所属技术领域：本发明属于生物技术酶工程领域，涉及可用于食品、保健品及药品制造的一种采用固定化复合外肽酶完全水解蛋白质、或进一步降解部分水解物并脱除其水解苦味的方法。 现有技术：氨基酸及蛋白质水解物是广泛用于食品、保健品、制药及其它轻化工工业的重要产品，氨基酸可用发酵法和蛋白质完全水解法来生产。发酵法是能单独生产一种或几种氨基酸，不适于以营养为目的的多种氨基酸混合物的制造。蛋白质完全水解是生产多种氨基酸混合物的一种有效方法。目前蛋白质完全水解主要是采用酸法或碱法，即高温、高压条件下，用酸或碱催化蛋白质水解，产生游离氨基酸混合物。酸碱法的效率较高，但采用酸作为催化剂时，在水解过程中有几种氨基酸被破坏掉，不能得到蛋白质的完全水解物。采用碱作为催化剂，在水解过程中也同样有部分氨基酸被坏掉，而且还会发生消旋化，大量氨基酸丧失其生物活性。不可能得到真正的蛋白质的完全水解物，当然也不是理想的蛋白质完全水解方法。
Hill，R.L.and Schmidt，W.R.，J.Biol，Chem.237，389-395（1961）报导过用木瓜蛋白酶，并结合使用羧肽酶、亮氨酸氨肽酶及二肽酶等对蛋白质进行完全水解的方法。得到的氨基酸混合液的组成与理论值基本相同。但在这个方法中羧肽酶和氨肽酶都是以游离态形式参加反应酶无法回收，不能重复使用，成本较高，难于工业化应用。
蛋白质部分水解物在食品和制药工业中有着重要的用途，采用酶法水解制备的多肽产物往往有特征性苦味而限制了它的用途。Vmetsu，H.etal.J.Agric.Food Chem.31，50-56（1983）：Minagama，H..J.Food Sci.54.1225-1229（1989）分别报到了采用羧肽酶和氨肽酶进一步降解具有苦味的多肽，以便脱除蛋白质水解物苦味地方法。
Thibault，P.A.and Momsan，P.F.FR2625651（1988）公开了一种利用酵母细胞壁上的羧肽酶与苦味肽反应消除苦味的方法。这些方法均是利用外肽酶进一步降解含有苦味的多肽，破坏苦味多肽结构以消除蛋白质水解物的苦味。但是外肽酶，包括羧肽酶和氨肽酶的来源十分有限，价格较高，虽然有效，也无法投入工业化应用。另外由于单种外肽酶专一性的限制，完全水解和水解产物的脱苦效果往往也不十分理想。
发明目的：本发明利用固定化复合外肽酶（包括羧肽酶和氨肽酶）水解蛋白质，或进一步降解蛋白质部分水解物，制造蛋白质完全水解物并脱去其苦味。本发明的目的是利用复合外肽酶之间的协同作用，更有效地进行蛋白质完全水解并脱去其苦味。由于采用固定化酶技术，降低了使用成本，本技术可望用于工业化目的。
本发明包括如下内容及方案：
先制备一种复合外肽酶，包括羧肽酶和氨肽酶。方法可采用先提取出单个外肽酶，后按一定比例混合起来;也可直接从动物、植物及微生物材料中提取多种外肽酶的复合物。在把上述外肽酶复合物固定化在一种载体上，制成固定化复合外肽酶。可用于固定化的载体有琼脂糖凝胶、活性炭、硅胶、多孔玻璃、离子交换纤维素、离子交换树脂及其它天然大分子材料。可用于固定化的方法有吸附法、偶联法和交联法。
然后再用固定化复合外肽酶水解蛋白质或蛋白质部分水解物，结合使用内肽酶、或固定化内肽酶和二肽酶，可从多肽端释放出游离氨基酸。分离游离氨基酸，并循环用固定化复合外肽酶处理，就可完全水解蛋白质。
用固定化复合外肽酶处理有苦味的蛋白质水解物，可脱除蛋白质水解物的苦味。固定化复合外肽酶反应可采用搅拌反应器，也可采用柱床反应器。
本发明的主要优点及效果：
（1）采用复合外肽酶，由于外肽酶之间及其与内肽酶之间的协同作用，蛋白质全水解效率较高。
（2）由于采用复合外肽酶，可直接利用天然复合外肽酶源，酶的制备方法简单，酶的成本降低。
（3）采用固定化酶技术，酶可重复利用，操作成本明显降低，酶法完全水解蛋白质的工业化成为可能。
（4）固定化复合外肽酶用于蛋白质水解产物的脱苦，效果十分理想，这将扩大蛋白质水解产物在食品及制药工业中的用途。
实施例1
新鲜牛或猪胰脏1Kg，加水4-10升，捣碎后在10-25℃下让其自溶8-24小时。自溶胰汁在3000-10000转/分下离心15-45分钟。收集上清液，过滤。滤液加硫酸铵至25-70%饱和度，收集沉淀。将沉淀溶于水，透析脱盐后得复合外肽酶溶液。
虾壳几丁质50-100g，加30-50%NaOH溶液200-600毫升，在30-70℃下脱乙酰基制成20-80%脱乙酰几丁质。再向上述脱乙酰几丁质中加入0.5-2%甲醛溶液，调节pH值至4-8，0-4℃下反应8-24小时。洗涤除去未反应的甲醛，加入100-300毫升，0.5-2%复合外肽酶溶液，0-4℃下让其反应8-24小时。然后除去未反应的复合外肽酶，制得固定化复合外肽酶。
配制酪蛋白溶液（1-10%），调节pH值至6-8.5。用内肽酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、米曲霉蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶）或固定化内肽酶部分水解酪蛋白，制成酪蛋白部分水解物。也可以用上述内肽酶的混合物或固定化内肽酶混合物水解酪蛋白制备酪蛋白部分水解物。
用上述固定化复合外肽酶，在柱反应器或搅拌式反应器中进一步水解上述酪蛋白部分水解物。反应条件为pH5-8，温度30℃-60℃。可制得无苦味酪蛋白水解物，再用离子交换剂分离除去未完全水解的肽，制备出酪蛋白全水解物。
在上述无苦味酪蛋白水解物或酪蛋白全水解物基础上添加糖，无机盐和维生素配成保健品，食品或药品。
实施例2
新鲜猪或牛肾脏200g，加入1000毫升水捣碎后，在0-4℃下过滤，滤液加硫酸铵，收集30-80%饱和度之间所得的沉淀。所得沉淀溶于水，透析脱盐，得复合外肽酶溶液。
其余与实施例1相同。
实施例3
把羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y和亮氨酸氨肽酶按1∶0.5-1∶0.1-0.4∶0.4-0.8比例混合，再配成复合外肽酶溶液（0.5-2%）。
其余与实施例1相同。
实施例4
复合外肽酶溶液制备方法与实施例1、2、3相同。
部分脱乙酰几丁质制备方法同实施例1。50-100g部分脱乙酰几丁质，加入100-300毫升复合外肽酶溶液（0.5-2%），调节pH值至6-8，在0-4℃下放置8-24小时，再加入戎二醛至最后浓度为0.5-2%，在0-4℃下反应8-24小时，洗涤除去未反应的酶及戎二醛，制得固定化复合外肽酶。
其余与实施例1相同。
实施例5
用几丁质代替部分脱乙酰几丁质，不脱除几丁质上的乙酰基，直接用实施例1或实施例4的方法进行复合外肽酶的固定化，制备固定化复合外肽酶。
其余与实施例1相同。
实施例6
直接用完全脱除乙酰基后的几丁质，即甲壳素进行复合外肽酶的固定化。固定化方法与实施例1或实施例4所述方法相同，制备固定化复合外肽酶。
其余与实施例1相同。
实施例7
用蟹壳几丁质代替虾壳几丁质，余皆与实施例6相同。
实施例8
用大豆蛋白代替酪蛋白，其余与实施例1相同。