双特异性免疫脂质体药物及其制备 本发明涉及一类具有双特异性的免疫脂质体药物及其制备工艺。
肿瘤的生物反应调节剂治疗是当前肿瘤免疫治疗中的重要研究课题。已有的生物反应调节剂或免疫活性药物，如自细胞介素-2(以下称IL-2)、肿瘤坏死因子(以下称TNF)等，在体内的半衰期短，需要反复大剂量给药，常引起严重的毒副反应且对靶细胞特异性差，临床应用受限(Rosenberg SA，J Clin Oncol 1992，10：180)。
脂质体是脂质膜性小球，无毒无免疫原性，包裹免疫药物可延长药物半衰期，减轻毒副作用，但药物对肿瘤细胞的特异性不理想且存在细胞内化问题，使药物失效。(Anderson PM，J Immuncther 1992；12：19)。
已有人制备双特异性抗体，可将T细胞导向至靶细胞，但制备复杂，难于纯化，应用时仍需给予外源性免疫药物IL-2，并未解决IL-2的毒性及特异性问题(Palazzo IG，Cancer Res 1992；52：5713)。
免疫脂质体可解决药物的特异性传递，有报道在脂质体中掺入特殊脂质，制成靶敏感释放型免疫脂质体，一旦结合靶细胞即释放药物(Ho RTY，J Biol Chem 1987，262：13973)。但未见将靶敏免疫脂质体的特性与双特异性抗体的双特异性集于一身的双特异性免疫脂质体的文献报道。
本发明的目的是制备一种特异性强、延长半衰期、低毒的新型免疫脂质体药物。
本发明采用靶敏型脂质体包裹生物反应调节剂，在其表面连接抗肿瘤抗体和抗T细胞抗体，制成抗肿瘤和抗T细胞双特异性免疫脂质体。现详述本发明：1复方脂质
双油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE) 72％-90％
卵磷脂(PC) 9％-20％
吡啶二硫基-DOPE 0.5％-8％优选配方为：
双油酸磷脂酰乙醇胺 79％-82％
卵磷脂 16％
吡啶二硫基-DOPE 2％-5％2将肿瘤抗体用N-羟基琥珀酰亚胺软脂酸酯(以下称NHSP)修饰并纯化(方法见徐梁，中华医学杂志，1994；74：83)。取复方脂质溶于氯仿，置圆底烧瓶中旋转蒸发至于，成为均匀的脂膜。加入免疫活性药物和经修饰的肿瘤抗体/0.15％去氧胆酸钠的缓冲液，使去氧胆酸钠的终浓度为0.05-0.09％，洗脱脂膜后水浴超声三次，每次五分钟，充分透析除去去氧胆酸钠。3抗T细胞抗体用N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(以下称SPDP)处理，用二硫苏糖醇还原引入巯基，与上述透析的脂质体混合，搅拌过夜后，经Sepharose 4B柱层析纯化，除去未包入的药物和未交联地抗体，即得双特异性免疫脂质体。终产物各成分配比(重量比)：
复方脂质 0.5-5g
抗肿瘤抗体 0.16-0.2g
抗T细胞抗体 0.032-0.04g
生物反应调节剂 500-2000万单位
药物稳定剂 0.5-1g
缓冲盐溶液 加至100ml
优选配比为：
复方脂质 1-3g
抗肿瘤抗体 0.17-0.19g
抗T细胞抗体 0.034-0.038g
生物反应调节剂 500-2000万单位
药物稳定剂 0.5-1g
缓冲盐溶液 加至100ml
本发明研制的药物廷长了生物反应调节剂的半衰期，降低了毒副作用。该药在体内具有定向靶敏释药能力，与肿瘤细胞结合后释放药物，提高了疗效。可将T细胞导向至靶细胞，并激活之，增强其抗肿瘤活性和特异性。实现了生物反应调节剂和T细胞的同步双重导向，药物在遇到并结合瘤细胞时才释放，T细胞到达瘤细胞时被激活，使整体疗效最佳。
实施例
以下代号为：DOPE-双油酸磷脂酰乙醇胺 PC-卵磷脂
DOC-去氧胆酸钠 bsILip-双特异性免疫脂质体
NHSP—N-羟基琥珀酰亚胺软脂酸酯
SPDP—N-羟基琥珀酰亚胺-3(2-吡啶二碱基)丙酸酯
IL-2—白细胞介素-21抗胃癌抗CD3双特异性自细胞介素-2免疫脂质体制备工艺
在抗人胃癌单克隆抗体MGb2(5-10mg/ml)中加入DOC，使其含量为2％，与12-15倍过量的NHSP在37℃反应10小时，用Sephadex G-75纯化得到修饰抗体，该抗体为浓度3-6mg/ml0.15％DOC缓冲液。
将复方脂质(含DOPE80％，PC16％，吡啶二硫基-DOPE4％)溶于氯仿，置圆底烧瓶中旋转蒸发抽干。加入人自细胞介素-2(80万单位/ml)和上述修饰抗体，使脂质∶肿瘤抗体＝100∶20(重量比)，DOC终浓度为0.07％。洗脱脂膜后水浴超声三次，每次五分钟，充分透析除去DOC。
抗CD3单克隆抗体OKT3(5-10mg/ml)，加入10倍过量的SPDP交联剂，在室温中保持40分钟后经Sephadex G-50纯化，此次用PH7.4磷酸缓冲盐平衡洗脱。将还原的抗体(已引入巯基)与透析后的脂质体混合，使脂质∶OKT3＝100∶6～100∶8(重量比)，搅拌过夜后经Sepharose4B层析纯化，即得双特异性免疫脂质体(bsILip)，加入0.5％-1％人血清白蛋白作为稳定剂。
作用和效果：
电镜负染色观察bsILip为大单层脂质体，直径80-150nm。同位素标记法测得抗体交联率为肿瘤抗体(NGb2)80％。抗T细胞抗体(OKT3)40-50％，IL-2包裹率75-80％。抗体的免疫活性和IL-2的生物学活性均保持良好。
体外细胞毒实验：
bsILip可显著增强LAK细胞抗胃癌作用，bsILip与LAK伍用，比单纯两种抗体和LAK共用的作用强50倍。
结合试验：
bsILip与外周血淋巴细胞共用，与人胃癌细胞SGC-7901作用，瘤细胞表面可见淋巴细胞结合，而与正常人胚肺细胞SL7作用则无结合。用同位素示踪法观察到，bsILip稳定性较好，在4℃时10天释放量少于5％。将bsILip包裹钙黄绿素进行靶敏试验(方法见郭荣军，中华医学杂志1991，71：97)，与人外周血淋巴细胞(含CD3阳性T细胞)作用30分钟，药物的释放率小于10％，而与人胃癌细胞SGC-7901作用时，药物释放达85％。表明所制备的bsILip具有定向靶敏释放能力，即在与癌细胞结合时释放药物，与T细胞结合时不释放药物。
动物实验(Wirnn氏法，J Immunotherapy 1993：14：11)，靶细胞为人胃癌细胞SGC-7901，效应细胞为人外周血单个核细胞瘤细胞浓度为1×107/ml，取0.1ml与效应细胞和药物(IL-2，剂量2万单位)混合，给SWISS DF裸鼠皮下注射，第25天解剖动物，称瘤重。
动物实验结果表明，bsILip的抗肿瘤效果最好(见表)。
双特异性免疫脂质体(bsILip)的体内抗肿瘤作用药物 IL-2 E/T 瘤重(g) 无瘤鼠/每组只数
(m±SD)生理盐水 － 0 4.80±1.40 0/6IL-2 ＋ 10∶1 4.40±1.60 0/6IL-2+T3 ＋ 10∶1 1.31±0.29 2/6MGb2-LIp-IL-2 ＋ 10∶1 1.39±0.57 3/6bsLIp ＋ 10∶1 0 6/6E/T：效应细胞/靶细胞实施例2
抗胃癌双特异性免疫脂质体导向肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子(TNF)100万单位/ml。胃癌抗体MGb2用NHSP修饰。复方脂质(DOPE82％，PC16％，吡啶二硫基-DOPE2％)。逆相蒸发法制备脂质体。抗T细胞抗体OKT3用SPDP法连接。具体步骤同实施例1。
作用和效果：
TNF包裹率33±6％(n＝3)，脂质体平均直径100nm。两种抗体的免疫活性和TNF的生物学活性均保持良好。结合试验和靶敏释放试验结果同实施例1(均系同位素和钙黄绿素代替药物)。
细胞毒试验：(MTT法，J Immunother 1993；14：11)，TNF脂质体对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率为44.2±3.6％，并显著增强人LAK细胞的抗肿瘤效应(p＜0.05)。