猪PRRSV、猪肺炎支原体和PVC2抗原在制备疫苗中的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104043118A43申请公布日20140917CN104043118A21申请号201310076735822申请日20130311CCTCCNOM201223020120613A61K39/295200601A61K39/12200601A61K39/02200601A61P31/04200601A61P31/14200601A61P31/2020060171申请人普莱柯生物工程股份有限公司地址471000河南省洛阳市高新区凌波路5号72发明人张许科孙进忠白朝勇74专利代理机构北京华夏正合知识产权代理事务所普通合伙11017代理人韩登营54发明名称猪PRRSV、猪肺炎支。

2、原体和PVC2抗原在制备疫苗中的应用57摘要本发明提供了一种致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应用。该应用对于猪肺炎支原体污染的猪群或受到猪肺炎支原体威胁的猪群在不影响猪肺炎支原体免疫效果的前提下，能使PCV2和PRRSV的免疫时间提前，能同时控制猪肺炎支原体、PRRSV和PCV2三种疾病。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书11页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页10申请公布号CN104043118ACN104043118A1。

3、/1页21致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应用。2根据权利要求1所述的应用，其中，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原首免所述猪，用致免疫量的所述猪肺炎支原体和致免疫量的所述PCV2抗原二次免疫所述猪。3根据权利要求2所述的应用，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体，所述PRRSV抗原为PRRSV减毒株，所述PCV2抗原为灭活的PCV2病毒。4根据权利要求2所述的应用，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613。

4、株，所述PRRSV抗原为PRRSVNVDCJXA1R减毒株，所述PCV2抗原为灭活的PCV2病毒SH株。5根据权利要求2所述的应用，其中，所述猪肺炎支原体抗原为2108CCU5108CCU，优选3108CCU5108CCU；所述PRRSV抗原为1105TCID50，优选1106TCID50；，所述PCV2抗原为1104TCID50，优选1105TCID50。6根据权利要求2所述的应用，其中，所述首免和二次免疫间隔735日，优选1428日，更优选2128日。7根据权利要求2所述的应用，其中，所述首免17日龄仔猪，优选57日仔猪。8一种疫苗试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述PCV2抗原、所述猪肺炎。

5、支原体抗原和佐剂的组份I，以及含所述PRRSV抗原的组份II。权利要求书CN104043118A1/11页3猪PRRSV、猪肺炎支原体和PVC2抗原在制备疫苗中的应用技术领域0001本发明涉及猪PRRSV、猪肺炎支原体和PVC2抗原在制备疫苗中的应用。背景技术0002猪圆环病毒病是由猪圆环病毒PORCINECIRCOVIRUS，PCV引起的猪的一种多系统功能障碍性疾病。猪圆环病毒属于圆环病毒科，是迄今发现的最小的动物病毒中的一种。根据猪圆环病毒的致病性以及基因组差异又可将其分为无致病性或PK15源性的猪圆环病毒I型PCV1和有致病性PMWS源性的猪圆环病毒II型PCV2。我国自2000年报道猪。

6、群中存在PCV2感染的血清学证据以来，各地区陆续报道，流行范围已波及全国，猪群平均阳性率3847，猪场阳性率5875以上，危害日趋严重。针对该问题，国内已有商品化的灭活疫苗，可为猪群提供较好的免疫保护，特别在仔猪增重、抑制病毒、减少病毒血症方面具有显著的优势。0003猪繁殖与呼吸综合征PRRS对猪造成的危害是一个世界性难题。2006至2007年，我国二十多个省份发生了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情，给我国养猪业造成了严重的经济损失。随着猪繁殖与呼吸综合征的发现，猪繁殖与呼吸综合征的疫苗研究也随之开展。目前国内外已经商品化的猪繁殖与呼吸综合征疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。0004在经典。

7、株灭活疫苗方面，BAYER公司于1997年推出了灭活疫苗，随后中国也研制出猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗并商品化。灭活疫苗的优点是安全性好，但主要刺激猪体产生体液免疫反应，对清除感染巨噬细胞中的猪繁殖与呼吸综合征病毒无能为力，并且免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长，因而不适合仔猪免疫。在免疫效力上灭活疫苗免疫后攻毒不能完全保户仔猪对繁殖与呼吸综合征病毒的感染。0005在经典株猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗方面，美国于1995年首次推出商品化减毒疫苗RESPRRS/REPROTM，可供各阶段猪群使用，但主要供318周龄仔猪预防接种。随后多个国家，包括中国研制出猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗并商品化。。

8、据报道，接种猪繁殖与呼吸综合征经典株弱毒疫苗后110日用同源强毒攻击，可得到100保护童光志和田志军，猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展，PRRS专刊，2005，23233，46。但有文献报道PRRS弱毒疫苗接种PRRS血清学阴性的母猪后，疫苗中病毒可经胎盘感染胎儿，并向未接种的母猪传播，有些猪群则表现出急性猪繁殖与呼吸综合征症状。并且该疫苗接种公猪后，随后以强毒攻击，发现有精液排毒和精液质量下降等现象。在国内哈尔滨兽医研究所通过对国内分离到经典株蓝耳病毒株进行致弱获得PRRSVCH1R株，该毒株免疫原性好，刺激机体产生抗体速度快，效价高，保护时间长，用于经典株蓝耳病病毒的预防。0006在高致病性。

9、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗方面，国内专家通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征变异株NVDCJXA1在MARC145细胞上连续继代进行驯化，获得了具有良好免疫原性和安全性的弱毒株NVDCJXA1R，并作为预防高致病性蓝耳病疫情政府招标用疫苗株，在控制高致病性蓝耳病疫情中起到重要作用。随后又有两株高致病性蓝耳病变异株说明书CN104043118A2/11页4TJMF92株和HUN4F112株活疫苗上市。0007高致病性和低致病力猪繁殖障碍综合症弱毒疫苗株交叉保护情况存在着争议，越来越多的数据表明，两类毒株之间都不能提供100的交叉保护。因此，为更好的控制高致病性和低致病力的猪繁殖与呼吸综合征疾病，在受到。

10、两种不同毒力病毒威胁时养殖场多采用二种疫苗同时免疫。0008大量研究表明PRRSV和PCV2都可以导致免疫细胞的凋亡，造成机体免疫抑制，并且两种病毒多同时存在，从而更容易继发其它病原体的感染，导致更为严重的传染病。但现有技术中不存在同时预防两种疾病的疫苗。0009猪肺炎支原体MH作为猪呼吸道疾病综合征的重要原发病原，可诱发猪支原体肺炎又称为猪气喘病、猪地方流行性肺炎，一年四季均可发生。尤以寒冷、潮湿气候剧变时多发。病原体感染后可破坏呼吸道纤毛，引发肺炎，使感染、发病猪生产性能下降，治疗费用上升，还可导致猪体的体液免疫和细胞免疫功能降低。0010猪肺炎支原体与猪繁殖和呼吸系统综合征病毒PRRSV。

11、在实验条件下共感染，猪肺炎支原体可以促进蓝耳病的发生。肺炎支原体感染后，一方面可以破坏呼吸道的局部清除病原体的能力，使得病毒性病原体严重继发感染；另一方面，肺炎支原体可以调制肺脏局部的免疫应答，使肺泡巨噬细胞的功能发生改变，从而促进了PRRSV的感染，延长了PRRSV感染的时间。而且PRRSV和肺炎支原体在临床感染上存在协同效应，增强彼此的致病力，而且加重了PRRSV造成的损失。而且支原体是PRDC的主要诱发者，即使支原体引起的疾病较轻微，即猪群发生低水平支原体感染，也能使蓝耳病很快表现出临床症状。0011最新研究表明，肺炎支原体可以促进PCV2的感染。PCV2/肺炎支原体的混合感染模型本身表。

12、明，PCV2或肺炎支原体单独感染只能引起轻微的一过性呼吸道疾病和病变，但如果二者混合感染，猪肺炎支原体感染可加剧PCV2所致肺部和淋巴病变的严重程度、增加PCV2抗原的量、延长PCV2抗原的存在时间，从而提高猪断奶后多系统消耗性综合征的发病率。0012由于猪支原体肺炎、PRRSV和PCV2这三种病毒在养殖场中广泛存在，并且经常出现猪肺炎支原体和PRRSV、猪肺炎支原体和PCV2、PRRSV和PCV2、甚至出现猪肺炎支原体和PRRSV和PCV2三种致病因子混合感染现象。国内外许多资料证实支原体感染更易诱发PRRSV和PCV2的继发感染，从而产生更为严重的呼吸障碍综合症。因此，有必要采取有效措施控。

13、制这3种疾病。目前尚没有PCV2和PRRSV弱毒疫苗联合配苗和PCV2、猪肺炎支原体和PRRSV弱毒株三联苗应用的报道。0013有学者VANTHACKER，1999表明如果在接种肺炎支原体疫苗的同时感染了PRRS病毒或者接种了PRRS弱毒活疫苗，均会降低猪肺炎支原体疫苗的功效。因此如何在预防PRRSV和PCV2的同时提高猪支原体肺炎的免疫效果为本技术领域的有待解决的问题。0014专利申请CN101420975A公开了一种抗支原体和PRRSV疫苗，该专利申请基于“猪感染或接种了PRRSV病毒，猪肺炎支原体疫苗的功效将会显著降低”的理由而设计的技术路线为首先用猪肺炎支原体给小猪首次接种，接着用猪肺。

14、炎支原体和活的减毒PRRSV进行第二次接种，它们会迅速产生对PRRSV病毒感染和猪肺炎支原体感染的良好保护作用。0015即如果以联合的方式给已知首次接触猪肺炎支原体疫苗的小猪施用致免疫剂量的猪肺炎支原体的免疫原性物质和致免疫剂量的活的减毒PRRSV病毒，就能避开所谓“已说明书CN104043118A3/11页5知的问题”。0016该申请的第一个实施方案涉及致免疫剂量的猪肺炎支原体的免疫原性物质和致免疫剂量的活的减毒PRRSV在制备用于给已接触猪肺炎支原体的猪联合施用猪肺炎支原体疫苗和PRRSV疫苗的疫苗中的应用。0017该申请通过猪肺炎支原体单苗和含猪支原体肺炎组份的联苗两次免疫仔猪，尽管避免。

15、了所谓的“PRRSV减毒株疫苗对猪肺炎支原体免疫效果的影响，但却推迟了PRRSV疫苗的免疫时间735日，这样势必延长了仔猪免疫PRRSV疫苗的时间，降低猪群耐受PRRSV的能力。发明内容0018为解决现有技术的不足，本发明提供一种有猪肺炎支原体污染的猪群或受到猪肺炎支原体威胁的猪群在不影响猪肺炎支原体免疫效果的前提下，使PCV2和PRRSV的免疫时间提前，以控制猪肺炎支原体、PRRSV和PCV2三种疾病的方法。0019本发明的主要目的在于提供一种致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应。

16、用。0020优选地，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原首免所述猪，用致免疫量的所述猪肺炎支原体和致免疫量的所述PCV2抗原二次免疫所述猪。0021更优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体，所述PRRSV抗原为PRRSV减毒株，所述PCV2抗原为灭活的PCV2病毒。0022更优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，所述PRRSV抗原为PRRSVNVDCJXA1R减毒株，所述PCV2抗原为灭活的PCV2病毒SH株。0023PCV2SH株，保藏号为CGMCCNO2389，公开于专利文献CN101240264A。0024猪。

17、肺炎支原体菌株HN0613株，保藏编号为CCTCCM2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，保藏日期2012年6月13日。0025PRRSVNVDCJXA1R株，保藏号为CGMCCNO2467，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008年4月29日，在CN101307305A中公开。0026更优选地，所述猪肺炎支原体抗原为2108CCU5108CCU，优选3108CCU5108CCU；所述PRRSV抗原为1105TCID50，优选1106TCID50；，所述PCV2抗原为1104TCID50，优选1105TCID50。0027更。

18、优选地，所述首免和二次免疫间隔735日，优选1428日，更优选2128日。0028更优选地，所述PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV2抗原首免17龄仔猪，优选57日龄仔猪。0029疫苗组合物中猪肺炎支原体抗原是指灭活后支原体菌体或其有效成分，灭活前含量每头份含量在2108CCU5108CCU，优选3108CCU5108CCU；组合物中PRRSV抗原可以为致弱的PRRSV病毒液，还可以为或含有其保护性抗原GP5蛋白和M蛋白一种成份或多种成份，其中为PRRSV病毒液时每头份含量1105TCID50，优选每头份病毒液含量说明书CN104043118A4/11页61106TCI。

19、D50；组合物中PCV2抗原是指灭活后的PCV2全病毒液，或含有PCV2有效保护抗原VP2等成份，其中为PCV2抗原时每头份含量1104TCID50，优选病毒液含量1105TCID50。0030本发明的另一目的在于提供一种疫苗试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述PCV2抗原、所述猪肺炎支原体抗原和佐剂的组份I，以及含所述PRRSV抗原的组份II。0031在疫苗组合物组成成分上将灭活的PCV2抗原、猪肺炎支原体抗原混合后加入水性佐剂作为组份I，组份II为含PRRSV弱毒株抗原冻干保存。使用时组份I和和组分II可单组使用，组分I免疫仔猪可预防和控制PCV2和猪肺炎支原体感染，组份II加入稀释液单独使。

20、用免疫仔猪用于预防PRRSV感染；组份I和组份II也可联合使用，用组份I中的二联苗作为稀释液来稀释组份II配制成三种抗原成份的联苗，用于同时预防和控制猪肺炎支原体、PCV2和PRRSV这三种疾病的感染。具体实施方式0032下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0033本发明实施例中分别以猪圆环病毒2型SH株、PRRSVNVDCJXA1R株、猪肺炎支原体H。

21、N0613株为例说明本发明。0034实施例1、猪圆环病毒2型、PRRSV、猪肺炎支原体组合疫苗的制备00351抗原制备003611猪圆环病毒2型抗原的制备00371制苗用细胞的传代与培养取PK15细胞，经EDTA胰酶细胞分散液含025胰酶1250、002EDTA的HANKS液消化传代，以含90MEM液、10牛血清、各100单位/ML的青霉素钠和硫酸链霉素，PH调整为72的细胞生长液继续培养，培养温度为37，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器。00382细胞毒种的繁。

22、殖用病毒培养液，将PCV2接种到步骤1制备的生长良好单层细胞继续培养，接种量为02MOI，培养温度为37，至细胞80以上病变时收获病毒。00393PK15细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养取步骤1制备生长良好的PK15细胞，经EDTA胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有预处理好的微载体，设定培养温度37，PH72，溶氧50，搅拌速度60RPM，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为50L；BIONOCII载体，在载体罐中的加入量为5070G/L，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为1称量BIONOCII球形微载体250G、使用10LPBS。

23、液浸泡三小时；2用10LPBS液清洗3遍；3加入10LPBS液浸泡微载体，121蒸汽灭菌30MIN。00404制苗毒液的繁殖培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为约1106/ML后进行接毒操作，接种量为02MOI，设定培养温度37，PH74，溶氧说明书CN104043118A5/11页750PPM，搅拌速度60RPM，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况，同时取反应器中病毒液，用间接免疫荧光法IFA测定PCV2病毒含量。待细胞病变达5080病变时IFA病毒含量达到最高停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液。00415病毒液的收。

24、获培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后加入002灭活剂BEI灭活37灭活72H，然后37加入10V/V01M硫代硫酸钠终止BEI活性，然后将灭活后的病毒液于20冷冻保存备用。00426PCV2抗原灭活检验灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，接种96孔板，同步介入PK15细胞，培养120H后，做间接免疫荧光，细胞无免疫荧光。004312猪PRRSV抗原的制备00441制苗用细胞的传代与培养取MARC145细胞，经EDTA胰酶细胞分散液含025胰酶1250、002EDTA的HANKS液消化传代，以含90MEM液、10牛血清、各100单位/ML的青霉素钠和。

25、硫酸链霉素，PH调整为72的细胞生长液继续培养，培养温度为37，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器。00452细胞毒种的繁殖用病毒培养液，将PRRSV接种到步骤1制备的生长良好单层细胞继续培养，接种量为02MOI，培养温度为37，至细胞80以上病变时收获病毒。00463MARC145细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养取步骤1制备生长良好的MARC145细胞，经EDTA胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有预处理好的微载体。

26、，设定培养温度37，PH72，溶氧50、搅拌速度60RPM，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为50L；BIONOCII载体，在载体罐中的加入量为5070G/L，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为1称量BIONOCII球形微载体250G、使用10LPBS液浸泡三小时；2用10LPBS液清洗3遍；3加入10LPBS液浸泡微载体，121蒸汽灭菌30MIN。00474制苗用PRRSV病毒液的繁殖观察微载体上细胞基本长满，细胞计数结果达到1106/ML1107/ML后进行接毒操作，所接入种毒为步骤2中之种毒，设定培养温度37，H7276，溶氧3060、搅拌速度3060RPM，进行反应器自。

27、动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况待细胞病变达80以上病变时，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液。00485病毒液的收获培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后将病毒液于20冷冻保存备用。004913猪肺炎支原体培养基及支原体抗原制备0050采用KM2液体培养基或固体培养基，配方如下乳清蛋白水解物，100G；鲜酵母浸出物，200ML；EAGLES氏液，10000ML；DULBECCO磷酸盐缓冲液，6000ML；健康猪血清，4000ML；酚红04，35ML；醋酸铊1，250ML；青霉素，4000000IU。PH。

28、为7476。0051将冻干菌种猪肺炎支原体HN0603株接种于KM2固体培养基，5CO2环境培养72小时后，选取3个典型菌落转接入KM2液体培养基，培养48H后纯粹检验合格作为种说明书CN104043118A6/11页8子液，按发酵罐容积的70加入生产用的KM2培养基，按培养基量的002加入消泡剂ANTIFOAM204，SIGMA，当培养基温度升至37时，将种子液按10加入到发酵罐内。搅拌转速300R/MIN，PH72，罐压002004MPA之间、溶氧量40，培养时间48小时，当浓度达到约1109CCU/ML时，经检验纯粹后，加入然后加入002灭活剂BEI灭活37灭活72H，然后37加入10V。

29、/V0IM硫代硫酸钠终止BEI活性，4保存备用，即为猪肺炎支原体抗原。005214半成品检验0053无菌检验按中华人民共和国兽用生物制品质量标准附录301页对猪PCV2和PRRSV和猪肺炎支原体抗原液进行检验，均无菌生长。00542疫苗组合物的配制005521组份1的制备将灭活的PCV2病毒液和猪肺炎支原体培养液混合均匀后，抗原液按12比例，并加入1份水性佐剂，混匀后作为组份I，分装、加塞、压盖，28保存。005622组份II的制备将PRRSV弱毒抗原加入冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，即得到组份II。00573疫苗组合物预防控制猪肺炎支原体、PCV2和PRRSV这三种疾病方法用组份I作。

30、为稀释液稀释组份II首免，28日后用组份I二免。0058实施例2、PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体组合疫苗应用0059用本发明实施例1自制的组份I和组份II联合使用，用组份I作为稀释液稀释组份II组成联苗预防猪肺炎支原体、PCV2和PRRSV这三种疾病。免疫程序如下首先7日龄仔猪用组份I稀释组份II组成联苗首免，21日后用组份I二免。在免疫的同时，对照组用相应的单苗进行免疫，以评价三种抗原成份联合应用和相应单一抗原单独使用在免疫效果上的差异。00601材料0061PCV2和猪肺炎支原体二联苗，即组份I，按实施例1制备检验。0062PRRSV弱毒疫苗，即组份II，按按实施例1制备检验。0063。

31、PCV2单组份疫苗，按实施例1制备，其中每头份病毒液含量1105TCID50。0064猪肺炎支原体单组份疫苗，按实施例1制备，其中每头份病毒液含量3108CCU。00652试验方法006621组份I和组份II联合应用与PCV2单组份疫苗免疫效果比较0067用1周龄PCV2抗原、抗体检测双阴性仔猪20头，分成4组，每组5头。7日龄第2组颈部肌肉注射PCV2单组份疫苗1头份，2周后21日龄用PCV2单组份疫苗二免1头份；第1组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫1头份，2周后21日龄用组份I二联苗进行二免。第3、4组不免疫。二免2周后35日龄第1、2、3组注射PCV2SH株2ML攻毒含1060TC。

32、ID50/ML，观察21日；第四组作为空白对照。分别于攻毒后的7D，14D，21D称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日扑杀，剖检，根据病理学变化和免疫组化判定结果。006822组份I和组份II联合应用与PRRSV单组份疫苗免疫效果比较0069用1周龄的PRRSV抗原、抗体检测双阴性仔猪15头，分为3组，每组5只。7日龄第说明书CN104043118A7/11页92组用PRRSV单组份疫苗即组份II1头份；第1组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫1头份。第3、4组不免疫。免疫3周后28日龄第1、2、3组每头注射PRRSVNVDCJXA1强毒株3ML含1050TCID50/ML，攻毒后观察2。

33、1D。攻毒后仔猪死亡判为发病，根据发病情况判定免疫组攻毒保护效果。007023组份I和组份II联合应用与猪肺炎支原体免疫效果比较0071用1周龄猪肺炎支原体抗原、抗体检测双阴性仔猪15头，分成3组，每组5头。7日龄第2组颈部肌肉注射猪肺炎支原体单组份疫苗1头份，2周后21日龄用猪肺炎支原体疫苗二免1头份；第1组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫1头份，2周后21日龄用组份I二联苗进行二免。第3组不免疫。在首次免疫后70D，第1、2、3组用猪肺炎支原体进行攻毒CVCC354株，购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株，气管注射5ML/头100MID。

34、，攻毒后观察30天，剖杀试验猪。根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。00723结果与讨论007331组份I和组份II联合免疫与PCV2单组份疫苗免疫效果比较结果0074免疫效果研究结果如表1，组份I和组份II联合应用时对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5100，单苗对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5100，均呈现良好的免疫效果，表明PCV2与PRRSV活苗和猪肺炎支原体联合免疫与PCV2单苗的免疫效果基本相当。在增重方面，多组分疫苗在平均体重增。

35、长率比PCV2SH株单组分疫苗的体重增长率高，这是一个令人意外的结果。0075表1组份I和组份II联合应用与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗SH株0076的免疫效果比较0077组别猪圆环病毒2型SH攻击后的保护情况组份I和组份II联合免疫5/5100PCV2单组份免疫5/5100攻毒对照组1/5200078表2猪圆环病毒2型SH株攻毒后各组猪的体重增长情况说明书CN104043118A8/11页100079008032组份I和组份II联合免疫与PRRSV单组份疫苗免疫效果比较结果0081免疫效果研究结果如表3，组份I和组份II联合应用时对猪繁殖与呼吸综合征NVDCJXA1株的攻毒保护为5/5100，。

36、单苗对猪繁殖与呼吸综合征NVDCJXA1株的攻毒保护为4/580，并且组份I和组份II联合应用与单苗的免疫效果相比前者要好于后者。0082表3组份I和组份II联合免疫与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗单苗NVDCJXA1株的免疫效果比较。0083008433组份I和组份II联合免疫与猪肺炎支原体单组份疫苗免疫效果比较结果0085攻毒结果见表4、表5。结果表明，组份I和组份II联合免疫与猪肺炎支原体单组分免疫组攻毒保护均在4/5以上，对照组5/5发病。两种不同免疫组在猪平均肺病变指数和平均日增重与对照组仔猪比较存在显著差异，疫苗组仔猪平均肺病变指数显著低于非免疫攻毒组，疫苗组仔猪平均日增重显著的高于对。

37、照组。但组份I和组份II联合免疫与猪肺炎支原体单组分免疫在平均肺病变指数、平均日增重和攻毒保护率上没有明显差异，进而说明本发明所采用的猪肺炎支原体灭活疫苗和PRRSV弱毒联合配苗并分步免疫7日首免PCV2、猪肺炎支原体、PRRSV弱毒疫苗，14日龄加强免疫PCV2、猪肺炎支原体灭活疫苗，PRRSV并没有增加猪肺炎支原体的肺部病变指数，并在对猪肺炎攻毒保护率也没有产生免疫干扰现象，结果很令人意外。0086表4猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况0087说明书CN104043118A109/11页11组别平均肺病变指数标准差组份I和组份II联合免疫316219B猪肺炎支原体单组分免疫30517。

38、9B非免疫攻毒对照组1360213A0088注差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著P0050089表5猪肺炎支原体攻毒保护情况00900091注差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著P005。0092实施例3、PCV2抗原、猪肺炎支原体抗原和PRRSV弱毒株组合疫苗在有猪肺炎支原体感染猪群中的应用00931试验方法009411研究目的及试验设计0095在实施例2中多组分疫苗和单苗免疫效果评价选用的试验动物是抗原抗体双阴性仔猪，但在实际临床中猪肺炎支原体广泛存在猪群中。为此，本实施例旨在有猪肺炎支原体存在的猪群中进行猪。

39、PCV2、PRRSV和猪肺炎支原体免疫，以评价其免疫效果。本实施例包括来自3个有猪肺炎支原体存在规模猪场的仔猪，每个猪场包含约200头仔猪。每个猪场的仔猪分两组第一组7日龄仔猪颈右侧肌肉注射组分I稀释组分II组成的三联苗含PCV2抗原、猪肺炎支原体抗原和PRRSV弱毒株，21日龄仔猪颈右侧肌肉注射接种组分I含PCV2抗原和猪肺炎支原体抗原；第二组7日龄仔猪颈右侧肌肉注射不含猪肺炎支原体的组分I稀释组分II组成二联苗含PCV2抗原和PRRSV弱毒株，21日龄仔猪颈右侧肌肉注射不含猪肺炎支原体的组分I含PCV2抗原。采集首次注射所用研究动物的个体体重。对免疫动物实施临床观察观察至140日龄，记录每。

40、一组相对于正常总体健康状况的偏差。009612免疫组成猪肺炎支原体感染情况调查0097在疫苗免疫前分别对3个养殖场猪群进行猪肺炎支原体感染性情况和抗体水平进行检测分析。已确定试验用猪场曾经处于或正处于支原体感染状态。血清样品用酶联免疫吸附试验ELISA分析猪肺炎支原体抗体阳性率，鼻分泌物用聚合酶链式反应PCR定说明书CN104043118A1110/11页12量分析猪肺炎支原体的存在。00982、临床试验结果009921流行病学调查结果0100在疫苗接种前分别对3个猪场猪群进行流行病学调查分析，通过PCR和ELISA检测结果表明在3个猪场都存在不同程度猪肺炎支原体抗原和抗体。具体结果见表6，根。

41、据表6的结果可以看出3个猪场受到不同程度猪肺炎支原体的感染，其中猪场二感染率最低，不同阶段猪群的抗体阳性率为2050；猪场三猪肺炎支原体感染最为严重，不同阶段猪群抗体阳性率为5090，猪场一猪肺炎支原体感染率介于两者之间。0101表63个养殖场住肺炎支原体01020103010422免疫效果评价0105三个养猪场的两种不同免疫方法对猪群死亡率和增重的影响见表7。由表7可以看出，有猪肺炎支原体污染的猪群免疫猪肺炎支原体疫苗在仔猪增重和控制死亡率方面有明显优势，统计学分析有显著意义。并且在三个猪场免疫方法使用猪肺炎支原体和PCV2抗原和PRRSV弱毒疫苗联合应用，在控制PRRSV和PCV2感染的同时，把肺炎支原体对猪群的影响也降至较低的水平。0106表73个养殖场疫苗免疫结果0107说明书CN104043118A1211/11页1301080109注组间比较T检验之P值，P005差异不显著，P005差异显著，P001差异极显著。0110以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104043118A13。