本发明涉及治疗多种人和动物（包括鸟类）病毒感染的方法，其所使用的药物制剂中的活性成份由N-（膦酰基乙酰基）-L-天冬氨酸（PALA）或其药物许可的类似物组成。这些组合物具有有效的广谱抗病毒活性而且既可单独使用也可与其它的治疗剂一起使用，从而治疗病毒感染。 PALA
PALA是一种化合物，最初是作为天冬氨酸转氨酰酶的过渡阶段类似物抑制剂而进行研制的。见Stark等人，（1974）J.Biol.Chem.246：6599。随后，PALA（NSC NO.224131作为抗癌剂被彻底地研究过。参见例如Johnson等人（1976）Cancer Res.36：2720-2725;Erlichman等人（1982）J.Nat.Cancer Inst，68：227-231。
PALA、其盐类和类似物，及其制备过程已描述于Schultz等人的美国专利4，179，464、4，215，070、4，267，162、4，348，522，和英国专利GB2008118和GB2051070以及Parsons等人的美国专利4，154，759和4，178，306中。
N-（膦酰基乙酰基）-L-天冬氨酸（PALA）从一开始就抑制嘧啶的生物合成，其原因在于它阻断了酶，L-天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）一这种酶能催化L-天冬氨酯和氨甲酰磷酸的缩合，这一缩合作用是乳清酸和终产品尿苷的合成中所必需的。该抑制作用地最终结果是缺失核苷酸库，即UTP、CTP以及核苷酸中间产品，即UDP-GlcN、CMP-NeuNAc，这些核苷酸中间产品对于延长低聚糖链是必不可少的。见Johnson，R.K.，Aeon，T.，Golden，A.和Stark，G.R.（1985）J.Med.Chem.28：2720-262。Clinical Brochure，NSC No.224131，Div.of Carner Treatment，National Cancer Imstitute，Bethesda，MD.1977。因此，当PALA主要通过抑制核苷酸的生物合成而起作用时，其对中间产品的影响也会反映到它的终产品：碳水化合物、蛋白质以及核苷酸（RNA和DNA）上。
PALA以氨甲酰磷酸的竞争抑制剂和天冬氨酸的非竞争抑制剂形式而发挥作用。见Hooengraad，N.J.（1974）Arch.Biochem.Biophys.161：76-82。其Ka值是天然酶作用物，氨甲酰磷酸的1000倍。见Moore，E.C.，Friedman，J.，Valdivieso，M.，Plunkett，W.Marti，J.R.等人，（1982）Biochem Pharmacol.31：3317-3321。因为它相对地缺少毒性和一些坚固鼠肿瘤系的敏感性，所以PALA已用于实验肿瘤学研究中。最近的研究表明当与卤代嘧啶例如5-氟尿嘧啶一起在体外和体内使用时，PALA具有独特的调节活性。见Liang，C.，Donchower，R.C，Chabner，B.A.（1982）Mol，Pharmacol.21：224-230;Ardalan，B.，Galzer，R.I.，Kensler，T.W.等人，（1981）Biochem.Pharmcol.30：2045-2049;Anakarahanonta，T.，Holstege，A.和Keppler，D.O.R.（1980）Eur，J.Cancer16：1171-1180。最近，PALA作为嘧啶生物合成抑制剂已被公开，它可用于处理自免疫疾病、慢性炎症和器官移植排斥。参见国际申请PCT/US90/05942，WO91/06863，于1991年5月16日公开。
该文献的一篇评论表明PALA在单独用于治疗癌症（瘤）时在临床上效果较差。见Valdivies，M.，Moore，E.C.，Burgess，A.M.，Marti，J.R.，Russ，J.Plunkett，W.（1980）Cancer Treat.Rep.46：1301-1305;Ehrichman，C.，Strong J.M.，Wiernik，P.H.，McAvoy，L.M.，Cohen，M.H.，Levine，A.S.，Hubbard，S.M.，和Chabner，B.（1979）Cancer Res.39：3992-3995;Grem，J.L.King，S.A.，O Dwyer，P.J.和Leyland-Jones，B.（1988）Cancer.Res.48：4411-4454。
一篇涉及膦酰基乙酸（“PAA”）及其类似物的结构活性关系的报告已经问世（Mao，J.C.H.等人，1985，Antimicrob.Agents Chemother.27（2）：197-202）。这些工作者们发现PAA是一种选择性的抗疱疹病毒试剂并且还发现PAA的诱导作用导致较低的活性而无一例外。尤其是，发现PALA的效果显著低于亲代PAA，其倍数在200以上。
抗病毒药物的一般发展
自从人们发现了卤代核苷酸能作为抗病毒用于疱疹角膜炎的治疗以来，在开发用于合成链终止剂的复杂工艺之前，有一段很长的滞后期，所述链终止剂例如用于HSV的无环鸟苷、2′，3′-二脱氧胸苷类似物例如用于HIV的AZT，ddⅠ，和ddc;用于拉萨热（Lassa fever）、Hantaan和呼吸合胞病毒的三氮唑核苷（vizazole）;碳环核苷酸、cyclobut-A，它们都对HIV和疱疹病毒（CMV、HSV、水痘）具有广谱抗病毒活性，还有无环核苷酸，膦酰基-甲氧基乙基腺嘌呤（PMEA），它们在很宽范围内具有抗RNA和DNA病毒性。许多这类化合物已经被证明在临床使用时有剧毒和/或迅速导致抗药菌株的发育;其中后面的这些病毒，有许多似乎表现出对对照化合物的交叉抗性，例如AZT与ddC，同时;药品抗性或毒性的发展导致使用组合疗法，开始是为HIV，以达到附加和/或协同效应。见Larder，B.A.，Purifoy，D.J.M.，Powell，K.L.和Darby，G.（1987）Nature（Lond）327：716-717。DeClercq，Erik E.（1987）Cancer Res.7：1023-1038。
另外一种抗病毒是2-脱氧-葡萄糖（2-dGlc），它公开于US4，315，001中。这种化合物对抗“外来”RNA病毒（例如，不是美国固有的那些病毒）几乎没有取得成功，据推测可能是因为N-连接糖基化过程在感染过程中似乎没有起到主要的作用（还有一个事实是在后者基因上只有很少一些低聚糖链）。然而，Blough，H.A.，Kefeuver，D.Clausen，H.和Hausen，J.-S（1991）在Proc.Amer.Soc.Trop.Med.&Hyg.45：168 Boston，MA（摘要）中最近报导了原始碳水化合物中一种新抗原的存在，它可能是O-连接在白蛉热（SFB）和黄热病（YE）病毒粒子上的;用特异单克隆抗体予处理这些RNA病毒，（对这些碳水化合物）可以中和这些本雅（bunya-）病毒和黄热病病毒（flaviviruses）。
人们已经知道了一些与HIV的RT结合的新药和防止病毒融合，以及由此防止病毒进入的糖基化作用抑制剂（例如，2-dGlc）。还已知了细胞激动素（cytokines）（例如干扰素）、调节基因的抑制剂、阻断流行性感冒病毒脱壳的金刚胺（adamantidine）和以受体水平为目标的新化合物。然而，很清楚的是在本发明的时候，人们尚不认为广谱抗病毒是可能的，这主要是因为被公认的毒性以及缺少“目标”。许多新途径是遗传学的和/或分子的;反义或无义的寡聚物，用遗传工程的和/或合成的肽作疫苗，和/或目标蛋白酶抑制剂-都以单病毒为目标（即，那些具有单一的或专门的核苷酸和/或氨基酸序列的）。
考虑到本领域的目前状态，人们希望有一种广谱抗病毒试剂，它既能单独使用也能与其它治疗结合使用，特别是与另外的抗病毒一起使用，从而治疗或防止病毒感染。很清楚，就结合治疗而论，这样的一种广谱抗病毒试剂可以降低现时使用的抗病毒的毒性或有害作用，由此提供了较好的治疗指数。
本发明涉及治疗或防止人、动物和鸟类病毒感染的方法，它采用有效量的PALA或药物许可类似物，单独使用或与其它治疗试剂一起使用均可。本发明另一方面涉及用于治疗或防止人或兽类病毒感染的药物组合物和配方，其中所述组合物包含有效量的PALA或其药物许可的类似物。本发明部分是基于这样一个发现，即虽然据报导PALA在单独使用时，在治癌方面相当无效，但当PALA用作抗病毒时其反面却是真实的，即单独使用时，PALA具有广谱抗病毒活性，而当它与其它药物（包括但不限于抗病毒试剂和/或病毒复制抑制剂）一起起作用时，则PALA具有附加的和/或协同效应。
因此，本发明的目的是提供一种抗病毒化合物，该化合物对广谱抗病毒是有效的。
本发明第二个目的是提供组合治疗，该治疗能阻止病毒对PALA抑制作用的可能回避。另外，本发明进一步的目的是提供组合治疗，它能降低PALA和/或与PALA一同使用的治疗试剂的毒性。
本发明第三个目的是治疗遭受病毒（包括反转录病毒）感染（或可能向病毒暴露的）的人、动物和鸟类的方法，并且提供防止在人、动物和鸟中发生这类感染（化学预防）的方法。
本发明的第四个目的上提供用于治疗遭受病毒感染的（或可能向病毒暴露的）人、动物和鸟类的药物组合物。对于防止在人、动物和鸟类中发生这类传染，这种药物组合物也是有效的。
本发明第五个目的是提供广谱抗病毒化合物，它具有低水平的毒性，因而具有较高的治疗指数。
本发明第六个目的是提供广谱抗病毒试剂，当将它单独或与其它药物（包括但不限于抗病毒试剂和/或病毒复制抑制剂）结合使用时，它对于抗药性病毒菌株具有极好的使用价值。
本发明第七个目的是提供药物许可的PALA类似物，口服给药时它能显示出抗病毒活性。
根据本说明书和所附权利要求书，本发明的种种目的对于所属技术领域的一般技术人员来说是明显的。
图1是AD169HCMV滴定图，它是由对接种DHPG（ganciclovir）后的上清液测试中获得的。
图2是与AD169细胞结合的HCMV滴定图，它是由接种DHPG、PALA后或空白对照物的经过超声处理的细胞球获得的。
图3是HCMV临床分离物滴定图，它是由接种DHPG、PALA后或空白对照物的上清液测试中获得的。
图4是与HCMV细胞结合的临床分离物滴定图，它是由接种DHPG、PALA后或空白对照物的经过超声处理的细胞球获得的。
图5是HCMV DHPG抗性分离物滴定图，它是由对接种DHPG、PALA后或空白对照剂的上清液测试中获得的。
图6是与HCMV细胞结合的DHPG抗性病毒滴定图，它是由接种DHPG、PALA后或空白对照剂的经过超声处理的细胞球获得的。
图7是在下文例5动物中发现的玻璃体炎严重程度的条形图。
图8是例6中单一和结合试剂治疗组中的平均玻璃体炎严重程度的条形图。
图9是例7治疗组中发现的平均玻璃体炎病严重程度的条形图。
图10是例7治疗组中平均视神经疾病严重程度的条形图。
图11是PALA、PALA+三氮唑核苷和对照治疗组的病毒滴定度条形图。
图12是PALA、利福平和PAL+利福平治疗组的疫苗损害等级分的标绘图。
图13是治疗组PALA、利福平和PALA+利福平的牛痘病毒滴定度对数的标绘图。
本发明涉及治疗人类和动物，包括鸟类广谱抗病毒感染的方法，它包括向需要治疗或防止病毒感染的人或动物体施用有效量的PALA或其药物活性的类似物。本发明方法还包括组合治疗法，其中PALA和至少一种别的治疗药剂作为混合物或按次序给药。本发明还涉及药物组合物，其活性成分包括化合物PALA或适当的类似物，并且任选地可与至少一种用于治疗人、动物和鸟类病毒感染的选定的药品以混合物形式使用。
本发明部分是基于这样一个发现，即PALA是一种据报导在单独使用时对治疗癌症无效的药品，但当作广谱抗病毒使用时却有效。当单独使用或与别的药品一块使用时，都证明PALA作为抗病毒剂用于人和兽类中具有普及利用价值。
用PALA治疗病毒感染
病毒，按其定义属于专性胞内寄生虫，它取代寄主细胞组织机构并利用现存的胞内结构，如多核蛋白体、内质网、高尔基体和特定的寄主细胞大分子，即酶、tRNA等，来产生病毒mRNA的模板或转录体。利用特有的聚合酶可转录病毒核酸，而利用病毒mRNA可翻译病毒蛋白（结构的和非结构的）。还可以进行转译后的修饰（通过蛋白酶裂解和糖基化作用）。病毒组合可以再次发生（裸病毒粒子）或采用可将重复表面突出物（粘蛋白）包埋在其中的脂质膜。在后一情况下，被膜包围着病毒粒子。
适宜根据本发明用PALA处理的病毒包括所有的已知病毒的型和类，其中包括DNA和RNA病毒（阳性和阴性链状病毒）。PALA能用于抗DNA和RNA病毒和病毒类型，它们包括但不限于下列：
腺病毒（Adenoviruses）
痘病毒（Poxviruses）
牛痘（Vaccinia）
软疣接触传染病毒（molluscum contagiosum virus）
牛痘病毒构建物（vaccinia viral contructs）
本雅病毒（Bunyaviruses）
立夫特山谷热病毒（Rift valley fever virus）
白蛉热病毒（Sandly fever virus）
登革热病毒（Denguc viruses）
疣特托罗（Punta Toro）
黄热病病毒（Flavivirus）
黄热病病毒（yellow fever virus）
流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）
疱疹病毒（Herpesviruses）
巨细胞病毒（cytomegalovirus（CMV））
水痘（Varicella）
人疱疹病毒-6（human herpesvirus-6）
Mare′x疾病病毒（兽类）
马贫血病毒（Equine anemia virus）
疱疹病毒1和2（herpesviruses 1&2）
爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒（Epstein-Barr Virus）
副粘液病毒（Paramyxoviruses）
呼吸合胞体病毒（respiratory eymcytial virus）
麻疹病毒（measles virus）
副流感病毒（parainflnenza viruses）
牛瘟病毒（rinderpest virus（兽类））
新城疫病毒（Nencastle disease virns（兽类））
腮腺炎病毒（mumps）
流感病毒（ortlomyxoviruses）
流感A（H2N2& H3N2
流感B（某些菌株）
流感C
肝炎病毒（Hepadmaviruses）
乙型肝炎
其它肝炎病毒（未完全分类）
甲型肝炎（HAV）
丙型肝炎（HCV）
肝炎E（HEV）
细小核糖核酸病毒（Picornaviruses）
脊髓灰质炎病毒（Polioviruses）
柯萨奇病毒（Coxsackieviruses）
埃可病毒（ECHO viruses）
口蹄疫（foot & mouth disease（EMDV）（兽类）
鼻病毒（rhinoviruses）
棒状病毒（Rhabdoviruses）
狂犬病病毒（rabien virus）
外衣病毒（Togaviruses）
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelean equine encephalitis virus）
丝状病毒（Filoviruses）
欧鲍拉病毒（Ebola virus）
马堡病毒（Marburg virus）
乳多空病毒（Papovaviruses）
人乳头瘤病毒（human papilloma virus）
风疹样病毒
风疹病毒（rubella virus）
斑状病毒（orbiviruses）
科罗拉多蜱热病毒（Colorado tick virus）
胡宁和马体波病毒（Junin & Machupo viruses）
Hantaan病毒
Hantaan出血热病毒（Hataan henurrhagio fever virus）
刚果/克里米亚出血热病毒（congo/crimean hemorrhagio fever virus）
反转录病毒和豆状病毒（Lentiviruese）
HTLV 1和2
HIV 1和2
当用于本文时，术语“病毒感染”说明一种病态，其中一种病毒侵入健康的细胞，利用该细胞的繁殖“机构”去重复或复制且最终溶解该细胞导致细胞死亡，释放出病毒粒子以及使其它细胞受到所产生的子代病毒的感染。受某些病毒的潜伏感染也是产生病毒感染的一个可能后果。很清楚所属技术领域的一般技术人员应当理解这些术语的涵义和与它有关的疾病和/或感染。
此外，当用于本文时，短语“治疗或防止人、动物或鸟类病毒感染”意思是抑制特定病毒的复制或防止病毒本身构建于其寄主中以及改善或减轻由病毒感染引起的疾病症状。
当用于抗这些病毒时，PALA及其药物许可的类似物可单独使用也可与另外的治疗试剂一起使用。现已发现当治疗疱疹病毒时，最好PALA与另外的治疗试剂如抗病毒无环鸟苷或ganciclovir一块使用。在组合治疗疱疹病毒中使用PALA或药物许可类似物，其效果将超过现在所能得到的治疗;例如可以降低现时用于治疗这些病毒感染的抗病毒的毒性。另外，PALA或其药物许可类似物，对具有抗药性的疱疹病毒菌株具有独特的使用价值，如对于无环鸟苷或ganciclovir。此外，PALA或其药物许可类似物在延期或阻断抗性病毒菌株，如DHPG或无环鸟苷的发展方面也是有用的。
还发现PALA或其药物许可类似物能单独使用或与另外的药物如抗病毒的利福平一块使用，以用于治疗或防止由牛痘病毒或用于制备疫苗的牛痘病毒构建物引起的感染。涉及使用牛痘构建物的职业危害性由此而降至最低。通常，使用PALA或其药物许可类似物可使受到免疫损害的个体得以保护或治疗。
还发现PALA或其药物许可类似物，作为单一的体内治疗呼吸合胞体病毒的试剂较三氮唑核苷更加有效。
五种主要的病毒性肝炎已被鉴定（Consolo和Freni，Nephron 61：252-254，1992），它们代表不同的病毒（DNA和RNA）分子组。这些病毒性肝炎病毒是甲型肝炎（HAV）、乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（非甲、非乙型肝炎或HCV）、肝炎D（δ因子或HDV）以及肝炎E（HEV）。广谱抗病毒是一种理想的抗这些病毒的试剂，这是因为它们在遗传上和分子上存在着相异性。使用PALA或其药物许可类似物（或单独或与另外的治疗药剂，包括另外的抗病毒一块使用）去治疗或防止由甲型肝炎、丙型肝炎和乙型肝炎引起的病毒感染属于本发明的范围之内。尤其是，PALA能单独使用，也能与DHPG（ganciclovir）、膦酰基甲酸酯、3TC（Biochem Pharma & Glaxo）、α-干扰素（α-2b IF）或甾类化合物一块使用，上述这些药物都是通常用于阻断肝炎发炎反应，治疗或预防由乙型肝炎引起的病毒感染的药物。
为了说明其广谱抗病毒活性，我们对PALA抗大量病毒，例如有军用意义的病毒，如黄热（flavi-）、本雅（buya-）和外衣病毒（togaviruses）的情况进行了检测并且在内含牛痘病毒的筛子中对PALA进行了检测。后者病毒的存在具有异乎寻常的意义，这是因为此时广泛采用了质粒构造物，在该构造物中牛痘被用作为载体来产生活疫苗。随后实验由黄热一、外衣-和本雅病毒向涉及美国大陆公共健康重要意义的病毒方面扩展，如粘液病毒、疱疹病毒（CMV，水痘）副粘病毒和正极性RNA病毒（细小核糖核酸病毒）以及反转录病毒。尽管不限于任何理论，但我们相信PALA是通过抑制副嘧啶生物合成，即ATCase的早期步骤，结果使核苷酸库减少，或通过抑制病毒DNA聚合酶，结果产生如下表1-3中所示的活性而发挥其抗病毒作用。
此外，我们还对PALA对在初级鸭肝细胞培养基内的鸭乙型肝炎;非洲绿猴体内的猴水痘病毒的感染;非洲绿猴体内牛痘病毒;以及在兔子体外和体内人类巨细胞病毒（HCMV）的抵抗情况进行了测试。由这些研究所得到的结果将描述在下文的各实例中。
PALA可与另外的治疗试剂一块使用，以便能提高所达到的抗病毒效果。例如，这些附加的抗病毒试剂包括但不限于在与病毒复制有关的不同靶分子上起作用的那些试剂;在同种分子不同位置上起作用的那些试剂;能抑制补救途径（下文说明）从而防止或降低病毒抗性出现的试剂。
当PALA或PALA药物许可类似物用于组合治疗中时，最好将PALA与其它治疗试剂分开但持续地给药，另外，还可间歇地施用PALA。
虽然病毒有自己的DNA或RNA聚合酶，但比较复杂的病毒，即疱疹病毒和痘病毒，（仅少量举例）还具有负责核苷酸生物合成的单个酶，例如转磷酸核糖基酶或核苷酸磷酸化酶，这些酶也可以作为寄主细胞酶存在。这些酶可赋予嘧啶合成另一种路线或“补救途径”，从而回避了抗病毒试剂的抑制作用。因此，正如某些瘤的情况那样，可能会出现对抗病毒化合物的病毒抗性，但这种可能性可以通过组合治疗而避开，例如将核苷酸类似物与PALA及其它抗病毒试剂结合使用，所述的核苷酸包括但不限于腺嘌呤阿糖苷、腺嘌呤阿糖苷单磷酸、碘苷、三氟胸苷、无环鸟苷（acycloquanosine）、溴乙烯基脱氧尿苷、溴乙烯基脱氧阿拉伯尿苷（bromovinyldeoxyarauridine）（Bristol-Myers Squibb的BvaraV）、氟碘阿拉伯胞嘧啶（fluoroiodoaracytosine）、DHPA和三氮唑核苷（vizazole）、糖基化抑制剂（如2-dGlc）、蛋白酶抑制剂、干扰素、核苷酸运载抑制剂如双嘧啶氨醇和硝基苄硫代肌苷，DNA从属RNA聚合酶抑制剂，例如利福平（rifadin）、链终止剂，例如ganciclovir（DHPG）、无环鸟苷（ACV）、AZT、ddc。
除了概述于下文表1-3的实验以外，我们还进行了PALA与其它抗病毒化合物结合的实验;例如，将PALA与抗白蛉溪谷热病毒（Sandfly valley fever）的三氮唑核苷（virazole）结合并且和2-脱氧-D-葡萄糖（2-dGlc）（一种已知的抗HSV）的抗病毒（人们已经用它在人身上进行了扩大临床试验，见Blough，H.A.和Giuntoli，R.G.（1979）J.Amer.Med.Assoc.241：2798-2801）结合在一起。PALA还可任选地与利福平（rifadin）结合用于牛痘;任意地与AZT、ddI、ddc及其混合物结合用于HIV-1和2;任意地与金刚胺（adamantidine-）结合用于流行性感冒;任意地与三氮唑核苷（virazole）结合用于拉萨热、Hantaan和CCHF病毒;和任意地与无环鸟苷ACV结合用于水痘-带状疱疹以及任意地与干扰素-α或氟尿嘧啶结合用于人乳头状瘤病毒。
上述实验结果证实PALA与其它的病毒抑制剂结合较任何一种单独的化合物能达到更好的抑制效果。例如2-dGlc本身无抗黄热病毒的效果，但用PALA与2-dGlc一起就能观察到增强的抗SFS的效果。另外，与未处理的对比物和感染过HIV同时仅接受单一抗病毒（仅AZT或反PALA）处理的细胞相比，采用PALA和AZT的组合治疗能使HIV-1的病毒复制大约再降低20%，（用放射免疫沉淀法或Western印痕法（用密度测定仪定量）根据P24的下降而测出）。此外，将PALA与另外的抗病毒试剂结合起来使用会使所用的一种或两种活性试剂的剂量降低，以便使治疗指数提高，而有毒的副作用降低。
因为PALA没有显现出改变体液的免疫应答-至少是在长瘤的动物中（Johnson，R.K，Swyryd，E.A.和Stark，G.R.（1978）Cancer Res.38：371-378），根据本发明使用PALA可以使某些病毒获得共同免疫（采用合适的疫苗，例如灭活的病毒或合成肽作免疫原）。如上面所指出的，所遇到的潜在问题是抗性菌株可能会通过突变或选择或因某些病毒（或细胞）具有使用DNA合成的“补救”途径的能力而发生进化;（这些补救途径在感染HSV的细胞中似乎是有效的），由此将失去效果。
另外，PALA能穿过脑血栓，因此在视网膜和脑内可达到较高的浓度;从而，PALA在治疗由HIV诱导的脑病方面、和由CMV诱导以及由水痘诱导的视网膜炎方面是有用的。
PALA的预防和其它用途
对于进入正流行某些“外来RNA病毒”，但至今还不能得到免疫（对那种病毒）或未取得效果的地理区域的个体来说，PALA还可作为预防药品。另外，多价的、遗传工程疫苗可使用牛痘构建物;这样一来，在病人和或在实验工作人员身上采用综合牛痘的可能性将是现实的。由于可以采用像单一的PALA，或其与利福平（rifadin）结合起来的一种药品，这就给治疗的医生一个特别的回旋机会。许多带有这种遗传工程病毒的上述个体（偶然暴露），可以作为门诊病人而用PALA接受治疗，预防性的、治疗性的皆可。
PALA还可用于妊娠期以防止病毒向胎儿转移，只要无畸胎作用就可以。PALA可用于移植外科手术中，例如做化学治疗的肾脏和骨髓移植接受者以及因为器官或骨髓移植体经常受CMV治疗的癌症病人。为了防止在供体组织内存在的病毒发生复制，受体和供体都要用单一的PALA或组合疗法加以治疗，例如在捐献或接受组织或器官移植之前按照医生的诊断进行治疗。
PALA对于除了传染人的副粘液病毒（包括麻疹）之外的呼吸合胞体（respiratory syncytial）病毒（RSV）是有用的，因此PALA可通过静脉向婴儿施药，无须使用三氮唑核苷（virazole）必须的昂贵的正压力器械。另外，在黄热（flavi）-、外衣（toga）和本雅病毒上（表1）使用PALA的结果为抗“外来”病毒提供了一种新的治疗和化学治疗方法，所述“外来”病毒在世界偏僻地域能够遇到;PALA对欧鲍拉（Ebola）、马堡（Marburg）和拉萨（Lassa）热病毒是有功效的。此外，兽医学上重要的病毒，例如口蹄疫（foot and mouth disease）（FMDV）、牛瘟（rinderpest）、新城疫病（New castle disease）、假性狂太病、马贫血症和牛鼻气管炎病毒，都可用PALA进行诊治;因此PALA能预防或控制动物的流行病，防止或改善由于病毒性疫病而引起的严重经济损失，所述动物包括但不限于家畜，鸟或马，尤其是赛马。
剂量
在治疗已感染病毒的动物，特别是人时，应施用治疗上有效量的PALA，即以足够抑制病毒复制的剂量给药。例如，PALA作为一种浸剂用药量每天大约1-100mg/公斤，持续约1周到1个月。优选的剂量为约25-50mg/kg;按表面积计PALA或其药物许可类似物的日当量剂量，为约100-约600mg/m2。最佳剂量约5mg/kg-60mg/kg，持续约1周到1个月。PALA或其药物许可类似物的剂量间隔为约1周到1个月，最好约7到约10天。优选的用药剂量应使PALA或其药物许可类似物达到约50-约100μM的峰值血浆浓度。这一点可通过例如静脉注射无菌的含有约0.05%～10%用药组分的溶液（在缓冲盐水中）（对药物化学领域的一般技术人员是已知的任何适当盐水溶液都可使用）。根据用HPLC测得的血浆水平通过连续注入PALA而维持所需的血液浓度。通过降低各种药品的剂量约25%-50%，可以实现用PALA或其药物许可类似物进行组合疗法。应该注意护理医生应知道如何进行和什么时候终止、中断或将治疗调节到较低剂量，这是考虑到毒性、或骨髓、肝或肾功能障碍。相反，护理医生还应知道如果临床反应未满足要求（不包括毒性在内）时，则应将治疗调节至较高的水平。与上述讨论过的对应方案可用于兽类。
在急性和慢性治疗病毒感染中所用的PALA的预防或治疗的剂量范围随所处理的病情的严重程度和用药途径而变化。再次声明，应该注意的是门诊医师或医生应知道由于毒性或骨髓、肝或肾功能障碍而在什么时候中断和/或调节治疗剂量。剂量以及用药频率，将依年龄、体重和各个病人的反应而变化。通常，如上所讨论的，对于本文所述大多数的病毒来说PALA或其药物许可类似物的日总剂量范围，约为1-100mg/kg病人。优选的日剂量范围在约5-约75mg/kg之间，然而最佳的日剂量范围应在约5-60mg/kg之间。另一个优选的范围是每天约25-50mg/kg。在治疗病人时，治疗应从较低的剂量开始，例如约5mg/kg-约10mg/kg，然后提高到约25mg/kg或更高，这取决于各个病人的反应。进一步推荐的是对于婴儿、儿童和超过65岁的病人，以及肾脏或肝功能有障碍的那些人，开始时接受低剂量，并且根据个体临床反应和血浓度进行滴定。正如本技术领域的一般技术人员都清楚的那样在某些情况下，必须使用超出这些范围的剂量。各种术语“足够减轻或防止病毒感染的量”、“足够治疗或防止病毒感染的量”或“有效抗病毒量”意思都是指上述用药剂量和剂量频率计划。
如下面进一步讨论的，为了向病人提供有效剂量的PALA，任何合适的用药途径都可使用。例如，口服、肠胃外的（皮下的、静脉的和肌肉的）;直肠的、经皮的、阴道等。剂型包括片剂、锭剂、分散剂、悬浮剂、栓剂、溶液、胶囊、乳剂、膏、微型泵（Alza公司）等。
药物组合物
本发明的药物组合物含有作为活性成分的PALA或其药物许可类似物，所述化合物在治疗或防止人、动物和鸟类的病毒感染方面是有效的。这些药物组合物还可含有治疗剂，包括除了PALA或其药物许可类似物之外的其它一些抗病毒试剂;这些新的组合物为治疗病毒感染提供了组合疗法。这种组合疗法具有附加的和/或协同效果。
例如，含PALA的药物组合物任意地可含有至少一种其它的治疗试剂，如核苷酸类似物，包括核苷酸运送抑制剂;和链终止剂（例如二脱氧核苷酸）。适用于与PALA或其药物活性类似物的组合疗法中的一些化合物可以在：Fields Virology，2nd Edition，Raven 1990;White，D.O.and Fenner，F.，Chepter T7“Chemotherapy of viral Diseades”in Medical Virology，3rd Edition，Academic Press，Inc.，Crlando，Fla，1986中找到，这些文献公开的内容作为参考文献编入本文。适用于本发明内的PALA组合疗法的化合物包括但不限于2-脱氧-D-葡萄糖（2-dGlc），脱氧野尻霉素、无环鸟苷（acycloguanosine）、三氮唑核苷（Virazole）、利福平（rifadin）、金刚胺（adamantidine）、利福丁炔（rifabutine）、ganciclovir、（DHPG）3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷（AZT或Zidovudine）、2′，3′-二脱氧肌苷（ddI）、2′，3′-二脱氧胞苷（ddc）、氟碘阿拉伯胞嘧啶（fluoroiodoaracytosine）、碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷（ara-A）、ara-AMP、溴乙烯基脱氧尿苷、溴乙烯基阿拉伯尿嘧啶（bromovinylarauracil）（BVaraV，来自Bristol-Meyers Squibb（1-β-D-阿糖-furanylo-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶））金刚（烷）乙胺、苯己庚二酮、二芳基脒、（S）-9-（2，3-二羟丙基）腺嘌呤（DHPA）、干扰素-α、双嘧啶氨醇、硝基苄基硫代肌苷、S-（P-硝基苄基-）6-硫代肌苷和膦酰基甲酸。属于本发明的新型药物组合物包括但不限于PALA，或其药物许可类似物，和三氮唑核苷（virazole）;PALA和利福平（rifadin）;PALA和AZT;PALA和ddI;PALA和ddc;PALA和金刚胺;PALA和无环鸟苷（acycloguanosine）;PALA和2-脱氧-D-葡萄糖;PALA和脱氧野尻霉素;PALA和干扰素-α以及PALA和ganciclovir。本发明还包含药物组合物，该组合物含PALA，或药物许可的类似物，和任选一种以上的另外的治疗化合物，以提供组合疗法。
PALA的制备
PALA及其大量的类似物的制备可按照下述方法进行，这些方法描述于US4，179，464、4，215，070、4，267，126、4，348，522、4，154，759、4，178，306和GB2008118和GB2051070，这些专利所公开的内容作为一个整体编入本文作参考。此外，PALA也可按照下列另外一些方法来制备，这些方法为Gloede，J.等人（1988）Pharmazie43（6）：434;Henklein，P.等人（1989）DD272092A1 Sept.27，1989;Kafarski，P.等人（1982）Synthesis 3：219-221;Montero，J.L.等人（1982）Eur.J.Med.Chem-chim.Ther.17（1）97-99;Stiebitz，B.等人（1991），DD286589 A5 Jan.31，1991;Goodson，J.J.等人（1980）J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1（12）：2721-2727，这些文献公开的内容作为整体编入本文作参考。
PALA类似物
在本发明另一些特殊实施例中，大量的N-（膦酰基乙酰基）-L-天冬氨酸（PALA）类似物被用作为广谱抗病毒试剂。正如所属技术领域的一般技术人员都清楚的那样，PALA含4个高酸性的氢（即两个羧酸质子和两个膦酸质子）和一个碱性氮取代基。因此，在游离酸、酯、无机或有机盐官能物之间可能存在许多种组合。这些可能性通过PALA通式的结构表达式可以更好地被理解，该通式中包含游离酸、盐、酯或结合这些官能团的化合物，术语“PALA的类似物”用于本文的意思包括任意的盐、酯或其它衍生物，这些物质是通过可得到的官能物由PALA制成的。术语“PALA”用于本文时其含义包括质子化的酸或N-（膦酰基乙酰基）-L-天冬氨酸的药物许可盐。优选的一种盐是二钠盐;另一种是下文的四钠盐。PALA的类似物在本发明的药物组合物中具有特殊的使用价值，尤其是为口服用药配制的那些。
N-（膦酰基乙酰基）-L-天冬氨酸（PALA）核
上述通式PALA核中的R基团独立地代表氢、烃、硅烷、有机盐或无机盐基团，以及这些基团的所有可能的组合。当R是烃基时，所得到的类似物可称为羧酸酯或膦酸酯。烃基可具有1-20个碳原子，最好1-8个，在性质上可以是环状的，无环的，芳族的或脂族的，它还可任意地含有一些官能团，如羟基、醚基、氨基、硫醚基、锍基、氟及其类似物。合适的烃取代基的特殊例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环己基、苯基、苄基、对-硝基苄基及类似物。
当然，也可获得相应的硅烷酯，其中的R是硅烷基，如三烷基甲硅烷基（例如三甲基甲硅烷基、三-叔-丁基甲硅烷基或甲基-二-叔-丁基甲硅烷基以及类似物）。
本发明还期待制备和使用作为抗病毒试剂的PALA类似物。在本发明一些特殊实施例中，通过本领域内一般技术人员所熟知的方法来制备PALA的铵，一、二、三和四元取代的铵盐，这些方法包括但不限于PALA和胺之间的简单的酸碱反应或通过离子交换柱。正如一般技术人员所显而易见的，各种胺都可以用来生成胺盐，它包括伯、仲或叔胺。确实，甚至季铵基也能生成PALA盐，只要PALA以盐的形式存在即可。当然，PALA的胺盐可以根据特定碱或取代物的量、强度或而仅与在分子其它酸性部分处存在的磷酸盐基团，一个或两个羧酸基团，或按上述结构式所描绘的PALA核的全部酸性部分相结合。
尽管并未打算只限于公开于本文那些物质，但是为了读者的利益现举出下列胺。其它合适的无机盐在本说明书的其它部分已经提到，而且应该理解到这些无机盐能和烃或硅烷酯基团、以及用有机胺举例说明的有机盐一块存在。因此，无机铵离子源的使用是有利的，例如除了氨本身以外的氢氧化铵、碘化铵、溴化铵、氯化铵以及类似物。
有机胺也是合适的，正如早已指出的那样。例如，低级烷基（如C1-C4烃）胺基具有极大的使用价值。烷基醇胺（其中存在着氨基和羟基）是特别希望的。因此，甲醇胺、乙醇胺、丙醇胺、异丙醇胺、丁醇胺等都可制成具有吸引力的PALA胺盐或类似物。同样地，二烷基醇，三烷基醇或四烷基醇铵的基团也是希望的。含有多氨基的化合物也在预见之中，如乙二胺、二乙三胺或其N-烷基或其N-链烷醇-取代衍生物。另外，N-烃取代基的定义类似上述酯烃基的定义，即它们可以是环状、无环、脂族或芳族并且可任意地含有除羟基以外的官能团，如醚基、氨基、硫代醚基、巯基、氟及类似物。
下列文献中详细地描述了制备PALA及其类似物的方法，这些文献公开的全部内容作为参考而编入本文：Stiebitz等人，DD286589 A5（1991）;Henklein等人，DD272092 A1（1989）;Gloede等人，Pharmazie43（6）：434（1988）;Mao等人，Antimicrob，Agents Chemother，27（2）：197-202（1985）;Kafarski等人，Synthesis3：219-221（1982）;Goodson等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1（12）：2721-7（1980）;Montero等人，Eur.J.Med.Chem-Chim.Ther.17（1）：97-9（1982）;Cole等人，Biochem.J.255（3）：813-16（1988）;Starks等人，DE2849396（1979）;Bakunniak等人，J.Environ.Sci.Health.Part B B18（4-5）：485-96（1983）;Collins等人，J.Biol.Chem.246（21）：6599-605（1971）。
药物制剂
本发明的药物组合物包含作为活性成分的PALA，或其药物许可类似物，并且还可含有一种药物许可的载体以及任选的其它的治疗成分。
如上所指出的，术语“药物许可的类似物”包括盐类、酯类和其它的PALA的衍生物。所述盐类是由药物许可的非毒性酸与碱制备的（包括无机酸或碱和有机酸或碱）。这种盐可包括碱金属盐，例如钠或钾，以及碱土金属盐或铵盐。多种PALA的盐都能在上面提过的Schultz等人和Parson等人的专利中找到。
此外，由于本发明的化合物是两性的，所以盐可以由药物许可的非毒性碱或酸（包括无机和有机碱或酸）和金属制成。适合本发明化合物的药物许可的碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐，或由N，N′-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲基葡胺（n-甲基葡糖胺）和普鲁卡因制成的有机盐。优选的盐是PALA的四钠盐，另一种优选的盐是PALA的二钠盐。
在本发明一个特殊实施例中，公开了适于口服、直肠、经皮进入、局部的、阴道和非肠胃（包括皮下、肌肉和静脉）用药的制剂，尽管在任何指定的情况下，其最合适的途径将取决于所治疗的或防止的病毒性疾病的性质和严重程度。优选的一种用药途径是通过静脉注射。本发明组合物可以较方便地以单位剂量的形式提供，并且可通过任何为药物化学领域的一般技术人员知晓的方法制备。
在实际应用中，可以按常规药物配料技术将PALA作为紧密混合物中的活性成分与一种药物载体混合。所述载体可以有多种形式，这取决于用药所要求的剂型，例如口服的或非肠胃的。在制备适于口服剂型的组合物时，任何常用的药物介质都可以使用。常用的药物介质包括例如水、甘醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等（在口服液体制剂的情况下，例如，悬浮剂、溶液和酏剂）;在气雾剂的情况下，表面活性剂（用于输送通过粘膜）;或载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘着剂、分散剂等（在口服固体制剂的情况下，例如，粉剂、胶囊和片剂）。口服固体制剂比口服液体制剂优先。最优选的口服固体制剂是片剂或胶囊。当用直肠用制剂时，可在聚乙烯二醇组份中制备该制剂。
由于易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位类型，在这种情况下需使用固体药物载体。如果需要的话，还可通过标准含水的或无水的工艺对片剂制作进一步涂覆。
除了上述普通的剂型外，本发明的所述化合物还可通过受控释放装置和/或输送装置用药，该装置包括Alzet渗透泵，它可以由Alza公司获得。合适的输送装置已描述于US3，845，770;3，916，899;3，536，809;3，598，123;3，944，064和4，008，719中。这些专利的公开内容全部编入本文供参考。
本发明适用于口服给药的药物组合物可按独立单位提供（例如胶囊、药包、或片剂、或气雾剂），每一种都含预定量的活性成分，该组分可以是粉末或颗粒、或作为在水溶液、非水溶液、水包油型乳状液中的一种溶液或一种悬浮液、或油包水型液体乳状液，或以适当的乳液用于局部或阴道内。这些组合物可通过药物学中任何已知的方法来制备，但所有的方法都包含使活性成分与载体结合的步骤，该载体中一种或多种必要的成分组成。通常，制备所述组合物的过程都是将活性成分和液体载体或粉末状固体载体或两者均匀地且紧密地混合，然后，如果需要的话，将产品成型为所需的形式。
例如，可以经过压制或模制而制备一种片剂，此时可任选地带有一种或多种辅助成分。制备压制片剂时可通过将自由流动的活性成分如粉末或颗粒在合适的机器中加压加压制成，此时该活性成分可任选地与一种粘着剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合，制造模制片剂时，可以在一适当的机器内，对用惰性液体稀释剂润湿过的所述粉状化合物的混合物进行模制。按要求，每一片剂含约100-约500mg的活性成分，而每个药包或胶囊含100mg-约500mg的活性成分，PALA。最好，片剂、药包或胶囊含3分之一剂量，约100mg、约200mg、或约500mg的活性成分。
本发明所述的化合物特别适合用胶囊包起来（例如用脂质体）或与蛋白载体及类似物交联。具有该性质的一些输送系统描述于“Biological Approaches to the Controlled Dilivery of Drugs，editor R.L.Juliano，Volume 507，Annals of the New York Academy of Sciences（1987），该文献的公开内容编入本文供参考。
适用于静脉、皮下或肌肉注射的配方列于下面。
配方 数量
A B C
活性成分PALA,
二钠盐 125mg 250mg 500mg
消毒的无热原物的水,
它具有PALA的EDTA
(1.0mg/ml)适量到5ml 25mg/ml 50mg/ml 100mg/ml
合适的片剂或胶囊（含PALA）组合物说明如下：
片剂
配方 每片数量以mg计
A B C
活性成分,
PALA,二钠 100 200 500
用于评价组合疗法的动物模型系统
下列动物模型体系可用于评价各种治疗方式的效果，所述处理方式使用PALA或其类似物并配合任何上述的化合物。
1.用于本雅（Bunya-）和黄热病毒（Flavivirus）的小鼠模型系统庞特托罗病毒
（Punta Toro Virus）：
用3周龄期小鼠C57BL/6（9.6-13.6g）在体内评价化合物抗由于皮下（S.C）接种庞特托罗（Punta Toro）（Adames）病毒（21天）而诱发的肝部感染的效果，其方式如前面对三氮唑核苷（Virazole）（用作正对比物）和核脒（ribamidine）所述的。参见Sidwell等人，（1988）Antimicrob.Agents Chemother.，32：331-336。
流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）：
将体重12-14g的10只C57B1/6小鼠（VAF+，Charles River Lab S）分成一组，用磷酸盐-缓冲盐水（PBS）或药品每日在腹腔内（i.p）处理两次（b.i.d），疗程为5天，在病毒攻击的前一天（1-天）进行第1次用药。每组10只动物中有5只用JE病毒（Beijing菌株）100LD50进行感染（S.C.），其剂量在第一次施用化合物（天0）后的6小时内应足以产生100%的死亡率（稀释剂对比物）。对比物包括未治疗、未感染的小鼠;未治疗的但感染了病毒的小鼠;用稀释剂处理的感染过病毒（和未感染过）的小鼠。用聚（ICLC）（一种三氮唑核苷）（ribarivin）作为正面处理比物。病毒攻击后6天（+6天），采集感染过的鼠脑供病毒滴定。将脑悬浮液（10%W/V）通过在vero细胞培养基中用噬菌斑试验进行滴定。在1-天到+6天记录体重。测量重量变化，将其作为药品毒性的测量值。
2.用于HCMV的兔模型系统：
本次研究总共使用20只染色兔子。用狭缝灯和间接检眼镜评价动物，确定正常的视觉组织和原先不存在病状。
处理兔子的方式如下：
（1）在0天时，所有兔子都通过玻璃体中（mid vitriol）注射接种106PFU HCMV菌株AD169。
（2）使动物保持在各个笼子里并在接种后第2天监测脉络膜视网膜HCMV病发展状况。在接种后第2天时，将接种HCMV的具有同等脉络膜视网膜病态的动物分成4个组，并按下文指不进行静脉注射治疗。
组＃1-五只动物，在注射后第2、3、4、5和6天，分两次给药剂量每日静脉注射药品。药品的浓度在体外测量时为ED90的1/2。
组＃2-五只动物，在注射后第2、3、4、5和6天，分两次给药剂量每日静脉注射药品。药品的浓度在体外测量时为ED90。
组＃3-五只动物，在注射后第2、3、4、5和6天，分两次给药每日静脉注射药品。药品的浓度在体外测量时为ED90的2倍。
组＃4-五只动物，在注射后第2、3、4、5和6天，静脉注射空白对照物。
（3）所有的动物每日都接受检眼镜的间接检查，以评价临床HCMV病的进展。间接检眼镜检查由两个伪装的阅读器独立完成，以便使兔子接受治疗。
（4）将所有的动物在注射后第8天杀死。取出脉络膜视网膜和虹膜组织和玻璃体（在某些情况下还有肺组织）样品并对样品进行处理，通过在Hs68单细胞层上进行细胞声处理检验法而回收HCMV。用组织化学法处理选出的组织样品以评价治疗和非治疗组由HCMV诱导出的眼病状态。
对临床和组织分析结果与所有用药品处理过的、静脉治疗的组的病毒回收结果一起进行评价，并且将它们彼此之间和与接受空白试剂治疗的组联系起来。本次研究结果可以使我们选择用于静脉治疗由CMV诱导的视网膜炎的最佳药品浓度。
3.用于RSV的灵长目动物模型
使用对RSV呈血清反应阴性的23只年幼的非洲绿猴。所有的猴子都被逐个地放在笼子里，置于灵长目动物中心（Primate Center）的一间房子中。保持它们的温度在75°+/-3°F，相对湿度为50-60%。随时供应Purina猴以食品和水且逐日监测动物的临床病征和食物的消耗情况。实验结束时，所有的动物都用Beuthansia D Sqecial（安乐死溶液，Shering公司）在酮胺（Ketamine）麻醉的条件下杀死，再进行尸体剖检。
使用两种RSV菌株;一种是长型菌株（ATCC VR-26）而第二种是从澳大利亚人体RSV分离菌得到的，所述分离菌的提供者为Dr.Gail Wertz（School of Medicine，Vniversity of Alabama at Birmingham）。向非洲绿猴通入两次病毒并制成BSC-40细胞（非洲绿猴肾）的储备库。病毒库具有大约105TCID50/ml的滴定度并保存于-70℃下。
病毒接种物由稀释10-1或10-2倍的储备FSV组成，这是通过气管导管（1.0ml）和鼻内滴注（1.0ml）给药而实现的。逐日获取咽喉拭子并将其放入1.0ml的组织培养基中（具有10%胎牛血清和抗菌素的小型基本培养基）。从拭子中压榨出体液后在1.0ml培养基上进行滴定（表1）。通过制备各样品10倍系列的稀释液并将每份稀释液接种到用BSC-40细胞接种的24孔培养板的复制孔内而完成的。通过用显微镜检查培养基中由病毒诱导的细胞病征而获得滴定度，且将所述的滴定度表达为TCID50/ml。
在尸体剖检时从每只猴子中取下很小一部分肺，称重并在玻璃组织磨中研磨成10%的匀浆（在pH7.2磷酸缓冲盐水中），取其中的0.1ml在血琼脂培养基上培养以便作细菌学评价。将部分匀浆和肺灌洗液稀释10倍以便滴定BSC-40细胞中的病毒。
记录总的变化后，再将气孔灌满10%缓冲福尔马林溶液。收集气管、鼻腔中的组织样品并将整个的肺结构浸于10%的缓冲福尔马林溶液中。固定48小时后，将各肺叶制成切片，处理气管和鼻甲（采用标准石蜡技术），再以4-6μ进行切片并用苏木精-曙红（HE）进行染色;某些切片的染色采用Periodic Acid Shiff（PAS）和免疫过氧化酶（用一种在山羊抗猴中产生的（IgG，IgM，e3）（Nordic Immunologic Laboratories，Capistrano Beach，CA）和Histomark免疫过氧化酶药盒（Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaitherburg，MD）。
对总的和显微镜变化与病毒滴定度一块进行评价。采用过氧化酶工艺来确定用RSV的A-2（Wertz）菌株显著见到的基底膜变化。
参照下列描述本发明的实例对本发明作进一步的限定。对所属技术领域的一般技术人员来说，很显然，有许多改进（包括材料和方法）并不偏离本发明的范围和精神。
实施例
实施例1
1.1材料和方法
得到的PALA呈晶状粉末，以二钠盐的形式。将它放在光化玻璃器皿中，并溶解在消过毒的水或含1%牛血清蛋白的Eagle′s基本培养基中（作为一种10×或100×溶液）。使所有溶液通过微孔过滤器而消毒。使用下列细胞株：Vero或CeM;Hep-2和人包皮细胞。采用3-（4，5-二甲基-噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑鎓溴化物（MTT）、利用Pauwels等人（1988）在J.Virol.Methods中所述的方法20：309-321（该说明书已列入本文参考文献）观察病毒抑制过程。
1.2体外抗病毒和细胞毒性试验
所有试验均在Vero细胞中进行（除HIV-1试验中用CEM细胞以外）。使用下列病毒（病毒菌株）对化合物的抗病毒效果进行评价：a）流行性乙型脑炎病毒，JE，（Nakayama）;b）黄热病毒，YF，（Asibi）;c）白蛉热病毒，SF，（Sicilian）;d）庞特托罗（Punta Toro）病毒，（PT）（Adames）;e）委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（VEE），（Trinidad驴）;f）牛痘病毒（VV），（Lederle疫苗）;g）登革型-4（Caribbean）病毒;h）人免疫缺乏病毒，类型1或2，HIV1或2。病毒（a-f）包括用于对药物进行评价的标准组。该试验化合物的体外抗病毒和细胞毒性作用的测量方法有：a）通过用MTT-试验（JE、YE、SF、PT、VEE、VV和HIV病毒），（Pauwels等人（1988）J.Virol.Methods 20：309-321）来观察对病毒细胞致病作用的抑制情况，或b）通过一种常用的噬菌斑减少试验（所有其它病毒）。
在本发明中所用的基本测量值和定义包括：（a）细胞毒性或浓度50%，TC50，其定义为在MTT试验中与未传染的在二倍试验井中的对照细胞的存活力相比使细胞的数目和它们的代谢活性减少50%的药物浓度（μg/ml）;（b）病毒抑制浓度50%，IC50，其定义为在三倍试验井中所观察到的使病毒细胞致病作用（CPE）减少50%的药物浓度（μg/ml）。治疗（或抗病毒）指数，TI，它是一个与总的体外活性成比例的值。它以TC50/IC50的比率计算。它是在相同试样和相同时间周期中某种化合物的相对抗细胞和抗病毒效果的单一药物浓度的测量值。所有在体外MTT试验中所给出的结果代表2-6个独立试验结果的平均值。
1.3结果
如上所述试验方法可对病毒复制和毒性水平进行测量。活细胞将MTT四唑鎓转化成蓝MTT甲脂（使用线粒体酶）;死细胞没有这种转化能力。另一方面，也用标准细胞致病作用和毒性试验（通过光显微技术）来补充筛选。除了在进行病毒攻击之前将细胞片用PALA预处理16小时之外，如前所述地对PALA的系列浓度进行测试。（参见，例如由Kumarasamy，R.和Blough，H.A.（1984）在Virology 138：156-161中所述的方法）。使用合适的抑制剂和病毒对照组，并评价其毒性。治疗指数如上所述用常规方式进行计算，在表1中给出3对黄热病毒、外衣病毒和本雅病毒（负和正链RNA病毒）的筛选结果;同样对于这些病毒的证实数据在表2中给出。
注：TI是治疗指数，即TC/IC;a）50%抑制时的μg/ml;b）50%抑制时的μg/ml;c）50%抑制;d）95%抑制。
注：TI是治疗指数，即TC/IC;a）50%抑制时的μg/ml;b）50%抑制时的μg/ml;c）50%抑制;d）95%抑制。
仅在体外使用PALA的结果是明确的;PALA在浓度为约10至约25μg/ml时对所有这些RNA病毒（除了VEE）均具有广谱抗病毒活性，并且在所有检测系统中具有最小的毒性，这一点可以通过TC50值大于约320μg/ml而证实;因此，PALA对于大部分所检测的病毒具有约20至30的治疗指数。
当这些研究扩大到DNA病毒和其他RNA病毒（正和负链病毒以及反转录病毒）时证明四个含DNA病毒中有三个对PALA抑制作用是同样敏感的。除了1型和2型疱疹病毒没有观察到抑制活性之外，PALA在约10μg/ml的浓度时对以上所有的病毒均具有活性。如表3中所示，一种RNA正链病毒，柯萨奇病毒B3（Coxsackie B3）对于50%抑制作用需要约33μg/ml;对于大部分这些病毒的治疗指数为约32。
＊人包皮纤维细胞;a）50%抑制
实例2
使用鸭肝模型（DHBV），用各种浓度的PALA（二钠盐）对初始的鸭肝细胞进行处理，并对细胞致病作用进行评价。另一方面，用狭缝点印迹法对病毒DNA的复制进行试验。在浓度为40-50μM的条件下，在菌斑中观察到50%的减少（IC50）;在高浓度下，即，500μM，具有95%的抑制作用，此时只有很少或没有毒性。将这些实验进行三次以验证其结果。
实例3
下面各个部分描述了一些实验，在这些实验中用非洲绿猴进行猴水痘病毒传染，并用PALA，无环鸟苷或它们的结合进行治疗。其结果表明PALA与无环鸟式的结合减少了疹且最小限度地减轻了病毒血症，特别是在传染期结束时。在高浓度条件下可以注意到一些与浓度有关的免疫抑制。此外，PALA表现出与BVaraU（Bristol-Myers Squibb）有极好的协同作用（未示出结果）。
1材料和方法
将15只非洲绿猴称重并抽血以获得临床化学血液学原始数据。这些猴在此之前没有表现出对猴水痘病毒Sf具有抗体。对15只猴中的每一只通过气管内接种3.7×104菌斑形成单位（PFU）的猴水痘病毒来感染猴水痘病毒。将这些猴分成5组，每三只猴为一组，并规定出治疗组如在表4中所示的。该方案导致了下列治疗组。对照猴，作为感染对照组，每日两次静脉注射磷酸盐缓冲盐溶液，施用量为0.1ml/kg（体重）。第二组的三只猴接受PALA，用量为每日50mg/kg，通过静脉团注射进入到隐静脉中。第三组以同样方式以每日20mg/kg的施用量施用较小剂量的PALA。无环鸟苷治疗也通过静脉团注射进入到隐静脉中来施用每日10mg/kg的次有效剂量。第五组的三只猴接受PALA，每日为20mg/kg和无环鸟苷为每日10mg/kg的组合治疗。在每一次治疗中其药物注射到对向静脉里。
药物溶液是在治疗之前每日配制。在病毒接种之后24小时开始治疗。PALA是以溶液来提供的，它置于含有5ml溶液的小玻璃瓶中，其含量为100mg/ml。合并三只小玻璃瓶内的物质，且将7ml合并药物稀释到28ml以得到浓度为25mg/ml。将5ml这种溶液稀释至50ml，从而得到10mg/ml。每日施用两次药物，使每日的总剂量为50或20mg/kg/日。
将从Burroughs Wellcome作为礼物而获得的无环鸟苷称出200mg。将其用5ml PBS稀释，且将pH用1N NaOH调至11.0成为有效溶液。随后将该溶液稀释到40ml，从而得到5mg/ml的溶液，且通过过滤来消毒。再一次，通过每日两次静脉注射，施用1ml/kg体重，其结果为每日10mg/kg的剂量。
在猴水痘感染的临床过程之后在接种之后第2、5、7、9和11天采集肝素中的血2ml。将这2ml样品中的淋巴细胞在ficol-3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸钠（hypaque）梯度上分离，在RPMI-1640介质中洗涤两次，且在10ml这种介质中将其悬浮。将其10ml体积分开在两个25cm2的组织培养烧瓶中，在此之前24小时已用Vero细胞接种该烧瓶。在5-7天培育期之后，将其培养液从该烧瓶中倒出，且用甲醇固定其细胞单层，并用甲烷蓝基品红着色。当干燥时，计算在每个烧瓶中的菌斑的数量，并确定在这两个烧瓶之间的菌斑平均数，将其表示为每ml血液的病毒血症的测量值。
使用一种主观的从±至4+的严重程度的评分标准来对疹作每日评估。一个±评分表示在猴的皮肤上看到小于10个的小泡，而4+则表示很多小泡覆盖了大部分身体表面。白天检查总的临床条件并通过计数每日食品饼干的数量记录厌食情况。将在实验过程中死去的猴子进行尸体剖检，且根据典型的病理学基础将猴水痘确定为死因。基础血液学和临床化学试验在病毒接种之前三天时进行，并在病毒接种之前0天立刻再做一次。随后在3、7、9和11天时获取猴的水痘病毒血液以供血液学和临床化学试验。
在病毒接种之后14和21天时，抽取血液，且为测定抗体而分离血清。使用一种噬菌斑减少试验在血清中和试验中获得抗体的滴定度。所表示的抗体滴定度是菌斑数量比没有加血清的对照培养物中所产生的数量减少80%时的血清稀释量。
2结果
表4表示了有关每日记录的疹的数据。三只对照猴的每一只都出了疹，而其中一个猴在第11天疹子发展到最高程度4±。这只猴在猴水痘靠近到它的肺和肝后的第二天就死了。其余两只对照猴发展的最多出疹程度为2+和3+，并在每只猴身上都持续了两天。用50mg/kg/天PALA处理的三只猴中有两只发展到最高出疹程度4+，第三只猴在第9天仅表现出1+的疹，但是在第10天得了全身性猴水痘而死了。使用低剂量的PALA，结果在一只猴身上有1+的出疹，而在第二只猴身上有2+出疹。第三只猴在第10天表现出3+的出疹，但在同一天的晚些时候就死了。以次有效量（每日10mg/kg）条件使用无环鸟苷的结果是在两只猴身上表现出中等严重程度的3+出疹，而在第三只猴身上表现出轻度的1+出疹。以每天10mg为剂量进行组合处理的结果则可减轻出疹在多数日子里仅看到±出疹，最严重的是有一只猴有1+的记录。
病毒血症在一只对照猴身上较严重的（＞1000PFU/ml血）而在其它两只对照猴身上是中度的（为100～300PFU/ml血）（见表3）。当这些猴以每日50mg/kg的PALA进行治疗时，一只猴得了严重的病毒血症而死了，第二只得了较严重的病毒血症（300-800PFU/ml），而第三只则得了中度病毒血症。用每日20mg/kg PALA的剂量进行治疗的猴身上可见到同样结果。以每日10mg/kg的剂量施用无环鸟苷时发现对中度的病毒血症没有作用。两只猴得了严重的病毒血症，而另一只猴表现出较重度的病毒血症。用PALA和无环鸟苷进行组合治疗可以看到稍微有点收益。一只猴得了较重的病毒血症，一只得了中度病毒血症，而第三只得了最轻的病毒血症。
血液学试验表明没有持续的不规则数值。在用PALA以每日50mg/kg剂量治疗的一只猴（M636）身上和用无环鸟苷治疗的两只猴（M642和M639）身上在第11天观察到了血小极减少症。化学数值确实反映出由于猴水痘病毒而存在的肝炎后果。从按所用剂量施用该药物来治疗的结果来看没有异常现象。
将血清中和抗体的滴定度与对照组中的猴子进行比较，并且与用PALA剂量或用无环鸟苷治疗的猴子进行比较。用PALA和无环鸟苷组合治疗的猴子在与其它猴子的滴定度进行比较时表现出对于猴水痘病毒具有低滴定度抗体。这很可能是由于组合治疗而对病毒复制产生了抑制作用。
表4PALA和无环鸟苷组合治疗对猴水痘病毒的治疗效果：疹
疹子的程度 - 注射后的天数
治疗组 猴子数量
7 8 9 10 11 12 13 14 16
对比 M644 - - 1+ 3+ 4+ 死亡
PBS M634 - ± 2+ 2+ 1+ ± - - -
M547 ± 1+ 2+ 3+ 3+ 1+ ± ± ±
PALA: M646 - ± 1+ 死亡
50mg/kg/d M636 - 1+ 2+ 2+ 2+ 3+ 4+ 4+ 3+
M635 - - 2+ 2+ 2+ 3+ 4+ 4+ 3+
PALA: M633 - 1+ 2+ 3+ 死亡
d
20mg/kg/d M637 - - - - 1+ 2+ 2+ 2+ -
M638 - - ± 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ -
无环鸟苷 M642 - ± ± 1+ 1+ ± ± ± -
10mg/kg/d M639 1+ 1+ 1+ 2+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+
M643 1+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ ±
PALA: M640 - - - ± 1+ ± - - -
20mg/kg/d M645 - - ± ± ± ± ± ± -
+无环鸟苷 M641 - - ± ± ± ± - - -
10mg/kg/d
通过在接种病毒后24小时开始的分开剂量每天两次静脉内注射而治疗
表5PALA和无环鸟苷组合治疗对猴水痘病毒的治疗效果：病毒血症
平均PFU-注射后天数
治疗组 猴子数量
3 5 7 9 11
对比 M644 6 105 >1000 >1000 死亡
PBS M634 16 138 51 0 0
M647 19 181 233 0 0
PALA: M646 1 136 >1000 >1000 死亡
50mg/kg/d M636 7 254 508 89 2
M635 7 248 213 10 0
PALA: M633 13 195 >1000 >100 死亡
20mg/kg/d M637 9 130 173 4 0
M638 5 79 305 7 0
无环鸟苷 M642 9 342 >1000 322 0
10mg/kg/d M639 2 90 >1000 706 0
M643 5 210 504 0 0
PALA: M640 0 8 161 13 0
20mg/kg/d M645 12 113 550 11 0
+无环鸟苷 M641 7 48 30 0 0
10mg/kg/
通过在接种病毒后24小时开始的分开剂量每天两次静脉内注射而治疗
表6PALA和无环鸟苷治疗对猴水痘病毒的血清中和抗体滴定度的影响
Serum Neutral血清中和抗体滴定度Fiter-注射后天数
治疗组 猴子数量
14天 天
对比 M644 死亡 死亡-
M634 1:640 1:1280
M647 1:320 1:1280
PALA: M646 死亡 死亡
50mg/kg/天 M636 1:80 1:1280
M635 1:320 ≥1:1280
PALA: M633 死亡 死亡
20mg/kg/天 M637 1:640 ≥1:1280
M638 1:160 1:320
无环鸟苷 M642 1:640 1:640
10mg/kg/天 M639 1:160 1:1280
M643 1:160 1:160
PALA: M640 1:80 1:640
20mg/kg/天 M645 1:20 1:320
+无环鸟苷 M641 1:80 1:640
10mg/kg/天
以导致病毒菌斑数比对比培养物的数降低80%或更多时的血清稀释值作为滴定度
实例4
在Hs68细胞单层上在AD169传染过程中体外用药的效果。
这些实验是用来证实在HCMV传染过程中10μg/ml浓度的PALA的体外效果。在Hs68细胞学层上的体外感染和效果的评价是对以下HCMV病毒分离物进行的：[1]AD169，一种标准的实验室巨细胞病毒菌株;[2]一种DHPG抗性HCMV分离物（胸苷激酶抗性DHPG;ED50＝＞55μg），和[3]一种最近获得的HCMV临床分离物。这一研究还可以对采用该实验性药物和采用DHPG在活性抑制过程中的HCMV滴定度减少的情况进行评价。
这些小部分证明所有三个菌株：CMV实验室菌株、人体HCMV分离物和DHPG抗性菌株对PALA是敏感的，病毒量减少了2～3log10。
1方法
将特征如上所述的[1]菌株AD169;[2]DHPG抗性HCMV;或[3]最近分离的临床HCMV菌株的104PFU/mlHCMV接种到会合的Hs68细胞单层（35mm培养盘）上并在37℃下将其吸附于该单层上达1小时。将接种物吸出，且将含有实验药物或DHPG的培养基，或不含药物的培养基加入到接种了HCMV的单层中。将含有适当的药物添加到的培养每日变化。以24小时为间隔，从接种后第1天到第7天，将该接种HCMV且经药物处理的单层按下列方式处理：将含有无细胞病毒的上清液从该细胞中去除，而在该上清液中HCMV无细胞病毒的滴定度通过标准噬菌斑试验来确定。将该单细胞层用HBSS洗涤，以去除剩余的药物，并通过刮削来收集细胞。将该细胞用声波和离心作用来处理使其成为丸状细胞碎片。测定从感染的单细胞层中释放出的无细胞HCMV的滴定度。该药物的效果用与无药物处理的HCMV PFU/ml和DHPGHCMV抑制相比HCMV PFU/ml的减少量来表示。
2结果
2.1用AD169感染的Hs68单细胞层
在3μg/ml的浓度下使用PALA当与用空白对照物处理的对照组相比较时在减少HCNV滴定度方面它是有效的。当PALA与体外治疗中的DHPG（19μg/ml;ED50对于AD169）相比较时，其HCMV滴度的降低与用DHPG处理的单层相类似，但其滴度却比DHPG的滴度稍微高一些。用PALA治疗之后的HCMV滴度的降低与该上清液（无细胞HCMC）和与其细胞丸（与细胞有关的HCMV滴度）是相类似的。HCMV滴度从细胞上清液和从细胞丸试验中的回跳（目前未有解释）在接种后第3天出现。该滴度与接种后第4和第5天的DHPG相比仍保持较高水平。在第5天之后由于单层中细胞的损失，没有样品被处理。到接种后第5天，在用药物处理过的样品中该单细胞层约有50%已经损失。HCMV滴度在表7a和图1以及2中列出。
2.2临床HCMV分离物
从一个已证实的HCMV新生儿感染病例中获得一种临床分离物。该病毒通过中和作用证实为HCMV。PALA和DHPG可以有效地降低该HCMV临床分离物的滴度。在这两种治疗之间和在它们降低HCMV滴度的作用上没有不同。HCMV滴度在表7b和在图3以及4中列出。
2.3DHPG抗性HCMV
将一种DHPG抗性HCMV分离物（以前认为其特征根据DHPG敏感性体外减少情况认为是一种DHPG抗性分离物;该病毒具有不同的胸苷激酶活性）用于这些体外试验中。DHPG在与细胞有关的或无细胞试验中对降低HCMV的滴度是没有效的。在该用DHPG处理的组中DHPG抗性HCMV的滴度与用空白对照物处理的单细胞层相同或高一些（没有统计意义）。PALA在降低DHPG抗性HCMV的滴度方面是有效的。到接种后第4-5天，用PALA处理的单细胞层比用DHPG处理的或用空白对照物处理的单细胞层明显地降低了HCMV的滴度。HCMV滴度在表8和图5以及6中列出。
表7a
用DHPG、PALA和空白液接种后的无细胞（上清液）的HCMV滴定度
DHPG PALA
接种后的
天数 对比 AD 169 DHPGR临床分离物 AD169 DHPGR临床分离物
0 105105105105105105105
1 102101103101101101102
2 102101104101101101101
3 103101105101103102102
4 1040 105101102102101
5 1050 1040 101101101
表7b用DHPG、PALA和空白液接种后的与细胞有关（细胞丸处理）的HCMV滴定度
DHPG PALA
接种后的天数 对比 AD 169 DHPGR临床分离物 AD169 DHPGR
0 102102102102102102102
1 104102103103103103103
2 104101103102101101102
3 103101105101101101101
4 103101105101101101101
5 1040 1040 1010 0
6 103101104101101101101
7 1010 1021010 101101
实例5
在HCMV脉络膜视网膜的兔模型中对单一的和组合试剂PALA和DHPG的增加剂量以及频率效果进行评价。
这些研究通过比较临床的、病毒恢复和组织病理学上由HCMV诱导的疾病程度对在增加剂量浓度和频率的研究中静脉治疗过程中的单一的和组合试剂PALA和DHPG的效果进行评价。对两种实验药物浓度，20和50mg/kg，在2种不同施用频率条件下的情况进行评价，每天以及从接种后第一天至第10天每隔一天进行评价。将该实验药物的体内效果与静脉DHPG治疗作比较。其结果表明用组合试剂剂量PALA加低剂量DHPG（组＃7）＞＞对照组（组＃8）＝单一试剂DHPG（组＃1和＃2）和低剂量（组＃3）PALA＞＞组合试剂高剂量PALA加低剂量DHPG（组＃5）＞＞组合试剂高剂量PALA加低剂量DHPG（组＃4）。
1方法
在该研究中总共使用32只有色兔。将这些动物通过狭缝灯和间接检眼镜确定正常的眼的形态以及原始病理缺陷，以对其进行评价。将这些动物按下述方式进行处理：
[1]在第0天，所有兔通过玻璃体中（mid-vitreal）注射105PFU HCMV菌株AD169（100μl）来接种。
[2]将动物们关在各自的笼子中，每日监测脉络膜视网膜HCMV疾病的发展。在接种后第2天，将接种HCMV的动物分成8个组，每4只为一组，每一只具有类似的脉络膜视网膜疾病记录。将感染HCMV的兔子接受静脉治疗，方式如下：
组＃1;4只动物，从接种后第2天至10天每日静脉注射高剂量实验药物（50mg/kg）。共静脉注射9次。
组＃3：4只动物，从接种后第2天至10天每日静脉注射低剂量实验药物（20mg/kg）。共静脉注射9次。
组＃4：4只动物，从接种后第2天至10天每日静脉注射高剂量实验药物（50mg/kg）（共9次静脉注射），且从接种后第2天至10天每日2次注射高剂量DHPG10mg/kg/天（总共18次静脉注射）。
组＃5：4只动物，从接种后第2天至第10天每日静脉注射高剂量实验药物（50mg/kg）（共9次静脉注射），且从接种后第2天至第10天每日两次注射低剂量DHPG5mg/kg/天（共18次静脉注射）。
组＃6：4只动物，从接种后第2天至第10天每日静脉注射低剂量实验药物（20mg/kg）（共9次静脉注射），且从接种后第2天至第10天将低剂量DHPG5mg/kg/天分两次施用（共18次静脉注射）。
组＃7：4只动物，从接种后第2天至第10天每天分两次静脉注射的DHPG10mg/kg/天。共18次注射。
组＃8：4只动物，从接种后第2天至第10天静脉注射消毒盐水。
[3]所有动物每日接受间接检眼镜的检查，以评价临床HCMV疾病的进展（从接种后第2天至第10天）。该间接检眼镜的检查是通过两台读出器独立地进行的，该读出器被伪装进来，以方便正在接受治疗的兔子。
[4]将所有动物在接种后第12天杀死，将脉络膜视网膜和虹膜组织和玻璃体样品取下来并作处理从而通过在Hs68单细胞层上进行细胞声波试验而收集HCMV。对所选择的眼睛的和肺的组织样品进行组织化学处理，以评价在治疗组和未治疗组中由HCMV诱发的眼睛的病状。
将由所有经过药物治疗的静脉治疗组得到的有关临床的、病毒收集以及组织病理效果的结果互相联系起来，且与空白对照治疗组联系起来。
2结果
单一试剂静脉内治疗组
将在兔子身上由HCMV诱发的脉络膜视网膜疾病过程中由单一试剂和组合试剂进行静脉治疗的效果的数据总结于图5。以下是各个治疗的概述。
组＃1：从接种后第2天至第10天每日静脉注射高剂量PALA（50mg/kg）进行单一试剂的治疗。
每日用单一剂量静脉施用浓度为50mg/kg的PALA。在接种HCMV的动物中对于降低疾病的发展仅勉强有效。在接种后3-4天内玻璃体炎发展到中等程度。玻璃体炎的进一步发展会妨碍在这些动物中对脉络膜视网膜炎的全面评价，其结果，组织学的评价在确定脉络膜视网膜疾病的范围和单一PALA制剂的效果方面将变得更为重要。视神经乳头水肿和发红（在这种兔模型中HCMV感染的临床症状）在接种后第3至7天表现出来。该研究的结论为，在眼底部可见的动物中视神经乳头的红肿和发红正在减轻。虽然眼底视觉和正在发展的HCMV脉络膜视网膜疾病由于玻璃体炎而被遮蔽，但是在用高剂量PALA治疗的那些动物中其临床的感觉是该治疗仅有极小的效果而且通过这种高剂量单一试剂的治疗，由HCMV诱发的脉络膜视网膜炎疾病的发展和进展没有停止。
组织学初步评价表明中等面积的脉络膜视网膜HCMV疾病限制在内视网膜上。偶然地，HCMV感染会深及传播疾病中的脉络膜视网膜的较大面积。脉络膜的水肿和血管充血在中等水平条件下是突出的。在这些用PALA治疗的眼睛中由HCMV产生的疾病的面积会集中在某一地区，这表明发生了中等脉络膜视网膜感染。涉及免疫细胞的范围由单细胞的和多形核细胞浸润物组成。这些初步的组织学评价证实了该临床疾病印象。宰杀时，其肺清晰且无充血。对样品作常规的组织学处理，其结果有待给出。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。没有回收到HCMV可能（且也许）直接与选定回收HCMV的时间有关，即与接种后第12天有关。为了对这些单一试剂治疗的效果作更全面的评价，在整个治疗过程有一段动物宰杀时间将是必须的。（在没有治疗的眼睛中，HCMV通常出现在接种后第8或9天。在接种后第9或10天之后的回收是不确定的）。
组＃2：从接种第2天到第10天中用高剂量PALA（50mg/kg）每隔一天静脉注射单一试剂进行治疗
以50mg/kg浓度每隔一天用单一剂量静脉施用PALA对于在接种HCMV的动物中减轻疾病的发展是勉强有效的。用这种PALA浓度治疗的动物中的疾病的发展与每日用50mg/kg静脉治疗组中HCMV疾病的进展情况相类似。玻璃体炎在接种后3-4天内发展到中等至严重水平。玻璃体炎的发展妨碍了对这些动物的脉络膜视网膜疾病的全面评价，其结果，该组织学评价在确定脉络膜视网膜疾病的范围和该PALA制剂的单一试剂效果方面将变得更为重要。在接种后3-4天视神经乳头水肿和发红（在这一兔模型中HCMV感染的临床特征）较严重，且在第5至7天不能进行评价，这表明尽管进行了治疗，但眼睛中的HCMV疾病仍在发展。虽然眼底视觉和发展的HCMV脉络膜视网膜疾病由于在这些动物中玻璃体炎而被遮蔽，但是在这些用高剂量PALA每隔一天治疗的动物中由HCMV诱发的疾病的临床感觉是这种治疗办法对于减轻HCMV疾病的发展是没有效力的。在这两个高剂量PALA治疗组中由HCMV诱发的疾病的发展相互之间没有不同（图7）。宰杀时其肺清晰且无充血。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能（且也许）直接与所选择的HCMV回收时间有关。
组＃3：从接种后第2天到第10天用低剂量PALA（20mg/kg）每日静脉注射单一试剂进行治疗
以20mg/kg的浓度每隔一天用单一试剂静脉注射施用PALA在已接种HCMV的动物中对于减轻疾病的发展来说与其它治疗组和空白对照剂治疗组相比是没有效果的。该疾病的进展与组＃2的报告相类似。
初步的组织学结果表明发生了扩散性疾病并伴有中度到严重的脉络膜视网膜疾病。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能是直接与所选择的回收HCMV的时间有关。
组＃7：从接种后第2天至第10天对已接种HCMV的动物静脉注射DHPG（每日10mg/kg分两次注射）
在这一实验中用DHPG作为对照治疗。动物从接种后第2天开始接受DHPG治疗，并持续到接种后第10天。每日10mg/kg分两次施用DHPG进行治疗确实可以减轻HCMV脉络膜视网膜感染和疾病的发展。到接种后第6-7天在70%用DHPG治疗的眼睛中，其平均HCMV脉络膜视网膜疾病程度已稳定且该疾病在第8天已开始缓解。虽然眼底视力由于玻璃体炎的发展而部分被遮蔽，但是脉络膜视网膜疾病仍保持明显的病灶，同时其视神经乳头仍存在中度炎症。该脉络膜直到接种后第10天仍存在着充血。从接种后第4天至第10天这些动物的玻璃体炎仍处于中度水平。在这些被治疗的眼睛中该疾病的临床感觉是该DHPG单一试剂治疗组是所有治疗组中改进最大的组。在整个研究过程中，DHPG治疗组与三个PALA单一试剂治疗组相比，一直具有较轻的玻璃体炎（间接的脉络膜视网膜疾病程度）。由于该治疗组的中度病症发展成为严重的玻璃体炎，所以它与空白对照物治疗组的统计学比较是不可能的（对照组和DHPG治疗组具有类似程度的玻璃体炎）。宰杀时，其肺正常。对样品作常规的组织学处理，结果待定。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能（且也许）直接与所选择的回收HCMV的时间有关。
组＃8：已接种HCMV的用空白对照物治疗（空白对照物+EDTA）的动物
对用空白对照物治疗的动物从接种后第2天开始接收每日一次消毒盐水+EDTA的注射，且持续到接种后第10天。用空白对照物治疗的眼睛在接种后第2天形成了轻度脉络膜视网膜和玻璃体疾病。该疾病包括视网膜浸润的病灶区、视神经炎症和红肿以及轻度的玻璃体炎。该玻璃体炎包括玻璃体带和周边细胞浸润物以及浑浊。空白对照物治疗没有终止这些动物身上的脉络膜视网膜疾病和玻璃体炎的发展。到接种后第4-5天，脉络膜视网膜疾病加重且这些已感染HCMV的眼睛中正发展的玻璃体炎发展到严重水平，干扰了对脉络膜视网膜疾病的全面评价，在接种后第5天，其玻璃体炎遮蔽了对视网膜和脉络膜疾病的全面评价。
对用空白对照物治疗的眼睛的初步组织学评价表明HCMV感染已从内视网膜面发展到受光层。组织学结果证明了视网膜水肿面、混合细胞浸润物和偶然的视网膜分离。视网膜HCMV疾病严重区域处于正常视网膜区的旁边。组织学结果证实了脉络膜和视网膜的中度和严重病状。宰杀时，对肺的观察表明在2只兔中有轻度到中度的乳浊和出血。还存在轻度至中度的水肿（充血）。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能（且也许）直接与所选择的回收HCMV的时间有关。
组合试剂PALA和DHPG静脉注射治疗：
组＃4：从接种后第2天到第10天用高剂量PALA（50mg/kg）每日静脉注射治疗，同时静脉注射高剂量DHPG（从接种后第2天到第10天每日10mg/kg分两次施用）。
和
组＃5：从第2天到第10天用高剂量PALA（50mg/kg）每日静脉注射治疗，同时静脉注射低剂量DHPG（从接种后第2天至第10天每日5mg/kg分两次施用）。
用高剂量PALA（50mg/kg）和DHPG（10mg/kg）相结合每日静脉注射治疗[组＃4]或用高剂量PALA（50mg/kg）加上DHPG（5mg/kg，分两次施用）每日静脉注射治疗（均从接种后第2天至第10天）对于减轻由HCMV诱发的脉络膜视网膜疾病的发展是没有效的。事实上，玻璃体炎（HCMV病的间接测量手段）在这些结合治疗组中比在单一试剂治疗组、组合试剂治疗组或空白对照物治疗组中的疾病更严重。由HCMV诱发的疾病程度的加重可能是由这两种化合物的对抗作用而引起的，具体地说50mg/kgPALA和10或5mg/kg的DHPG的对抗作用。在玻璃体炎发展成能遮蔽眼底视觉之前，该视神经乳头呈现出发红且发炎变化特征（由HCMV诱发的疾病）。在接种后第10天，该视神经乳头的变化在那些其神经乳头可见的动物身上已不再减少。根据在这些用高剂量PALA组合治疗的眼睛中的由HCMV诱发的疾病的临床感觉，组合治疗的结果是其疾病比空白对照或在单一试剂治疗组中的疾病更严重。虽然仅评价了8只眼睛（高剂量PALA组合治疗组），但该结合组呈现出是对抗性的（即，在组合组中的疾病比用50mg/kgUSNUS08或10mg/kgDHPG单一试剂的治疗组更严重）。宰杀时肺病症不明显。对所选择的样品进行组织学处理。
在接种后第12天没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能（且也许）直接与所选择的回收HCMV的时间有关。
组＃6：从第2天至第10天每日用低剂量PALA（20mg/kg）进行静脉注射治疗，加上在接种后第2天至第10天以每日5mg/kg分两次低剂量静脉注射DHPG。
用每日低剂量PALA（20mg/kg）和每日低剂量DHPG（5mg/kg）的组合静脉治疗（组＃6）是最有效的组合试剂治疗。这种组合在减轻玻璃体炎和视神经乳头变化方面比任何其它所评价的单一试剂或组合试剂的治疗方式更为有效。这种组合试剂治疗在整个治疗过程中（接种后第2天至第10天）均超过所有其它的治疗。事实上，在这种组合治疗组中的玻璃体炎（间接的HCMV疾病的测试手段）并不比任何其它单一试剂治疗组、组合试剂治疗组或空白对照物治疗组轻多少。在由HCMV诱发的疾病程度上的减轻可以解释为两种化合物的加和性（在这一结论能由统计学分析结果支持之前需要对其它的样品进行评价）。在玻璃体炎发展到遮蔽眼底视觉之前，其视神经乳头呈现出中度红肿和炎症变化特征（由HCMV诱发的疾病）。在接种后第10天，视神经乳头的变化在那些神经头可看见的动物中已减轻。根据在这些低剂量PALA组合治疗的眼睛中中的对由HCMV诱发的疾病的临床感觉，这种组合治疗导致的疾病比在空白对照物治疗组中的病症或在单一试剂治疗组中的病症的严重程度低不了多少。宰杀时，肺部没有明显症状。对所选择的样品进行组织学处理。
在接种后第12天，没有从任何脉络膜视网膜细胞声波共同培养物中回收到HCMV。回收不到HCMV可能（且也许）直接与所选择的回收HCMV的时间有关。
3结论
[1]在兔身上由HCMV诱发感染的过程中，当PALA作为单一试剂时，其高剂量或低剂量的治疗在减轻眼疾病的发展和进程中是没有效的（根据玻璃体炎和视神经乳头由HCMV诱发的变化）。
[2]用DHPG作单一试剂治疗时，对于在兔身上减轻由HCMV诱发的脉络膜视网膜疾病的严重程度是有效的。
[3]高剂量PALA组合试剂的治疗对于减缓眼睛由HCMV诱发的疾病的进程是没有效的。事实上，这些高剂量组合治疗证明了一种对抗性抗病毒作用，它所造成的由HCMV诱发的眼疾病的严重程度比在其它单一的和组合试剂治疗组中所观察到的疾病更严重。
[4]用静脉低剂量PALA和低剂量DHPG进行组合试剂治疗对于在这一模式中减轻由HCMV诱发的疾病的发展和严重程度是有效的。这种组合试剂的治疗方式证明了一种附加的或协同的抗HCMV效果。
实例6
在兔身上进行PALA效果评价：
在治疗后第3、4、5、和6天对其脉络膜视网膜中HCMV滴度的降低情况作精确分析来验证临床单一和组合试剂的效果。
进行这些实验是在兔模型中在感染HCMV之后通过比较临床的、和组织病理学的由HCMV诱发的疾病的严重程度来证实PALA静脉治疗的效果。PALA静脉治疗结果通过治疗过程中HCMV的回收情况评价。将从脉络膜视网膜声波共同培养物中获得的HCMV的滴度与DHPG和定向对照物回收滴度相比较。对高剂量PALA治疗的单一试剂治疗和与DHPG结合中的组合试剂治疗结果进行评价的。
1方法
总共有41只着色的兔子用于这一研究。通过狭缝灯和间接检眼镜来评价这些动物，以测定正常眼睛的形态和没有原始病状。对动物进行如下处理：
[1]在第0天，所有动物通过检眼镜进行评价，以确保所有的后段（posterior segment）是正常的。在眼底检查之后，动物接受局部滴眼药以扩张瞳孔。局部滴眼药治疗每天都进行，一直贯穿整个研究过程。
[2]在第0天，所有兔通过玻璃体内（mid-vitreal）注射105PFU HCMV菌株AD169（100μl）来进行接种。其它兔用非感染的Hs68单细胞层上清液进行假接种。这些假接种的动物用作静脉治疗组的对照物。
[3]这些动物养在各自的笼子中，且对脉络膜视网膜HCMV疾病的发展进行每日监测。在接种后第2天，将接种HCMV的动物分成组，每组有4-6只接种HCMV的兔子和一只假接种的兔子。已感染HCMV和假接种的兔如下所示接受静脉治疗：
每日单一试剂PALA静脉治疗：
组＃1：4只接种HCMV的动物和1只假接种的动物，在接种后2至10天静脉注射高剂量PALA（50mg/kg）。共9次静脉注射。
将这组动物在进行研究的这段时间中在接种后第3、4、5和6天宰杀，以评价HCMV回收量和滴度的降低情况。将眼睛摘除，并作处理以对细胞声波物进行HCMV回收。将假接种的动物在接种后第12天宰杀，并用于对在静脉治疗之后PALA对视网膜和脉络膜的毒性作用进行评价。
组合试剂PALA和DHPG的静脉治疗：
滴度测定和临床效果的证实。
组＃2：7只接种HCMV的动物和1只假接种的动物，在接种后第2天至10天静脉注射高剂量PALA（50mg/kg）（共9次静脉注射）加上从接种后第2至10天每天注射高剂量DHPG10mg/kg，分两次用药（总共18次静脉注射）。
在这一治疗组中，在接种后第3、4、5、和6天每天各宰杀一只动物。摘出眼睛，并作处理从而通过细胞声波处理物回收进行HCMV回收，以测定HCMV的存在量和在脉络膜视网膜中的病毒的滴度。其余2只已感染HCMV的兔子和1只假接种的兔子到接种后第12天一直进行评价。这些剩余的动物用于证实PALA组合效果的临床感觉，其证实方式如前面实例5中所述的那样。
组＃3：6只接种HCMV的动物和1只假接种的动物，在接种后第2天至10天静脉注射中等剂量PALA（25mg/kg）（共9次静脉注射）加上从接种后第2至10天每日注射中等剂量的DHPG7.5mg/kg，分两次用药（共18次静脉注射）。
在这一治疗组中，在接种后第3、4、5和6天每天宰杀一只动物。摘出眼睛，并作处理以通过细胞声波处理回收HCMV，以测定HCMV的存在量和在脉络膜视网膜中的病毒的滴度。其余2只接种HCMV和1只假接种的兔子到接种后第12天一直用来进行评价。这些剩余的动物用于证实PALA组合效果的临床感觉，其证实方式如前面实例5中所述的那样，这些剩余的兔子还用于对最终状态的效果进行评价。
组＃4：6只接种HCMV的动物和1只假接种的动物，在接种后第2至10天静脉注射低剂量PALA（10mg/kg）（共9次静脉注射）加上从接种后第2至10天每日注射低剂量DHPG5mg/kg，分两次用药（共18次静脉注射）。
在这一治疗组中，从接种后第3、4、5、和6天每天宰杀一只动物。摘出眼睛，并作处理以通过细胞声波处理物回收HCMV，以测定HCMV的存在量和在脉络膜视网膜中的病毒的滴度。其余2只接种HCMV和1只假接种的兔子到接种后第12天一直用于进行评价。这些剩余的动物用于证实PALA组合效果的临床感觉，其证实方式如前面实例5中所述的那样。
单一试剂正负对照：
组＃5：6只接种HCMV的动物，从接种后第2至10天每天静脉注射DHPG10mg/kg，分两次施药。共18次静脉注射。
在一段时间的研究过程中将这组动物在接种后第3、4、5、和6天宰杀，以评价HCMV回收量和滴度的降低情况。将其摘除眼睛，并作处理以从视网膜的细胞声波处理物中回收HCMV。将其余2只动物在接种后第12天宰杀，以用于在静脉治疗后对PALA对视网膜和脉络膜的临床作用过程进行评价。
组＃6：6只接种HCMV的动物，从接种后第2至10天静脉注射消毒盐水。
在一段时间的研究中将这组动物在接种后第3、4、5、和6天宰杀，以评价HCMV的回收量和在视网膜的滴度的降低情况。摘除眼睛，并作处理以从细胞声波处理物中回收HCMV。将其余2只动物在接种后第12天宰杀，并用于在静脉施药后对PALA对视网膜和脉络膜的临床作用过程进行评价。
[4]所有动物每日接受间接检眼镜检查或用一个手持90屈光度透镜进行狭缝检查，以评价临床HCMV疾病的进展（从接种后第2至10天）。通过两个遮蔽（以便兔子接受治疗）的读出器进行独立的眼底检查。
[5]将所有动物在这段时间研究过程中宰杀以评价PALA单一的和组合试剂对HCMV滴度的降低作用，或在接种后第12天将其宰杀，以证实临床过程PALA的治疗效果。
对于所有经过药物处理的静脉治疗组，将其临床的、病毒回收和组织效果结果在各组之间以及与空白对照物治疗组之间相联系起来。在整个效果评价过程中各个动物的总结。
第1天所有动物通过狭缝灯生物显微镜进行初始评价以及眼底检查。动物编号从1到36;和S1-S5。将兔子立刻随机地编进各动物组，以接受如下所述的静脉治疗：
组＃1：兔＃1、2、3、4和假接种的兔S1-50mg/kgPALA。
组＃2：兔＃5、6、7、8、9、10、11和1只假接种动物＃S2-每日静脉注射高剂量PALA（50mg/kg）和高剂量DHPG（10mg/kg/天）。
组＃3：兔＃12、13、14、15、16、17和1只假接种动物＃S3-每日静脉注射中剂量PALA（25mg/kg）加上中剂量DHPG（7.5mg/kg/天）。
组＃4：兔＃18、19、20、21、22、23和1只假接种动物＃S4-每日静脉注射低剂量PALA（10mg/kg）加上低剂量DHPG（5mg/kg/天）。
组＃5：兔＃24、25、26、27、28、29和1只假接种动物＃S5-每日静脉注射高剂量DHPG（10mg/kg/天）。
组＃6：兔＃30、31、32、33、34、35、和36-每日接受空白对照物静脉治疗（注射消毒盐水）。
接种HCMV的并用单一和组合试剂治疗的动物的宰杀：
接种后第3天：宰杀，并将得到的脉络膜视网膜的细胞声波处理物培养物进行HCMV回收-
组＃1：兔＃1
组＃2：兔＃11
组＃3：兔＃16
组＃4：兔＃23
组＃5：兔＃28
组＃6：兔＃34
接种后第4天：宰杀，并将得到的脉络膜视网膜的细胞声波处理物培养物进行HCMV回收-
组＃1：兔＃2
组＃2：兔＃7
组＃3：兔＃12
组＃4：兔＃18
组＃5：兔＃24
组＃6：兔＃30
接种后第5天：宰杀，并将得到的脉络膜视网膜的细胞声波处理物培养物进行HCMV回收-
组＃1：兔＃3
组＃2：兔＃8
组＃3：兔＃13
组＃4：兔＃19
组＃5：兔＃26
组＃6：兔＃31
接种后第6天：宰杀，并将得到的脉络膜视网膜的细胞声波处理物培养物进行HCMV回收-
组＃1：兔＃4
组＃2：兔＃6
组＃3：兔＃14
组＃4：兔＃21
组＃5：兔＃27
组＃6：兔＃33
接种后第12天：宰杀，并进行组织处理以便进行组织学评价或从脉络膜视网膜声波处理物培养物中进行培养物HCMV回收。通过间接检眼镜对在效果评价结束时宰杀的动物每日进行观察。将这些动物中的HCMV疾病的临床感觉用于构建在本申请中图示所表明的玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病的曲线图。在评价结束时所宰杀的动物包括：
组＃1：没有感染HCMV的兔子，S1
组＃2：兔＃9、10、S2
组＃3：兔＃15、17、S3
组＃4：兔＃20、22、S4
组＃5：兔＃25、29、S5
组＃6：兔＃32、35、36
临床疾病感觉：玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病的发展
图6和图7对在静脉组合试剂和单一试剂治疗组中的脉络膜视网膜炎的发展和玻璃体炎的发展的数据进行了总结。脉络膜视网膜疾病的发展由于玻璃体炎的发展在接种后第5-8天被部分地遮蔽了，这在前面效果评价中已证明了。对于接种后这些天的平均记录是以临床感觉和前几天眼底检查的评价结果为根据的。
表8、9、10、和11总结了临床玻璃体炎、脉络膜视网膜炎和视神经乳头评分以及从治疗组在接种后第3、4、5和6天所得到的2只眼睛中的HCMV的回收量。
2结果
单一试剂PALA静脉治疗
组＃1：PALA单一试剂治疗50mg/kg/天
在这一治疗组中所有兔子在研究HCMV回收的时间过程中被宰杀。在这一单一试剂治疗组中没有动物连续地经过整个静脉治疗过程而被评价。经过假接种PALA50mg/kg/天治疗的动物，＃S1，在研究的过程中没有得任何玻璃体炎也没有脉络膜视网膜疾病。
在这一单一试剂治疗组中通过细胞声波处理试验的HCMV回收结果证明在接种后第3、4、5和6天在脉络膜视网膜中存在病毒，HCMV在培养物样品中的滴度在接种后第3天达到最高，从其样品中平均回收到104pfu HCMV。HCMV是从在该时间段的评价中所宰杀的动物的两眼中回收的。HCMV滴度在整个恢复过程中是降低的，因此在接种后第6天在培养物中仅检测到平均101pfo HCMV。HCMV在这一单一试剂治疗组中的回收情况比在空白对照物处理组中的要好，但是在这个组中HCMV的滴度比其它组合试剂或单一试剂DHPG治疗组更高。
组＃2：组合试剂PALA（50mg/kg/天）加上DHPG（10mg/kg/天）
临床疾病（玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病）在这一高剂量PALA加上高剂量DHPG治疗组中最轻。玻璃体炎（对脉络膜视网膜HCMV病状的间接测量手段）在除了接种后第5天外的所有天中都与单一试剂DHPG的治疗相当。在这一高剂量治疗组合组中的脉络膜视网膜疾病当与单一试剂DHPG治疗组相比较时可能具有一种附加的作用效果。这一高剂量组合组比其它PALA加DHPG治疗组显著地更好，且比空白对照物治疗明显地更好。在这个组中视神经炎在接种后的所有天中都是轻的。在这一组中的平均神经炎评分比所有其他组合试剂和单一试剂治疗组更好。这个观察结果是重要的且证明这一治疗方式与其它结合和单一试剂的治疗相比具有优选。在这一HCMV感染模型中的视神经乳头变化是对脉络膜视网膜疾病的发展和由HCMV诱发的病下的一种可靠的测定和评价手段。
在这一高剂量组合试剂治疗组中通过细胞声波处理试验的HCMV回收结果表明仅在接种后第3和4天在脉络膜视网膜中存在病毒。虽然在每个时间点上在每个组中仅处理2个样品，但在第5和6天没有病毒被回收到的事实是有意义的。在培养物样品中HCMV滴度在接种后第3天达到最高，此时从样品中平均回收到103.5pfu HCMV。从在该段评价时间中在接种后第3天杀的动物（接种并经药物治疗的动物）的双眼中回收HCMV。在接种后第4天，2只眼睛中仅有一只通过培养物表明其中存在HCMV。在这个脉络膜视网膜的样品中的HCMV滴度是101pfu HCMV。这种从接种后第3至4天HCMV滴度的戏剧性降低表明这种组合试剂治疗方式可能存在附加的反应。在接种后第4天之后在这一组合试剂治疗组中从脉络膜视网膜样品里没有回收到HCMV。在这一高剂量组合试剂治疗组中HCMV回收比在用空白对照物治疗的眼睛中的回收更好，且比在早期用PALA加DHPG组合治疗组中的HCMV的回收要好（频率和HCMV滴度）。在这一组中HCMV滴度的降低比其它组合试剂治疗组更好，且显示出与在单一试剂DHPG治疗组中所观察的HCMV滴度的降低一样好。
组＃3：组合试剂PALA（25mg/kg/天）加上DHPG（7.5mg/kg/天）[中等剂量组合治疗]和
组＃4：组合试剂PALA（25mg/kg/天）加上DHPG（5mg/kg/天）[低剂量组合治疗]。
临床疾病（玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病）在中等剂量和低剂量PALA加中剂量DHPG治疗组中是中度的。在这些组合试剂治疗组中的玻璃体炎的评分与高剂量组合或单一试剂DHPG治疗组相比没有改进。玻璃体炎在中等剂量组合治疗组中在第10天还较严重。脉络膜视网膜疾病的分析结果表明在接种后第10天在这两个组合治疗组中该疾病处于中度水平，而且视网膜病状清晰可见。在这些组合治疗组中平均脉络膜视网膜和玻璃体疾病比在高剂量组合剂治疗组中更严重。在中等剂量治疗组中疾病的进展与在低剂量组合治疗组中的疾病状态没有不同。玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病在这两个组合组中呈现出中度水平。在中等剂量和低剂量组合治疗组中，玻璃体炎和脉络膜视网膜疾病比在高剂量组合和DHPG单一试剂治疗组中更严重。视神经炎和视神经乳头变化在这两个中等剂量和低剂量治疗组中存在于整个研究过程中。两个组合治疗组均表明中度的视神经乳头神经炎和病症。在这些组中视神经乳头变化与单一试剂DHPG治疗组或空白对照物治疗组没有不同。在这些组中视神经乳头变化与高剂量组合试剂治疗组相比更差。
在这些组合治疗组中从脉络膜视网膜细胞声波处理培养物中的HCMV回收介于空白对照物HCMV回收和单一试剂DHPG HCMV回收之间。在中等剂量回收组中，在接种后第3、4、和6天从声波处理培养物中回收HCMV。滴度从接种后第3天的平均104降低到第6天的平均101。HCMV的回收量比在空白对照物治疗组中的回收量更少。HCMV回收在中等剂量组中没有象在高剂量组合治疗组或单一剂DHPG治疗组中降低得那样快。
在低剂量组合试剂组中从脉络膜视网膜细胞声波处理培养物中的HCMV的回收量与中等剂量治疗组相当。与在空白对照物组中或单一试剂PALA治疗组中相比，在这一低剂量结合治疗组中在第4、5、6天只有几个脉络膜视网膜样品是阳性的。在这一低剂量治疗组中HCMV的滴度和回收频率与中等剂量组合HCMV治疗组的回收频率和HCMV滴度相类似。
在中剂量和低剂量结合治疗组上进行组织解剖。该组织解剖总结如下。
中等剂量PALA加DHPG治疗。在这一中等剂量组合治疗组中该组织学结果表明在视网膜和靠近该视网膜的玻璃体中混合的细胞浸润物发生轻度到中度的聚积。视网膜的破坏呈局部病灶具有水肿、坏死以及整个视网膜厚度消失明。脉络膜视网膜中度充血和水肿，视神经乳头变化包括该神经发生病灶浸润和在玻璃体内界面处聚积混合细胞浸润物。该病症在这一样品中是值得注意的。若与实例5中所表明的病症相比较，该病症比在高剂量PALA加DHPG治疗组和在单一剂治疗组中所看见的病症更为严重。在这一中等剂量组合治疗组中的病症与在经过空白对照物治疗的脉络膜视网膜样品（实例5）中所看到的严重程度是不一样的。
低剂量PALA加DHPG治疗。玻璃体炎在这一样品中为中度严重。脉络膜视网膜病症仅限于由正常视网膜和脉络膜分开的免疫细胞浸润作用的孤立区域。在涉及HCMV反应的区域内，该视网膜表现出水肿、免疫性细胞浸润作用、坏死以及正常细胞结构的缺损。在脉络管和常见的脉络膜炎区域明显充血肿胀的同时该脉络膜严重地充血。在这一低剂量组合治疗组中的病症与在中等剂量治疗组中的病症相类似。该病症比在高剂量PALA加DHPG组合治疗组和在DHPG单一试剂治疗组中的病症更严重且分布面更广。
组＃5：单一试剂DHPG（10mg/kg/天）。
在这一单一试剂治疗组中的动物在接种后第2天开始接受DHPG治疗，并一直持续到接种后第10天。每天10mg/kg的DHPG治疗分成两次施用。如在实例5中所证明的那样，DHPG治疗确实可减轻HCMV脉络膜视网膜感染和疾病以及玻璃体炎的发展。脉络膜视网膜疾病仍保持病灶，其视神经乳头中度发炎并有中度免疫细胞浸润。该脉络膜存在中度充血。在这些经过治疗的眼睛中疾病的临床感觉与高剂量PALA加DHPG组合治疗组相类似。在这一单一试剂组中的HCMV疾病比中剂量和低剂量组合治疗组中更好，且比空白对照物治疗组更好。在该单一试剂DHPG治疗组中的临床疾病与高剂量PALA组合治疗组相类似。事实上，该高剂量组合治疗方式可能比该单一试剂DHPG的治疗稍微更好一些，因此显示出这两个静脉治疗组的一个附加效果。
从细胞声波处理培养物中的HCMV回收结果表明HCMV回收率和从该样品中回收的HCMV的滴度出现了快速下降。在接种后第3天，在这一治疗组中从这两个脉络膜视网膜中均回收到了HCMV。HCMV的滴度测定为103pfu。在接种后第4天，HCMV回收值已降低至101滴度，且仅在2个脉络膜视网膜样品中的1个中较明显。在接种后第5天没有回收到HCMV，然而在接种后第6天从一个脉络膜视网膜样品中回收到一个较低的滴度（为101）。该HCMV回收频率和HCMV滴度的降低比中等剂量和低剂量组合治疗组和单一剂量试剂PALA组以及空白对照物治疗组要好。HCMV回收的方式与高剂量组合治疗组没有不同。
组＃6：空白对照物治疗。
接受空白对照物治疗的动物在接种后第2天开始接受消毒盐水+EDTA，每天注射一次，并持续到接种后第10天。经过空白对照物治疗的眼睛产生了轻度到中度的玻璃体炎。在该空白对照物治疗组中的玻璃体炎与在其它单一试剂和组合试剂治疗组中的严重程度不一样。在这些经过空白对照物治疗的眼睛中的脉络膜视网膜疾病比其它治疗组明显地要差。病灶性视网膜静脉出血和内视网膜出血是常见的。HCMV疾病的病灶面很大且导致了平均评分为1.5至2+的脉络膜视网膜疾病。该疾病包括局部区域的视网膜浸润病灶、视神经炎症和红肿以及轻度玻璃体炎。玻璃体炎包括具有周边细胞浸润物的玻璃体条、细胞凝块和混浊。空白对照剂治疗不能终止脉络膜视网膜的发展。在用空白对照物治疗的眼睛中视神经炎和炎症的平均水平与其它治疗组相当。
从空白对照物治疗组中HCMV回收结果表明在接种后第3-6天的HCMV回收量在该评价过程中其滴度从104降至102。空白对照物治疗组与其它治疗组比较具有最高的滴度回收值。
3结论
[1]使用高剂量PALA加DHPG的组合试剂治疗要优于所有其它组合试剂治疗。事实上，这一高剂量治疗与单独的DHPG治疗相比具有一种附加的抗病毒作用效果。
[2]从所有治疗组中在分析过程中均回收到HCMV。回收频率（如，呈阳性HCMV的病毒回收样品的数量）的差异随着治疗后时间的增加而减少。很明显从脉络膜视网膜的声波处理样品中所回收的病毒的滴度也随着接种后时间的增加而降低。HCMV回收值和HCMV滴度的降低与兔子所接受的治疗有关。
[3]组合试剂高剂量PALA加DHPG（治疗组＃2）对于减轻临床疾病和降低在脉络膜视网膜培养物中的HCMV回收值是最有效的组合试剂治疗。这种组合治疗与单一试剂DHPG的治疗一样好。这种组合试剂治疗与单一试剂DHPG治疗相比具有一种附加的抗病毒作用。
[4]在降低HCMV回收值方面，组合试剂和单一试剂治疗组的效果排列为：
高剂量组合剂PALA加DHPG（组＃2）≈单一试剂DHPGDHPG（组＃5）＞＞中等剂量组合试剂PALA加DHPG（组＃3）＞低剂量组合试剂PALA加DHPG（组＃4）＞单一试剂PALA（组＃1）＞空白对照物（组＃6）。
[5]高剂量PALA加DHPG的组合治疗对于保持视网膜结构是最有效的（opthalmologically）且通过最终的组织病理学可证实（结果未示出）。
表9对用单一和组合试剂静脉内治疗的动物的视神经炎评分视神经炎评分
10/19 10/20 10/21 10/22 10/23 10/26
3 4 5 6 7 10
组号 动物 ONH ONH ONH ONH ONH ONH
2 9 NR 2 2 2 0.5
2 10 2*2 4 4 5 1.5
2 S2 2 0 0 0 0 0
0
3 15 NR NR 4 4 3 3
3 17 NR 2 4 NR 6 2
3 S3 0 0 0 0 0 0
4 20 2 NR 2 2 NR 3
4 22 NR NR 2 2 6 2
4 S4 0 0 0 0 0 0
5 25 NR NR 4 3 3 3
5 29 2 NR 5 1 6 3
5 S5 0 0 0 0 0 0
6 35 0 1 5 6 3 3
6 36 NR 4 4 NR NR 4
ONH-视神经乳头;NR-未读出;＊评分代表每只兔子的两只眼中的视神经乳头变化（视神经炎）之和。
表10在接种后第3-6天由脉络膜视网膜细胞声处理培养物中回收的HCMV
宰杀的天数 动物数量 回收的 HCMV HCMV 滴度
OD OS OD OS
3 1 + + 104104
3 11 + + 103103
3 19 + - 104---
3 23 + + 102104
3 28 + + 103103
3 34 + - 104-105---
4 2 + + 103102
4 7 - + --- 101
4 12 + - 102---
4 18 - + --- 103
4 24 + - 101---
4 30 + + 103103
5 3 + + 101102
5 8 - - --- ---
5 13 - - --- ---
5 19 - - --- ---
5 26 - - --- ---
5 31 - - --- 102
6 4 + + 101101
6 6 - - --- ---
6 14 - + --- 101
6 21 + - 101---
6 27 + - 101---
6 33 - + --- 102
培养物代表在静脉内治疗期间的HCMV细胞声处理培养物，将培养物放在12井中，将所有的阴性培养物在黑暗中传代培养4次，共28天，在确定培养物中存在HCMV（阴性）之后利用标准噬菌斑试验确定阳性培养物中的HCMV滴度
表11由单一和组合试剂治疗组回收的HCMV由脉络膜视网膜培养物回收的HCMV的平均滴度
接种后天数
治疗组 3 4 5 6
组 #1 2/2*; 2/2; 2/2; 2/2;
[50mg/kg/天PALA] 104**102.5101.5101
组 #2 2/2; 103.51/2; 0/2 0/2
[50mg/kg/天PALA 加 101
10mg/kg/天DHPG]
Gro组 #3 1/2; 1041/2; 0/2 1/2;
[25mg/kg/天PALA 加 102101
7.5mg/kg/天DHPG]
组 #4 2/2; 1031/2; 0/2 1/2;
[10mg/kg/天PALA 加 103101
5mg/kg/天DHPG]
组 #5 2/2; 1031/2; 0/2 1/2;
[10mg/kg/天DHPG] 101101
组 #6 2/2; 104.52/2; 1/2; 1/2;
[空白对照物] 103102102
例7
兔体内PALA上升剂量效能的评价，在评价过程中的临床和HCMV回收情况。
通过对比临床HCMV疾病、由细胞声处理培养中回收的HCMV、和由HCMV诱导的组织病理学上疾病严重程度采用这些实验来评价在兔模型中感染HCMV后，上升剂量静脉治疗研究中PALA的效能。将由脉络膜视网膜声处理共同培养物得到的HCMV滴度与用DHPG和空白对照物治疗的动物中回收的HCMV滴度作对比。
方法
用于本研究的总共有60只染色的兔子，用狭缝灯和间接检眼镜评价动物，以确定正常眼的形态和预先没有病状。
动物的处理方式如下：
[1]0天时，所有的动物都经间接检眼镜评价，确保后段是正常的。在眼底检查之后使动物接受局部眼药水使瞳孔放大。每日进行局部眼药水疗法自接种后持续10天。
[2]0天时，所有的兔子都通过玻璃体（vitreal）注射100μl的105PFU HCMV菌株AD169进行接种。
[3]将动物保存在各个笼子内并每日监测发展的脉络膜视网膜HCMV病。接种后第2天，将接种HCMV的动物按每10只接种HCMV的兔子加1只假接种的兔子分为1组。感染HCMV的和假接种的兔子接受如下所述的静脉治疗：
单一试剂PALA上升剂量静脉治疗：
组＃1：10只接种HCMV的兔子，在接种后第2-10天静脉注射PALA（50mg/kg）。每只兔子总共静脉内注射9次。
将这组兔子在研究过程中，于接种后第3、4、5和6天杀死，以评价HCMV回收和滴度的降低。取出两只兔子（4只眼睛）并作处理从而在接种后各个时间点从细胞声处理物中回收HCMV。剩余的2只动物接着进行为期9天的疗程。
组＃2：10只接种HCMV的兔子，在接种后第2-10天静脉注射PALA（75mg/kg）。每只兔子Ⅳ注射9次。
将这组兔子在研究过程中，接种后第3、4、5和6天处死，以评价HCMV回收和滴度的降低。取出两只动物（4只眼睛）并作处理从而从声处理细胞中在接种后每个时间点回收HCMV。剩余的2只动物接着进行为期9天的疗程。
组＃3：10只接种过HCMV的兔子，在接种后第2-10天静脉注射PALA（100mg/kg）。每只兔子静脉内注射9次。
将这组动物在研究过程中在接种后3、4、5和6天处死，以评价HCMV的回收和滴度。取出两只兔子（4只眼睛）并处理从而从声处理细胞中在接种后每个时间点回收HCMV。剩余的2只兔子接着做为期9天的疗程。
组合试剂PALA加地塞米松结膜下治疗
组＃4：10只兔子在HCMV接种前1小时，接受4mg的结膜下depo地塞米松。兔子接受静脉注射PALA（接种后2-10天75mg/kg/天）。
将这组动物在研究过程中在接种后第3、4、5和6天处死，以评价HCMV回收和滴度的降低。取出两只动物（4只眼睛）并处理从而从声处理细胞中在接种后每个时间点回收HCMV。剩余2只兔子随后进行为期9天的疗程。
正和负对比物治疗组：
组＃5：10只接种HCMV的动物，在接种后第2-10天按10mg/kg/天的剂量分两次静脉注射。
将这一组的动物在研究过程中，在接种后第3、4、5和6天处死，以评价HCMV的回收和滴度降低情况。取出两只动物（4只眼）并作处理从而从声处理细胞中、在接种后每个时间点回收HCMV。剩余2只动物接着进行为期9天的疗程。
组＃6：10只接种HCMV的动物，在接种后第2-10天静脉注射消毒盐水。
将这组在研究过程中，在接种后第3、4、5和6天处死，以评价从视网膜中的回收HCMV和滴度降低。取出两只动物（4只眼睛）并作处理从而从声处理细胞中在接种后每个时间点回收HCMV。剩余的2只动物接着作为期9天的疗程。
[4]所有的动物每天接受间接检眼镜的检查或用手持+90屈光度棱镜的狭缝灯检查，以评价临床HCMV病的进展（接种后第2-10天）。由两个伪装起来的读数器独立完成眼底检查，使兔子接受治疗。
[5]所有兔子或在研究过程中在接种后第3、4、5和6天处死，以评价PALA单一试剂对HCMV滴度降低的影响，或者在接种后第2天从组织学上证实临床过程PALA的疗效。
将由所有经过药物处理的静脉治疗组得到的临床、病毒回收和组织效能结果彼此之间和空白对照物治疗组之间相互联系进来。
概括说明在整个上升剂量效果评价过程中的各个兔子。
第0天，所有的兔子通过狭缝灯生物显微镜和眼底检查作预评价。动物编号1-60;和S1-S3。在预检查之后，立即对动物进行HCMV玻璃体内（intrvitresl）注射接种。在按将兔子随机分成几个组：
第1天，动物按下列指示接受静脉治疗（从1天-10天）：
组＃1：兔子＃1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和假接种兔S1-50mg/kg PALA。
组＃2：兔子＃11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和1只假接种动物＃S2-每日接受静脉注射75mg/kg PALA。
组＃3：兔子＃21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和1只假接种动物＃S3-每日接受静脉注射100mg/kg PALA。
组＃4：兔子＃31、32、33、34、35、36、37、38、39、和40在接种单一结膜下注射4mg醋酸6-甲强的松龙（depomedrol）（甾族化合物）后立即接种HCMV。然后使这些动物每日接受75mg/kg PALA的静脉治疗。
组＃5：兔子＃41、42、43、44、45、46、47、48、49和50每日接受DHPG（10mg/kg/天）的静脉治疗。
组＃6：兔子＃51、52、53、54、55、56、57、58、59和60每日接受空白对照物的静脉治疗（消毒盐水加EDTA注射液）。
接种HCMV且经过单一试剂处理的动物的宰杀
接种后第3天：为回收HCMV而将下列动物杀死并进行脉络膜视网膜细胞声处理培养
组＃1：兔子＃1和2
组＃2：兔子＃11和12
组＃3：兔子＃21和22
组＃4：兔子＃31和32
组＃5：兔子＃41和42
组＃6：兔子＃51和52
接种后第4天：为回收HCMV而将下列动物杀死并进行脉络膜视网膜细胞声处理培养
组＃1：兔子＃3和4
组＃2：兔子＃13和14
组＃3：兔子＃23和24
组＃4：兔子＃33和34
组＃5：兔子＃43和44
组＃6：兔子＃53和54
接种后第5天：为回收HCMV而将下列动物杀死并进行脉络膜视网膜细胞声处理培养
组＃1：兔子＃5和6
组＃2：兔子＃15和16
组＃3：兔子＃25和26
组＃4：兔子＃35和36
组＃5：兔子＃45和46
组＃6：兔子＃55和56
接种后第6天：为回收HCMV而将下列动物杀死并进行脉络膜视网膜细胞声处理培养
组＃1：兔子＃7和8
组＃2：兔子＃17和18
组＃3：兔子＃27和28
组＃4：兔子＃37和38
组＃5：兔子＃47和48
组＃6：兔子＃57和58
接种后第12天：为了进行组织学评价或为了从脉络膜视网膜细胞声处理培养物中回收培养的HCMV，将动物处死并处理其组织。在效果评价结束时处死的动物每天用间接检眼镜进行观察。将这些动物HCMV病的临床印象用于构建玻璃体-视网膜病曲线（在本文中图示证明的），评价结束时处死的动物包括：
临床疾病印象：玻璃体炎和脉络膜视网膜病的发展
图9和10概述了在静脉单一试剂组中有关玻璃体视网膜疾病的发展数据。脉络膜视网膜病的发展由于40%的眼睛在接种后4-5天内的玻璃体炎的发展而部分变得模糊不清。条形图表明了在上升剂量PALA治疗的和对比物治疗的动物中玻璃体-视网膜病程的趋势。
表12、13、14和15概述了在接种后第3、4、5和6天从4只眼睛/治疗组得到的有关玻璃体炎和视神经乳头疾病严重程度和回收HCMV的原始数据。
结果
单一试剂PALA静脉治疗
组＃1：PALA单一试剂治疗，50mg/kg/天
将本治疗组中的兔子＃1-8在HCMV回收研究过程中处死。随后对50mg/kg/天单一试剂治疗组中的动物＃9和10在整个静脉治疗过程中进行评价。到接种后第6天，临床疾病表明玻璃体炎增强了。接种后第7天，玻璃体炎（炎症反应）降至低水平。这种观测与先前对单一试剂50mg/kg/天 PALA治疗中玻璃体炎病情发展的观测结果相类似。视神经乳头病的严重程度也与以前报导的50mg/kg/天治疗眼睛的相类似。在本项研究中，视神经乳头病状在接种后第4天达到峰值，在研究的其余过程中降至低水平。
通过单一试剂治疗组的细胞声处理试验回收的HCMV结果表明在接种后第3、4、5和6天脉络膜视网膜中存在着病毒。培养样品中的HCMV滴度最高是在接种后第3天，当时由4种脉络膜视网膜细胞声处理样品回收的HCMV平均值为103.5pfu。接种后第4和5天，由处理过的眼睛回收HCMV的频率下降。当从4/4脉络膜视网膜细胞声处理样品回收HCMV时，可以看到在接种后第6天，病毒回收量（HCMV回收频率）回缩。当可以看到HCMV滴度轻微回缩至102pfu/ml时，除接种后第6天以外，整个回收过程中的HCMV滴度都在下降。在该单一试剂治疗组中的HCMV回收，较从经空白对照物处理的眼睛中的回收要好，而且与经DHPG处理过的眼睛相当。（用DHPG处理过的眼睛具有稍低的HCMV滴度而且在回收研究中，几乎没有阳性的脉络膜视网膜样品）。
假接种的且经过PALA50mg/kg/天处理的动物，＃S1，在研究的过程中出现了轻微的玻璃体炎。接种后第7天，50mg/kg/天假接种动物的玻璃体炎水平为0.5-0.75。
组＃2：PALA单一试剂治疗，75mg/kg/天
将该治疗组中的兔子＃11-18，在HCMV回收研究过程中处死。随后对75mg/kg/天单一试剂治疗组中的动物＃19和20在整个静脉治疗过程中进行评价。到接种后第6天，临床疾病表明为玻璃体炎增强了。在接种后第7天，玻璃体炎（炎症反应）仍然在增加。视神经乳头疾病的严重程度与以前报导的50mg/kg/天治疗眼睛的相类似。视神经乳头病状在接种后第4天达到峰值而后迅速下降。在接种后第7天，根据临床评价，没有明显的视神经乳头变化。假接种的且经过PALA50mg/kg/天处理的动物，＃S1，在研究的过程中没有发生任何的玻璃体炎，也没有发生脉络膜视网膜疾病。
通过该单一试剂治疗组的细胞声处理试验回收的HCMV结果证明接种后第3、4、5和6天，在脉络膜视网膜中有病毒存在。接种后第3天和4天，培养样品的HCMV滴度达到最高，当时在每个时间点从脉络膜视网膜细胞声处理样品中回收的HCMV平均为104.5103.75pfu。接种后第5天，HCMV滴度降至低水平。在接种后第4和5天，由处理过的眼睛回收HCMV的频率下降。然而，从中回收病毒的样品数量在接种后第6天增加，这说明在50mg/kg/天治疗组中出现了回缩。在75mg/kg/天治疗组中在接种后第6天，有3/4的样品对通过细胞声处理回收的HCMV呈阳性。在该单一试剂PALA处理组HCMV回收频率的增加是可重复的。在该单一试剂治疗组中的HCMV回收与空白对照物治疗组相当。该单一试剂治疗组在降低HCMV滴度和降低HCMV回收频率方面的效果不如DHPG，所述HCMV是从脉络膜视网膜组织回收的。
组＃3：PALA单一试剂治疗组，100mg/kg/天
将这一治疗组中的兔子＃21-28，在HCMV回收研究过程中处死。随后对100mg/kg/天单药剂治疗组的兔子＃29和30，在整个静脉疗法过程中进行评价。在整个研究过程中，临床疾病证明玻璃体炎增强了。在接种后第7天，玻璃体炎（发炎反应）仍保持增强，并且与75mg/kg/天组所观测到的玻璃体炎相当。视神经乳头病状在接种后第4天达到峰值。到接种后第7天，根据临床评价，视神经乳头变化呈中等程度到高等程度，症状很明显。玻璃体炎和视神经乳头疾病的严重程度与其它单一试剂PALA、DHPG和空白对照物治疗相比增加了。100mg/kg/天的剂量可能是该化合物的毒性界限或稍微高予该毒性极限。但值得注意的事实是经100mg/kg/天处理的HCMV病没有取得改进。有关上升剂量允许值的这些结果证明PALA在这样高的浓度是不能忍受的。事实上，100mg/kg/day剂量对动物是有毒的。
假接种的且经过PALA/kg/天处理的动物，＃3，在接种后第5-7天，发生中等的玻璃体炎和暂时性的视神经乳头变化。这些结果证明100mg/kg/天疗法是在毒性范围内的。
在该单一试剂治疗组中通过细胞声处理试验回收的HCMV结果证明在接种后第3、4、5和6天脉络膜视网膜内存在着病毒。培养样品中的HCMV滴度在接种后第3天是最高的，当时由脉络膜视网膜细胞声处理样品中回收的HCMV平均为104pfu。在接种后第5天，HCMV滴度降至很低的回收水平（102pfu/ml）。最重要的是，由处理过的眼睛回收HCMV的频率在接种后第4和5天出现下降。然而，在接种后第6天，由脉络膜视网膜细胞声处理培养回收的HCMV滴度出现上升同时阳性培养物的数量（例如，由细胞声处理样品的HCMV回收频率）也在增加。在接种后第6天，在100mg/kg/天治疗组中，对于由细胞声处理回收的HCMV有3/4的样品呈阳性。HCMV滴度增加到与接种后第3天HCMV回收滴度相同的水平。在这种单一试剂治疗组中HCMV回收显著高于经空白对照物处理的动物的HCMV回收。该单一试剂治疗组在降低临床疾病进展或从细胞声处理培养物的HCMV回收方面都是无效的。
组＃4：PALA单一试剂治疗（100mg/kg/天）加4mg结膜下的甾族化合物注射
将该治疗组的兔子＃31-38，在HCMV回收研究过程中处死。随后对在该75mg/kg/天单一试剂治疗加4mg结膜下的甾族化合物治疗组中的兔子＃39和40，在整个静脉治疗过程中进行评价。在整个评价期的过程中，临床疾病证实玻璃体炎是轻微的。视神经乳头病的严重程度的降低与所有其它治疗组相当。该临床疾病的严重程度的下降是结膜下的甾族化合物注射的直接反应，所述注射可使眼睛镇静并可降低寄主对HCMV接种的免疫应答。
在这种单一试剂治疗组中，从细胞声处理试验回收的HCMV，结果证明接种后第3、4、5和6天时脉络膜视网膜中有病毒存在。在整个研究过程中，培养样品中的HCMV滴度仍保持增长。在接种后第3-6天回收的HCMV的平均滴度为103pfu。除了在甾族化合物治疗组中回收到较高的HCMV滴度之外，HCMV回收频率（阳性样品数量）与50mg/kg/天和75mg/kg/天治疗组相似（例如，HCMV回收频率的逐渐降低，紧接着在接种后第6天HCMV回收出现回缩）。尽管玻璃体炎的发展和视神经乳头的变化在所述甾族化合物治疗组内有所下降，但是病毒的滴度还是有提高的，这说明甾族化合物增强了HCMV的复制（或检测），75mg/kg/天PALA治疗对于抑制疾病的发展、HCMV复制和由脉络膜视网膜组织的回收是无效的。
组＃5：单一试剂DHPG（10mg/kg/天）。
将该治疗组中的兔子＃41-48在HCMV回收研究的过程中处死。随后对在10mg/kg/天单一试剂DHPG治疗组中的兔子＃49和50，在整个静脉治疗过程中进行评价。单一试剂治疗组的动物从接种后第2天开始持续到接种后第10天一直接受DHPG治疗。10mg/kg/天DHPG剂量分成2次给药。正如已前研究中所证明过的，DHPG治疗能降低由HCMV诱导的视神经疾病严重程度的发展。玻璃体炎的发展只在一定程度上受DHPG治疗的影响。
从细胞声处理培养物回收的HCMV结果证明HCMV的回收速率和由样品回收的HCMV滴度迅速下降。在接种后第3天，测量的HCMV滴度是103pfu。在接种后第4天，HCMV回收已降至滴度101.25，HCMV回收频率和滴度连续降到接种第6天。HCMV滴度或阳性HCMV组织数量在DHPG治疗组中没有出现回宿。HCMV回收和滴度降低图与以前在其它的单一试剂DHPG治疗组所证实的没有差别。
组＃6：空白对照物治疗。
在HCMV回收研究过程中，将该治疗组中的兔子＃51-58处死。随后在静脉治疗过程中，对经空白对照物处理的治疗组中的兔子＃59和60进行评价。经空白对照物处理的动物，从接种后第2天开始直到第10天每天接受消毒盐水+EDTA的单一注射。经空白对照物处理的眼睛发生轻微到中等程度的玻璃体炎。空白对照物处理组的玻璃体炎在整个研究过程中一直在加剧。玻璃体炎包含玻璃体条，它具有周边细胞侵润、细胞聚集和混浊。在空白对照物处理过的眼睛中，视神经炎和炎症的平均水平与其它治疗组相当。
由空白对照物处理组回收的HCMV结果证实在评价过程中在接种后第3-6天回收的HCMV其滴度由104.5降至102。空白对照物处理组与其它治疗组相比具有较高滴度回收。正如在PALA单一试剂治疗组所证明的那样，在第6天的HCMV回收或滴度中不存在回缩。
结论
[1]用PALA50，75和100mg/kg/天的上升剂量治疗兔子，在效果方面没有提高。事实上，100mg/kg/天组对动物是有毒的。眼病仍保持在高水平上。当与50mg/kg/天PALA剂量或10mg/kg/天DHPG剂量比较时，75mg/kg/天剂量没有改善。
[2]从所有治疗组的分析过程中均回收到HCMV，回收频率（例如HCMV阳性病毒回收样品的数量）方面的差异伴随着治疗后时间的延伸而减少。很明显由脉络膜视网膜声处理样品回收的病毒滴度也伴随接种后时间的延伸而减小。感兴趣的结果是在所有的PALA单一试剂治疗组中，在接种后第6天的HCMV检测和HCMV滴度中均存在回缩。这种滴度和频率的观察结果在较高的PALA治疗浓度时更加明显。
[3]结膜下甾族化合物注射组的结果证明甾族化合物治疗确实抑制了玻璃体炎和视神经乳头病症。对甾族化合物处理组的病程的评价是容易的，75mg/kg/天治疗，如同在非甾族化合物处理的75mg/kg/天治疗中一样，和DHPG治疗一样无效。使用甾族化合物的一个潜在问题是接种后第3-6天HCMV的滴度持续增长。除了滴度提高之外，HCMV回收频率与单一试剂75mg/kg/天PALA处理眼睛对所观察到的类似。
[4]在该上升剂量治疗评价中，在减少HCMV回收方面单一试剂治疗组的效果排列是：
DHPG治疗（组＃5）＞PALA单一试剂50mg/kg/天（组＃1）＞＞PALA单一试剂75mg/kg/天（组＃2）＞或等于空白对照物治疗（组＃6）＞＞单一试剂PALA100mg/kg/天（组＃3）＞单一试剂PALA75mg/kg/天加4mg结膜下甾族化合物注射（组＃4）。
根据本研究和以前研究的结果，单一试剂PALA治疗在降低视网膜中HCMV疾病的发展和减少HCMV病毒回收方面（从脉络膜视网膜样品中回收的HCMV的滴度和HCMV回收频率）与DHPG治疗一样无效。因此，正如例6所证实的一样，在治疗HCMV病毒感染时，最好使用PALA组合治疗。
表12用单一试剂静脉注射治疗处理的动物的脉络膜视网膜和玻璃体炎的评分
玻璃体-视网膜 评分
组 动物 1/11 1/12 1/13 1/14 1/15
3 4 5 6 7
1 9 1.0*0.75 0.65 0.75 0.4
1 10 1.5 2.5 1.25 0.6 0.4
2 19 2.25 2.75 1.75 2.0 无
2 20 1.5 3.5 3.5 5.5 评分
5.0
3 29 1.0 4.5 3.5 4.0 3.25
3 30 0.75 3.75 3.0 4.0 4.25
4 39 1.0 0.75 0.75 1.5 1.0
4 40 1.0 1.5 1.0 1.75 2.25
5 49 4.75 3.75 4.0 2.5 3.25
5 50 5.0 5.75 5.0 5.25 5.5
6 59 1.0 2.25 3.0 3.0 1.75**
6 1.25 2.75 2.75 3.0 3.0-
＊评分代表两只眼睛/兔子的总和。
＊＊只有一种可以评价。
＊＊＊只有白色反射
表13用单一试剂静脉治疗法处理的动物的视神经炎评分
视神经炎评分
Group # Animai 1/11 1/12 1/13 1/14 1/15
3 4 5 6 7
ONH ONH ONH ONH ONH
1 9 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0
1 10 2.0 3.0 1.0 0.5 0
2 19 2.0 4.0 3.0 2.0 0
2 20 2.0 5.0 5.0 NR NR
3 29 2.0 6.0 5.0 4.0 2.5
3 30 3.0 5.0 4.0 4.0 4.0
4 39 0 0 1.0 0 0
4 40 0 1.0 1.0 0.5 0.5
5 49 5.0 6.0 4.0 2.0 2.0
5 50 4.0 5.0 5.0 2.0 ?
6 50 3.0 3.0 5.0 4.0 5.0
6 60 2.0 4.0 2.0*4.0 ?
ONH-视神经乳头;NR-未读出;＊评分代表两只眼睛/兔子的视神经乳头变化（神经炎）的总和。？眼底观测模糊;＊＊只一面评价。
表14接种后3-6天从脉络膜视网膜细胞培养物回收的HCMV
回收的 HCMV HCMV 滴度
组 杀死天数 动物序号 OD OS OD OS
1 3 1 + + 103104
1 3 2 + + 104103
1 4 3 - - -- --
1 4 4 + - 104--
1 5 5 - + -- 102
1 5 6 + - 102--
1 6 7 + + 102103
1 6 8 + + 102102
1 12 9 - - -- --
1 12 10 - - -- --
2 3 11 + + 105104
2 3 12 + + 104104
2 4 13 + + 104103
2 4 14 + - 104--
2 5 15 - - -- --
2 5 16 - + -- 102
2 6 17 + + 103104
2 6 18 - - -- --
2 12 19 - - -- --
2 12 20 - - -- --
3 3 21 无数据/动物在培养前死去
3 3 22 + + 104103
3 4 23 + + 105103
3 4 24 + + 103104
3 5 25 - + -- 102
3 5 26 - - -- --
3 6 27 + - 102--
3 6 28 + + 102103
3 12 29 - - -- --
3 12 30 - - -- --
表14（续）
回收的 HCMV HCMV 滴度
组 杀死天数 动物序号 OD OS OD OS
4 3 31 + - 104--
4 3 32 - + -- 104
4 4 33 + + 103104
4 4 34 - - -- --
4 5 35 - - -- --
4 5 36 - + -- 103
4 6 37 + + 104104
4 6 38 + - 103--
4 12 39 - - -- --
4 12 40 - - -- --
5 3 41 + - 104--
5 3 42 + + 104103
5 4 43 + - 102--
5 4 44 + - 103--
5 5 45 - + -- 102
5 5 46 + - 102--
5 6 47 - - -- --
5 6 48 - + -- 102
5 12 49 - - -- --
5 12 50 - - -- --
6 3 51 + + 104105
6 3 52 + + 104104
6 4 53 + + 102104
6 4 54 + + 104103
6 5 55 + - 102--
6 5 56 + + 102102
6 6 57 + + 103102
6 6 58 - + -- 101
6 12 59 - - -- --
6 12 60 - - -- --
在静脉治疗期间培养结果是HCMV细胞声处理培养物。将培养物放在costar cluster的12个小井中，将所有的阴性培养物在黑暗中传代3次总培养时间为28天，阳性培养物中的HCMV滴度测定是在确定培养物中存在HCMV（阳性）后用标准噬菌斑试验进行的。
表15从单一的组合试剂治疗组中回收HCMV由脉络膜视网膜培养物中回收的HCMV的平均滴度
治疗组 3 4 5 6
组 #1 4/4*;101/4;101.52/4;1014/4;102
[50mg/kg/天PALA]
组 #2 4/4;104.53/4;103.751/4;1022/4;101.75
[75mg/kg/天PALA]
组 #3 4/4;1043/4;1031/4;1023/4;102.5
[100mg/kg/天PALA]
Gr组 #4 2/4;1032/4;103.51/4;1033/4;103.5
[75mg/kg/天PALA 加 4
mg 结膜下类固醇
steroid]
组 #5 3/4;1032/4;101.252/4;1021/4;101
[10mg/kg/天DHPG]
组 #6 4/4;104.54/4;103.53/4;101.253/4;102
(空白对照物
实例8
以下部分描述一些实验，其中用牛痘病毒感染非洲绿猴，且用PALA、利福平以及它们的组合来进行治疗。其结果表明利福平结合PALA可以比任何其它的治疗更好地减轻损害（图12）。另一方面，在接受单独PALA50mg/kg/天的猴中和那些接受PALA与利福平相组合治疗的猴中（图13）均发现病毒的滴度更低。
1材料和方法
在实验中使用15只成年非洲绿猴，以评价单独的指定的PALA化合物和PALA与利福平的组合在抑制牛痘病毒感染方面的能力。在开始研究之前，对15只猴子的每一只中提取的血清在1∶10稀释条件下进行血清反应阴性（对牛痘病毒）测试。所采用的试验采用100TCID50病毒进行血清中和试验。
牛痘病毒感染是一种皮肤感染，它是通过皮内注射0.1ml经1∶100稀释的贮存病毒而产生的，该注射在剃光的每个猴的背部八个位点的每一个上进行。该病毒接种物的滴定表明每个注射位点接受了106TCID50病毒。
在病毒注射之后，将这些猴分成5组，每组3只猴，分组结果列于表1。在接种病毒前，对每个猴称重，提取5ml血浆作为原始血浆和淋巴细胞样品。
在病毒接种后24小时开始用PALA和/或利福平进行治疗。两种药剂在治疗当天重新制备。PALA是在含有5ml溶液100mg/ml的小玻璃瓶中提供的。在pH7.2PBS中制备1∶4稀释液，其结果药物浓度为25mg/ml。在第1组和第3组中的猴接受PALA50mg/kg/天治疗，通过静脉注射给药，分为每日早8点和晚8点钟分开给药。25mg/ml的PALA溶液进入隐静脉中，每公斤体重施用1ml。
将利福平按300mg等分称出，将其溶解在10ml DMSO中且加到60ml体积。这一稀释的结果是其浓度为5mg/ml。第2、3组接受静脉注射，每公斤体重注射1ml或5mg/kg。每日在早8点钟和晚8点钟进行两次治疗，结果每日剂量为10mg/kg。
第5组的猴子在感染后第1天和第7天接受PALA，以125mg/kg进行一次静脉注射。第4组是一个感染对照组，通过每日早8点和晚8点的静脉注射施用PBS。所有的治疗持续到第10天。
感染通过每日检查损害位点而评价，且对于增加的严重程度以±到4+的等级对它们进行评分。每只猴的总评分通过将各个损害值加在一起而确定，并通过用该总值除以注射位点数而确定平均值。因此对每只猴提供每日的平均损害值。
另一方面，在感染后第3、7、和10，对每只猴的一个损害位点进行活体解剖，此时开一个8mm皮肤切口。通过缝合关闭该活体解剖位点。将每一块活体解剖的皮肤转移到一个玻璃组织研磨器中，且该组织在2ml组织培养基中均化（最小基本培养基，含有2%胎牛血清和抗生素）。该组织匀浆通过制备系列十倍稀释物对牛痘病毒进行滴定，该稀释物是在含有Vero细胞的24小井培养板中复制培养的。在接种4天之后，将培养物在甲醇中固定，用亚甲蓝基品红染色，且进行噬菌斑计数。
在感染后第0、3、6、8和10天，在肝素中收集5ml血液，将血浆和细胞分离。将该血浆冷冻在-200℃下，且用PBS1∶1稀释该细胞，并层放在ficoll-hypaque梯度上。随后以1400rpm的转速离心作用30分钟，收集淋巴细胞带，并有含有15%胎牛血清的RPMI-1640培养基中将其洗涤两次。在第二次洗涤之后去除培养基，将沉淀的细胞悬浮在一种1mM二硫苏糖醇、1mMEDTA和10mM乙酸镁的溶液中，并冷冻在-70℃条件下。
将这些猴在第10、14、和21天称重，并在第14和21天抽血以测定对牛痘病毒的抗体滴度。抗体滴度通过血清中和试验来测定。
2结果
每只猴的平均损害值示于表16中。在第3、6、7、8、9、10和13天对每个猴背上的所有位点进行损害评分，并计算其平均值。每天对每一组的猴的平均值进行测定，且以黑体字的型式看到。该数据表明50mg/kg/天的PALA和50mg/kg/天的PALA与10mg/kg/天的利福平的组合对于减轻损害发展和减小尺寸是有效的。两只感染对照猴具有可看见的损害，而另一只对照猴具有中度损害。用利福平治疗的猴也可看见具有可见的皮肤损害，又有两只猴表现出比第三只猴子更严重的感染。在感染后第1-7天接受125mg/kg PALA施药的组中，一只猴在用药后4小时死去。总的病理学结果包括肝部的深红色变色作用，这说明可能发生了急性休克或中毒。组织病理学结果在以后将会报告。在损害表现方面，接受高剂量PALA的一只猴表现出一般严重的损害，而另一只具有更为中等程度的损害。在感染后第1天和第7天用高剂量PALA治疗的猴中，损害的严重程度要比用较低剂量PALA每日治疗的猴所看见的损害更大。
从每个猴身上皮肤活体解剖中的病毒滴定在每个治疗组内以及在对照组中猴子和猴子之间各不相同（表3）。牛痘病毒的较高滴度在感染对照组、利福平组以及高剂量PALA组中表现出来。病毒的较低滴度在接受50mg/kg/天PALA的猴中和在接受PALA和利福平组合组中表现出来。
没有明显的迹象表明毒性存在于任何用PALA或用利福平治疗的猴中（除了那只在施用PALA125mg/kg之后就死了的猴子之外）。两只存活的接受这种剂量的猴子，在感染后第7天接受第2次125mg/kg的注射，没有任何不良症状。
表16由感染牛痘病毒的非洲绿猴背上的接种点得到的牛痘损害评分
＊按+到4+的等级（相应于增加的程度）进行评分，每个评分代表每只猴子的7（＊＊），6（＊＊＊）或5（＊＊＊＊）位点的平均值
表17在来自非洲绿猴的皮肤损害活体解剖的匀浆中的牛痘病毒的滴度
＊在2.0ml组织培养介质中将8mm活体解剖物均化，并在接种Vero细胞的24井板中的复制井中进行滴定
表18对用牛痘病毒感染的并用PALA和/或利福平治疗的猴中的牛痘病毒的中和抗体滴度
表19用牛痘病毒感染的且用PALA和/或利福平治疗的非洲绿猴的体重
实例9
通过棉鼠研究PALA抗呼吸合胞体病毒（RSV）的情况。
以下部分描述了一些实验，其中用呼吸合胞体病毒先感染棉鼠，并用PALA、三氮唑核苷（ribavirin）、或它们的组合治疗三天。其结果表明10mg/kg/天的PALA是最有效的;用PALA（10mg/kg/天），组织病症明显减轻，且病毒滴度下降一个log10。
1材料
棉鼠（远亲繁殖的有短硬毛的棉田鼠（sigmoden hispidus）），任何性别，50至100克。攻击病毒：RSV A1，约100棉鼠中感染剂量（CRID50;100μl，鼻内（i.n）给药）。PALA（30mg/kg/天）、三氮唑核苷（30mg/kg/天）、以及它们的结合治疗，两个化合物均内腹膜给药（i.p.）。动物在（+）4天处死，将肺均化，且对RSV进行滴定。
总动物数：24。
实验记录：在棉鼠初步体内筛中的呼吸合胞体病毒（RSV）（采用16只动物）。
＊（天0＝病毒接种日，所用的各种药物的剂量及方案均随实验1的结果而变化）
呼吸合胞体病毒肺滴度（LOC10）PALA对三氮唑核苷实验（对RSV）
两个平均值之间的统计评价差异：
具有单程Anova（对T试验可变）的T试验：空白对照物对PALA10mg/kg/d（t＝3.1650;df＝15;双尾形p＝0.0064）。
2测试PALA抗棉鼠中RSV的抗病毒活性的实验结果的总结
2.1程序
1.对50至100g任何性别的棉鼠在第0天用RSA2（库8-28-92）进行接种（i.n.）
2.在第+1天如下所述向动物供给空白对照物或PALA
组1：空白对照物（水）腹膜内（i.p.）第+1天-第+3天
组2：PALA3mg/kg/天腹膜内 第+1天-第+3天
组3：PALA10mg/kg/天腹膜内 第+1天-第+3天
组4：三氮唑核苷40mg/kg/天腹膜内 第+1天-第+3天
组5：三氮唑核苷40mg/kg/天+ 第+1天-第+3天
PALA mg/kg/天腹膜内
3.将所有动物于第+4天处死，且将它们的肺用于RSV水平试验
划线的表示在用Kruskal-Wallis非参数ANOVA试验和Newman-Reuls试验作多重比较时明显不同于空白对照物的平均值（p＜0.05），采用具有单程ANOVA的t-试验则更明显。
＊多重比较方法
＊＊所采用的治疗以mg/kg/天计（腹膜内）
3结论
结果表明PALA作为单一药物在抗呼吸合胞体病毒方面具有统计学上有意义的效果。从统计学上看PALA比三氮唑核苷更好。在PALA和三氮唑核苷之间没有呈现出附加的和/或协同的作用。
很明显，对于本领域技术人员来说在上述公开的范围内对本发明作出修改和变化是可能的。应当知道，这些修改是包括在本发明的精神和范围内的，这将通过权利要求书来限定。