺陷背景的Alb-rtTA转基因小鼠分成两组，每组5只(第一组和第二组)。将10只ICR小鼠分成两组，每组5只(第三组和第四组)。第一组和第三组小鼠在以下整个试验阶段用Dox水溶液(1mg/ml)作为饮用水。第二组和第四组小鼠在以下整个实验阶段用普通水作为饮用水。各组小鼠分别注射腺病毒Adeno-TRE-uPA 5×109/只，三天后解剖小鼠取肝脏组织，进行RT-PCR及免疫组化分析。
对于注射腺病毒，DOX诱导的Alb-rtTA转基因小鼠，在病毒注射后1天打开腹腔发现，小鼠肝脏外观苍白，这与报道的Alb-uPA小鼠的肝脏损伤特征一致。PCR分析结果表明各组小鼠均被腺病毒uPA感染。免疫组化分析结果见图8。图8中，A)野生型小鼠；B)Dox诱导的野生型小鼠；C)Alb-rtTA转基因阳性小鼠；D)Dox诱导的Alb-rtTA转基因小鼠。只有DOX诱导的Alb-rtTA小鼠能够检测到uPA的表达，统计结果显示80％以上的肝脏细胞都表达uPA。而在其余三种小鼠内都没有检测uPA。RT-PCR分析结果见图9。图9中，WT)野生型小鼠；WT+DOX)Dox诱导的野生型小鼠；Alb-rtTA)Alb-rtTA转基因阳性小鼠；Alb-rtTA+Dox)Dox诱导的Alb-rtTA转基因小鼠。RT-PCR的结果与免疫组化结果相符，即只有两个元件同时存在并且用DOX诱导的情况下uPA才会启动表达。HE染色结果见图10。图10中，A)DOX诱导的野生型小鼠；B)DOX诱导的Alb-rtTA转基因小鼠。野生型小鼠细胞形态正常，Alb-rtTA转基因小鼠的干细胞出现空泡样的损伤特征。
四、外源肝细胞的重建
1、外源肝脏细胞的获得
用三溴乙醇将GFP转基因小鼠(购自维通利华)麻醉后，打开腹腔，分离门静脉，将带有软管的头皮针刺入门静脉，动脉夹固定。软管接注射器，依次灌注PBE50ml和PBC 50ml。然后剪下肝脏，WB冲洗肝脏。用镊子撕破肝脏的包膜，用细胞筛过滤细胞。800rpm×1min离心，小心吸掉上清，用WBD重悬细胞，离心；再用DF12(GIBICO)洗涤两次，台盼蓝染色检测肝脏细胞存活率。
灌注缓冲液(PB)(PH7.4)的配方：NaCl 27g、KCl 1.26g、NaHCO3 6.3g、Glucose2.4g、Hepes 14.34g、H2O 3000ml。
PBE(PH7.4)的配方：EDTA 0.37g、PB 500ml。
PBC(PH7.4)的配方：Collagenase 4.2g、CaCl2-2H2O 0.275g、PB 500ml。
WB(PH7.4)的配方：NaCl 17.5g、KCl 1.15g、CaCl2-2H2O 0.325g、Hepes 5.95g、BSA 2.5g、H2O 2500ml。
WBD(PH7.4)的配方：MgCl2-6H2O 0.15g、MgSO4-7H2O 0.15g、DNase 0.15g、WB 1500ml。
2、外源肝细胞的重建
整个试验阶段用Dox水溶液(1mg/ml)作为饮用水，将10只免疫缺陷背景的Alb-rtTA转基因小鼠分别注射腺病毒Adeno-TRE-uPA 5×109/只，得到肝损伤小鼠模型。
在注射腺病毒的第二天(试验第4天)移植肝脏细胞，每只小鼠移植5×105个。移植后每7天每只小鼠注射5×109腺病毒来促进外源细胞的增殖。每次注射腺病毒7天后检测移植的效果。
肝细胞的移植方法如下：用三溴乙醇将模型小鼠麻醉，侧位置于实验台上。对左侧脾脏部位皮肤剔毛，剪开皮肤和肌肉层，开口大小约1cm。用镊子分离出脾脏，用注射器从脾脏末端将肝细胞缓慢的注入脾脏。注完后，用线结扎针孔部位以防出血。然后将脾脏放回原位，依次缝合肌肉层和皮肤层。移植后的小鼠放到保温胎上保温至苏醒。
结果见图11。图11中，P1-P5为移植后腺病毒Adeno-TRE-uPA促进一次到五次。对于注射腺病毒，并DOX诱导的Alb-rtTA转基因小鼠，在病毒注射后4天时能够观测到肝脏有点状再生，7天时肝脏出现节结状的再生区域，10天后整个肝脏完全恢复。GFP肝脏细胞重建uPA损伤的小鼠肝脏。第一次促进后，小鼠的肝脏内可以检测到4-5个细胞的细胞团；第二次促进后，这些细胞团进一步增殖；三次促进后细胞团达到100多个细胞，重建程度达到20％；四次促进后细胞团开始连结成片，重建率达到50％；继续用腺病毒uPA促进，外源细胞重建率接近80％。
【序列表】
<110>北京大学
<120>可调控肝损伤动物模型的制作方法及其专用DNA片段
<130>CGGNARY81956
<160>7
<210>1
<211>1228
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gaattcacca tgtctagact ggacaagagc aaagtcataa acggcgctct ggaattactc 60
aatggagtcg gtatcgaagg cctgacgaca aggaaactcg ctcaaaagct gggagttgag 120
cagcctaccc tgtactggca cgtgaagaac aagcgggccc tgctcgatgc cctgccaatc 180
gagatgctgg acaggcatca tacccacttc tgccccctgg aaggcgagtc atggcaagac 240
tttctgcgga acaacgccaa gtcattccgc tgtgctctcc tctcacatcg cgacggggct 300
aaagtgcatc tcggcacccg cccaacagag aaacagtacg aaaccctgga aaatcagctc 360
gcgttcctgt gtcagcaagg cttctccctg gagaacgcac tgtacgctct gtccgccgtg 420
ggccacttta cactgggctg cgtattggag gaacaggagc atcaagtagc aaaagaggaa 480
agagagacac ctaccaccga ttctatgccc ccacttctga gacaagcaat tgagctgttc 540
gaccggcagg gagccgaacc tgccttcctt ttcggcctgg aactaatcat atgtggcctg 600
gagaaacagc taaagtgcga aagcggcggg ccggccgacg cccttgacga ttttgactta 660
gacatgctcc cagccgatgc ccttgacgac tttgaccttg atatgctgcc tgctgacgct 720
cttgacgatt ttgaccttga catgctcccc gggtaactaa gtaaggatcc agacatgata 780
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 840
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 900
aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 960
taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatcctgc aagcctcgtc 1020
gtctggccgg accacgctat ctgtgcaagg tccccggacg cgcgctccat gagcagagcg 1080
cccgccgccg aggcaagact cgggcggcgc cctgcccgtc ccaccaggtc aacaggcggt 1140
aaccggcctc ttcatcggga atgcgcgcga ccttcagcat cgccggcatg tcccctggcg 1200
gacgggaagt atcagctcga ccaagctt 1228
<210>2
<211>248
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Gly Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Gly Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Glu Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp Arg Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
225 230 235 240
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245
<210>3
<211>2372
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ctggagctcc accgcggtgg cggccgctct agcttcctta gcatgacgtt ccactttttt 60
ctaaggtgga gcttacttct ttgatttgat cttttgtgaa acttttggaa attacccatc 120
ttcctaagct tctgcttctc tcagttttct gcttgctcat tccacttttc cagctgaccc 180
tgccccctac caacattgct ccacaagcac aaattcatcc agagaaaata aattctaagt 240
tttatagttg tttggatcgc ataggtagct aaagaggtgg caacccacac atccttaggc 300
atgagcttga ttttttttga tttagaacct tcccctctct gttcctagac tacactacac 360
attctgcaag catagcacag agcaatgttc tactttaatt actttcattt tcttgtatcc 420
tcacagccta gaaaataacc tgcgttacag catccactca gtatcccttg agcatgaggt 480
gacactactt aacataggga cgagatggta ctttgtgtct cctgctctgt cagcagggca 540
ctgtacttgc tgataccagg gaatgtttgt tcttaaatac catcattccg gacgtgtttg 600
ccttggccag ttttccatgt acatgcagaa agaagtttgg actgatcaat acagtcctct 660
gcctttaaag caataggaaa aggccaactt gtctacgttt agtatgtggc tgtagaaagg 720
gtatagatat aaaaattaaa actaatgaaa tggcagtctt acacattttt ggcagcttat 780
ttaaagtctt ggtgttaagt acgctggagc tgtcacagct accaatcagg catgtctggg 840
aatgagtaca cggggaccat aagttactga cattcgtttc ccattccatt tgaatacaca 900
cttttgtcat ggtattgctt gctgaaattg ttttgcaaaa aaaacccctt caaattcata 960
tatattattt taataaatga attttaattt atctcaatgt tataaaaaag tcaattttaa 1020
taattaggta cttatatacc caataatatc taacaatcat ttttaaacat ttgtttattg 1080
agcttattat ggatgaatct atctctatat actctatata ctctaaaaaa gaagaaagac 1140
catagacaat catctatttg atatgtgtaa agtttacatg tgagtagaca tcagatgctc 1200
catttctcac tgtaatacca tttatagtta cttgcaaaac taactggaat tctaggactt 1260
aaatatttta agttttagct gggtgactgg ttggaaaatt ttaggtaagt actgaaacca 1320
agagattata aaacaataaa ttctaaagtt ttagaagtga tcataatcaa atattaccct 1380
ctaatgaaaa tattccaaag ttgagctaca gaaatttcaa cataagataa ttttagctgt 1440
aacaatgtaa tttgttgtct attttctttt gagatacagt tttttctgtc tagctttggc 1500
tgtcctggac cttgctctgt agaccaggtt ggtcttgaac tcagagatct gcttgcctct 1560
gccttgcaag tgctaggatt aaaagcatgt gccaccactg cctggctaca atctatgttt 1620
tataagagat tataaagctc tggctttgtg acattaatct ttcagataat aagtcttttg 1680
gattgtgtct ggagaacata cagactgtga gcagatgttc agaggtatat ttgcttaggg 1740
gtgaattcaa tctgcagcaa taattatgag cagaattact gacacttcca ttttatacat 1800
tctacttgct gatctatgaa acatagataa gcatgcaggc attcatcata gttttcttta 1860
tctggaaaaa cattaaatat gaaagaagca ctttattaat acagtttaga tgtgttttgc 1920
catcttttaa tttcttaaga aatactaagc tgatgcagag tgaagagtgt gtgaaaagca 1980
gtggtgcagc ttggcttgaa ctcgttctcc agcttgggat cgacctgcag gcatgcttcc 2040
atgccaaggc ccacactgaa atgctcaaat gggagacaaa gagattaagc tcttatgtaa 2100
aatttgctgt tttacataac tttaatgaat ggacaaagtc ttgtgcatgg gggtgggggt 2160
ggggttagag gggaacagct ccagatggca aacatacgca agggatttag tcaaacaact 2220
ttttggcaaa gatggtatga ttttgtaatg gggtaggaac caatgaaatg cgaggtaagt 2280
atggttaatg atctacagtt attggttaaa gaagtatatt agagcgagtc tttctgcaca 2340
cagatcacct ttcctatcaa ccccgggatc aa 2372
<210>4
<211>1414
<212>DNA
<213>小鼠属小鼠种(Mus musculus)
<400>4
gctgcagtca ccgaactgct gtctagagcc cagcggcact accatgaaag tctggctggc 60
gagcctgttc ctctgcgcct tggtggtgaa aaactctgaa ggtggcagtg tacttggagc 120
tcctgatgaa tcaaactgtg gctgtcagaa cggaggtgta tgcgtgtcct acaagtactt 180
ctccagaatt cgccgatgca gctgcccaag gaaattccag ggggagcact gtgagataga 240
tgcatcaaaa acctgctatc atggaaatgg tgactcttac cgaggaaagg ccaacactga 300
taccaaaggt cggccctgcc tggcctggaa tgcgcctgct gtccttcaga aaccctacaa 360
tgcccacaga cctgatgcta ttagcctagg cctggggaaa cacaattact gcaggaaccc 420
tgacaaccag aagcgaccct ggtgctatgt gcagattggc ctaaggcagt ttgtccaaga 480
atgcatggtg catgactgct ctcttagcaa aaagccttct tcgtctgtag accaacaagg 540
cttccagtgt ggccagaagg ctctaaggcc ccgctttaag attgttgggg gagaattcac 600
tgaggtggag aaccagccct ggttcgcagc catctaccag aagaacaagg gaggaagtcc 660
tccctccttt aaatgtggtg ggagtctcat cagtccttgc tgggtggcca gtgccgcaca 720
ctgcttcatt caactcccaa agaaggaaaa ctacgttgtc tacctgggtc agtcgaagga 780
gagctcctat aatcctggag agatgaagtt tgaggtggag cagctcatct tgcacgaata 840
ctacagggaa gacagcctgg cctaccataa tgatattgcc ttgctgaaga tacgtaccag 900
cacgggccaa tgtgcacagc catccaggtc catacagacc atctgcctgc ccccaaggtt 960
tactgatgct ccgtttggtt cagactgtga gatcactggc tttggaaaag agtctgaaag 1020
tgactatctc tatccaaaga acctgaaaat gtccgtcgta aagcttgttt ctcatgaaca 1080
gtgtatgcag ccccactact atggctctga aattaattat aaaatgctgt gtgctgcgga 1140
cccagagtgg aaaacagatt cctgcaaggg cgattctgga ggaccgctta tctgtaacat 1200
cgaaggccgc ccaactctga gtgggattgt gagctggggc cgaggatgtg cagagaaaaa 1260
caagcccggt gtctacacga gggtctcaca cttcctggac tggattcaat cccacattgg 1320
agaagagaaa ggtctggcct tctgatggcc ctcaggtagc tgagggaaga aacagatggg 1380
tcacttgttc ccatgctgac cgtcctctct gcaa 1414
<210>5
<211>433
<212>PRT
<213>小鼠属小鼠种(Mus musculus)
<400>5
Met Lys Val Trp Leu Ala Ser Leu Phe Leu Cys Ala Leu Val Val Lys
1 5 10 15
Asn Ser Glu Gly Gly Ser Val Leu Gly Ala Pro Asp Glu Ser Asn Cys
20 25 30
Gly Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Ser Tyr Lys Tyr Phe Ser Arg
35 40 45
Ile Arg Arg Cys Ser Cys Pro Arg Lys Phe Gln Gly Glu His Cys Glu
50 55 60
Ile Asp Ala Ser Lys Thr Cys Tyr His Gly Asn Gly Asp Ser Tyr Arg
65 70 75 80
Gly Lys Ala Asn Thr Asp Thr Lys Gly Arg Pro Cys Leu Ala Trp Asn
85 90 95
Ala Pro Ala Val Leu Gln Lys Pro Tyr Asn Ala His Arg Pro Asp Ala
100 105 110
Ile Ser Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn
115 120 125
Gln Lys Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Ile Gly Leu Arg Gln Phe Val
130 135 140
Gln Glu Cys Met Val His Asp Cys Ser Leu Ser Lys Lys Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asp Gln Gln Gly Phe Gln Cys Gly Gln Lys Ala Leu Arg Pro
165 170 175
Arg Phe Lys Ile Val Gly Gly Glu Phe Thr Glu Val Glu Asn Gln Pro
180 185 190
Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Gly Gly Ser Pro Pro Ser
195 200 205
Phe Lys Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ala Ser Ala
210 215 220
Ala His Cys Phe Ile Gln Leu Pro Lys Lys Glu Asn Tyr Val Val Tyr
225 230 235 240
Leu Gly Gln Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Met Lys Phe
245 250 255
Glu Val Glu Gln Leu Ile Leu His Glu Tyr Tyr Arg Glu Asp Ser Leu
260 265 270
Ala Tyr His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Gly
275 280 285
Gln Cys Ala Gln Pro Ser Arg Ser Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Pro
290 295 300
Arg Phe Thr Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Cys Glu Ile Thr Gly Phe
305 310 315 320
Gly Lys Glu Ser Glu Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Asn Leu Lys Met
325 330 335
Ser Val Val Lys Leu Val Ser His Glu Gln Cys Met Gln Pro His Tyr
340 345 350
Tyr Gly Ser Glu Ile Asn Tyr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Glu
355 360 365
Trp Lys Thr Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys
370 375 380
Asn Ile Glu Gly Arg Pro Thr Leu Ser Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg
385 390 395 400
Gly Cys Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His
405 410 415
Phe Leu Asp Trp Ile Gln Ser His Ile Gly Glu Glu Lys Gly Leu Ala
420 425 430
Phe
<210>6
<211>129
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 60
ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct 120
ccgcggccc 129
<210>7
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag 60
tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa 120
gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 180
tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 240
gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagctcggt 300
acccgggtcg ag 312