与阴道感染有关的微生物的快速诊断 本发明涉及往往引起妇女阴道感染的微生物的医学诊断。
据报导(美国家庭医生，1966，ACOG Releases Tech.Bull[on]Vaginitis，56(6)：1-2)，由念珠菌(Candida spp.)引起的阴道炎，细菌性阴道炎以及毛滴虫属引起的阴道感染与阴道生态体系和阴道评价有关，明显的阴道炎是专科医师为妇女作基本的妇科治疗时遇到的最普遍问题，然而事实上由于一些因素，诊断是困难的。因为现有的许多药物是个人处方并由妇女个人使用，其影响诊断的准确性，所以疾病的治疗很复杂。传统的阴道炎诊断包括临床症状的分析和阴道液的试验室显微分析。当以显微技术检测念珠菌病和毛滴虫病时，显示出敏感度的下降，对于细菌性阴道炎来说解决这个问题较重要的是可能涉及不同的原因(Ferris，D.G.；Hendrich，J.；Payne，P.M.；Getts，A.；Rassekh，R.；Mathis，D.；Litaker，M.S.，1995.J.Fam.Pract，41(6)：575-81)。
总之，用于阴道炎的诊断方法的报导分别对可能性原因的确定进行详细地描述。并且一般来讲，所报导的检测念珠菌病(欧洲专利申请EP094077，1996和EP556725，1993)、毛滴虫病(欧洲专利申请EP556685，1993)和加德纳菌属(欧洲专利申请EP400086，1990)的酶技术的可行性不强，所需要的试剂和设备价格昂贵并且对所述病种不能提供直接和快速的诊断。
只报导了一个更为完整的诊断方法，该方法采用核酸的夹心杂交技术来同步鉴定加德纳菌属，毛滴虫属和念珠菌属(PCT专利申请WO 9207096，1992)；其不方便之处表现在不能提供快速的诊断，需要设备和昂贵的材料，并且对获得的样品需要进行复杂的处理。
在所建议的解决办法中，将特异性抗体与抗上述病原体的乳胶微粒结合，以便进行用于快速诊断这三种微生物的同步和简单的凝集反应分析，这三种微生物的存在基本上决定了妇女患有阴道炎。这种诊断方法可用于自我医疗会诊，其对选择最合适的治疗起着重要的作用。
总之，本发明的一个方面是，发明的要点在于获得用于同步、快速和经济地诊断引发妇女阴道炎的三种基本病因的试剂盒和提供容易操作和保存的可行性标准。作为补充，还描述了有效使用的方法。
总体上来说，按照如下步骤获得所述试剂盒：
·制备用于获得免疫血清和阳性对照的抗原
·免疫接种兔或公绵羊(rams)
·纯化免疫球蛋白
·获得结合的乳胶-球蛋白
·制备阴性对照
用于诊断的方法描述如下：
·用带有无菌棉的涂药器取阴道化验样品，放入装有0.5ml含盐的甘氨酸缓冲液的试管中，该缓冲液的pH值为8.4
·剧烈摇动装有样品的试管
·将20ml样品沉积在透明载玻片上
·添加20ml的试剂乳胶-球蛋白
·用塑料搅拌器搅匀
·旋转载玻片3分钟
·在黑背景上进行目测计数
实施例
实施例1：对获得用于诊断盒的试剂的详细描述
a.制备用于获得免疫血清和阳性对照的抗原：在所有情况下，适当洗涤获得的细胞并进行药物裂解，测定蛋白浓度。
b.免疫接种兔或公绵羊：通过在肢背侧区域和外侧区域进行皮内或肌内注射来免疫接种2-3kg重的新西兰白兔。在第21天进行记忆注射并在第28天抽取血液来滴定血清，滴度应高于1∶32。对于公绵羊，通过采用弗氏完全佐剂在体重接近45kg的6-9月大小的Pelibuey绵羊的背部进行皮内接种。在第21天肌内记忆注射不完全佐剂。在第42、63和75天以交替进行的皮内和肌内的方式重复进行记忆注射。滴定血清，结果应高于1∶64。
c.免疫球蛋白的纯化：从具有适当滴度的血清开始，采用硫酸铵(35-40％)进行盐分级沉淀来进行纯化。
d.结合乳胶-球蛋白的获得：对经盐沉淀纯化的G型-免疫球蛋白进行稀释，然后进一步与0.1ml的10％(每ml)的乳白色乳胶微粒结合，该乳胶微粒的直径为0.8μm。将结合作用在pH值为8.4、温度为35-38℃的甘氨酸缓冲液中进行。用牛白蛋白(0.5-2％)、酪蛋白(0.03-1％)或尿素(0.05-1.5M)进行封闭反应，加入稳定剂和0.1％的叠氮化钠作为保存剂。最后，结合物中的乳胶浓度为1％。选择较高的结合物稀释度，即在该稀释度下在少于3分钟的时间内检测到106或低于106个细胞/ml。
阴性对照：由pH值为8.4的含盐甘氨酸缓冲液组成。
实施例2：诊断方法的详细描述
●用带有无菌棉的涂药器取阴道化验样品，放入装有0.5ml含盐的甘氨酸缓冲液的试管中，该缓冲液的pH值为8.4
●剧烈摇动装有样品的试管
●将20μl样品沉积在透明载玻片上
●添加20μl的试剂乳胶-球蛋白
●用塑料搅拌器搅匀
●轻轻旋转载玻片3分钟
●在黑背景上进行目测计数。
阳性试验：与样品混合后3分钟，观察到有类似于阳性对照的细小乳胶凝集出现。
阴性试验：与样品混合后3分钟，没有与阴性对照类似的凝集出现。
实施例3：评估通过抗-白色念珠菌、抗-阴道毛滴虫和抗-阴道加德纳菌的免疫球蛋白致敏的乳胶的质量指标。
下列列联表提供了通过采用快速诊断和使用相应的参考技术从检测盒获得的质量指标。
表1.基于2×2列联表的用于抗阴道毛滴虫的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+b乳 71 7 78
阴性 c(fn) d(vn) c+d胶 3 863 866
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
74 870 71+7+3+863＝944列联表说明：真阳性(vp)假阳性(fp)假阴性(fn)真阴性(vn)表2.基于2×2列联表的用于诊断阴道毛滴虫的直接显微镜观察方法的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+b直 62 2 64
阴性 c(fn) d(vn) c+d接 13 867 880
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
75 869 62+2+13+867＝944表3.基于2×2列联表的用于抗白色念珠菌的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+b乳 127 18 145
阴性 c(fn) d(vn) c+d胶 10 445 445
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
137 463 127+18+10+445＝600表4.基于2×2列联表的用于诊断白色念珠菌的直接显微镜观察法的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+c直 84 111 195
阴性 c(fn) d(vn) c+d接 53 352 405
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
137 463 84+111+53+352＝600表5.基于2×2列联表的用于抗阴道加德纳菌的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+b乳 27 26 53
阴性 c(fn) d(vn) c+d胶 2 150 152
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
29 176 27+26+2+150＝205表6.基于2×2列联表的用于诊断阴道加德纳菌的直接显微镜观察方法的质量指标
培养物
阳性 阴性 总值
阳性 a(vp) b(fp) a+c直 21 16 37
阴性 c(fn) d(vn) c+d接 9 148 160
总值 a+c b+d a+b+c+d＝N
33 164 21+16+9+148＝205