本发明涉及具有血调节活性并可用于刺激骨髓生长及治疗病毒、真菌和细菌感染性疾病的新的肽。 有多种调节信使及修饰剂如集落刺激因子、干扰素及不同类型的肽具有调节骨髓生长的作用[Metcalf，Cell，43∶5（1985）;Baserga R.，Foa P.，Metcalf D，Polli EE（eds），Biological Regulation of Cell Proliferation（1986）;Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501（1986），Zoumbos et al.，Proyr Hemat.1∶341 and 14∶201（1986）;Werner et al.，Experientia 42∶521（1986）]。20多年前，Rytomaa and Kivieniemi（Cell Tissue Kinet 1∶329-340（1968））、Rytomaa等人（Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp.106-138（1967））曾报导成熟粒细胞的提取物（粒细胞抑制素）在可特异地抑制复盖滑动培养物中的大鼠骨髓生长细胞增殖。后来他们证明这种分子量小于3，000道尔顿的因子能够诱导可移植大鼠粒细胞白血病的消退，并阻止人白血病细胞的生长。
Paukovits和其他一些研究者从大鼠骨髓细胞内提取了一种类似因子并证明它能抑制骨髓细胞对滴定的胸苷的摄入（Paukovits，W.R.，Cell Tissue Kinet 4∶539-547（1971）;Naturforsch37∶1297（1982））。1979年，Boll等人（Acta Haematologica 6∶130，1979）证明了大鼠粒细胞提取物对培养物中人骨髓细胞的抑制作用，许多其他研究者则证明该粒细胞粗提取物能在体外抑制啮齿动物骨髓细胞中之g-CFUC和/或gm-CFUC的发育。
从理论概念上说，该称为粒细胞抑制素的生物学制剂应是一种作用于分泌它的同一组织的内源性细胞增殖抑制剂。发现从粗提取物中得到的这种物质没有种特异性，但具有很高的组织特异性，而且无毒并具有可逆的活性。
1982年，有人报道了一种合成的血调节五肽可于体外和体内选择性地抑制骨髓生长细胞，且似乎主要是作用于骨髓生长干细胞（CFU-gm）（参见Paukovits et al.，Z.Naturforsch 37∶1297，1982和美国专利4，499，081号）。据信该肽是以很小量见于骨髓提取物中的天然存在的粒细胞生长抑制因子。
1987年，Laerum等人报导该肽的氧化产物是靠二硫桥键形成的二聚体（HP-5）。该二聚体具有与单体相反的作用，即在体外可强烈地刺激人和小鼠CFU-gm集落形成，并在体内可向上调节小鼠骨髓生长细胞。欧洲专利申请87309806.5中提出要求专利保护该二聚体。
据报导，该二聚体可用于刺激骨髓细胞生长活性降低者的骨髓细胞生长，包括用于治疗骨髓损伤、粒细胞缺乏及因免疫抑制治疗以抑制组织排斥反应，即骨髓移植外科引起的骨髓功能降低在内的再生障碍性贫血。该二聚体也可用于在对肿瘤和病毒性疾病进行细胞静止化学治疗和放射治疗后促进骨髓的迅速再生。对于因骨髓损伤后缺乏免疫反应而发生严重感染地病人也有特殊的治疗价值。
我们现已发现，某些对骨髓生长细胞有刺激作用的新的合成肽可用于治疗和预防病毒、真菌及细菌性疾病。
本发明包括由下列式（Ⅰ）代表的肽，这些肽具有血液调节活性，可用于刺激造血机能并预防和治疗细菌、病毒和真菌感染性疾病。
这些肽用于因手术所致的骨髓抑制、AIDS、ARDS、先天性骨髓发育不良、骨髓和器官移植等各种临床状态引起的白细胞计数降低病人，使其恢复白细胞计数;保护白细胞减少病人免于遭受感染;治疗严重烧伤病人及改善因用某些细胞生命周期特异性抗病毒剂治疗骨髓移植病人，特别是患移植物抗宿主性疾病者所引起的骨髓抑制;以及治疗结核病人及动物的不明原因性发热。该肽也可用于治疗和预防病毒、真菌及细菌性感染性疾病，特别是处于免疫抑制和“正常”状态的念珠菌、疱疹及肝炎感染者。
这些化合物也可与共同待批美国专利申请No.07/799465和美国专利No.4499081（已列为本文参考文献）中介绍的单体联合使用，以提供骨髓细胞内高或低活性峰的交替出现，从而放大造血功能的天然生理节律。这样便可在低骨髓活性期进行细胞静止治疗，以减小骨髓损伤的危险性，此时相续出现的活性峰将会促进骨髓再生。本发明还包括含有式（Ⅰ）化合物及医药上可接受之载体的药物组合物。
本发明进一步建立了一种刺激包括人在内的动物骨髓生长系统的方法，包括给需要治疗的动物使用有效量的式（Ⅰ）化合物。
本发明还建立了预防和治疗处于免疫抑制和正常状态之动物（包括人）的病毒、真菌及细菌感染的方法，包括给需要进行治疗的动物服用有效量的式（Ⅰ）化合物。
本发明的肽是由下列式（Ⅰ）代表的肽及其医药上可接受的盐：
其中：
Y1和Y2分别是CH2或S;
x是0，1，2，3或4;
m是0，1或2;
n是0，1或2;
A是2-噻吩羧酸、吡啶甲酸、环己烷羧酸、四氢-2-糠酸、四氢-3-糠酸、2-氧-4-噻唑烷羧酸、环戊烷羧酸、3-噻吩羧酸、（S）-（+）-5-氧-2-四氢呋喃羧酸、2-哌啶酸、吡咯羧酸、异吡咯羧酸、吡唑羧酸、异咪唑羧酸、三唑羧酸、二硫杂环戊二烯羧酸、氧硫杂环戊二烯羧酸、异噁唑羧酸、噁唑羧酸、噻唑羧酸、异噻唑羧酸、噁二唑羧酸、噁三唑羧酸、氧硫杂环戊二烯羧酸、噁嗪羧酸、噁噻唑羧酸、二噁唑羧酸、吡喃羧酸、嘧啶羧酸、吡啶羧酸、哒嗪羧酸、吡嗪羧酸、哌嗪羧酸、三嗪羧酸、异噁嗪羧酸、氧硫氮杂烯（oxathiazene）羧酸、吗啉羧酸、吲哚羧酸、吲哚恩（indolenene）羧酸、2-异吲哚羧酸、1，5-吡啶羧酸、吡喃并[3，4-b]吡咯羧酸、异吲哚羧酸、吲噁嗪羧酸、苯并噁唑羧酸、苯邻甲内酰胺羧酸、喹啉羧酸、异喹啉羧酸、噌啉羧酸、喹唑啉羧酸、1，5-二氮杂萘羧酸、吡啶并[3，4-b]吡啶羧酸、吡啶并[3，2-b]吡啶羧酸、吡啶并[4，3-b]吡啶羧酸、1，3，2-苯并噁嗪羧酸、1，4，2-苯并噁嗪羧酸、2，3，1-苯并噁嗪羧酸、3，1，4-苯并噁嗪羧酸、1，2-苯并异噁嗪羧酸、1，4-苯并异噁嗪羧酸、咔唑羧酸、吖啶羧酸、或嘌呤羧酸;
B是丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸;
D是赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸、b-丙氨酸、肌氨酸或二氨基己炔酸;或羧酰胺或其羟甲基衍生物;
E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或肽键;
F是酪氨酸或肽键;
或者其中：
Y1、Y2、x、m、n、C、D、F如上定义;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、或谷氨酸，而B是丝氨酸;
或其中：
Y1、Y2、x、m、n、D和F如上定义;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;而
C是丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或缬氨酸。
或者其中：
Y1、Y2、x、m、n和F如上定义;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或缬氨酸;而
D是鸟氨酸;
或者其中：
Y1、Y2、x、m和n如上定义;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或缬氨酸;
D是鸟氨酸;而
F是酪氨酸。
所有上述这些定义的条件是：
·当Y1和Y2是S时，x是2，3或4，且m和n是1;或
·当Y1和Y2是CH2时，x是0，1或2，且m和n是0;或
·当Y1是S和Y2是CH2时，x是0且n是1，或
·当Y2是S和Y1是CH2时，则x是0且m是1;
·如果当C选自于丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸时，则D便选自于丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、正亮氨酸、别苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸。
本发明还包括本发明化合物的适于药用的盐配合物。应当注意的是，式（Ⅰ）中A含末端氨基基团，同时D含有末端羧基或羧酰胺基团或其羟甲基衍生物。
本文使用本技术领域常用缩写字和符号来描述该肽：
Ala＝丙氨酸
pGlu＝焦谷氨酸
Pro＝脯氨酸
Glu＝谷氨酸
Asp＝天冬氨酸
Tyr＝酪氨酸
Pic＝吡啶甲酸
Ppc＝二哌啶酸
Ppg＝炔丙基甘氨酸
Gly＝甘氨酸
Orn＝鸟氨酸
P-（NH2）Phe＝对-氨基苯丙氨酸
Hna＝2，6-二氨基-4-己炔酸
Lys＝赖氨酸
Gln＝谷氨酰胺
Arg＝精氨酸
Cys＝半胱氨酸
Sub＝二氨基辛二酸
Pim＝二氨基庚二酸
Ser＝丝氨酸
Nle＝正亮氨酸
Adp＝二氨基己二酸
Chc＝环己烷羧酸
Tfc＝四氢-2-糠酸
Otz＝2-氧代-4-噻唑烷
Cpa＝环戊烷
Tpc＝3-噻吩羧酸
S-otf＝（S）-（+）-5-氧代-2-四氢呋喃羧酸
·R-otf＝（R）-（-）-5-氧代-2-四氢呋喃羧酸
按照常规表示法，氨基末端在左边而羧基末端在右边。所有手性氨基酸都可以是D或L绝对构型。所有旋光异构体都考虑在内。
氨基末端都经酰化作用加以保护。这些保护基的例子是叔丁氧羰基（t-Boc），CH3CO和Ar-CO（Ar＝苯甲基或苯基）。
C-末端如天然氨基酸一样可以是羧基，或可以是羧酰胺-C（O）NH2或羟甲基（-CH2-OH）衍生物。
优选化合物是其中
A为焦谷氨酸、吡啶甲酸、脯氨酸、酪氨酸或2-哌啶酸;
B为谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸或酪氨酸;
C为天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、或赖氨酸;
D为赖氨酸或其羧酰胺衍生物、精氨酸、N-甲基精氨酸、2，6-二氨基-4-己炔酸、天冬氨酸或鸟氨酸;
E为化学键;
Y1和Y2是CH2;
x是0或2;
m和n是0的化合物。
更优选以下化合物是其中
A为焦谷氨酸、脯氨酸或吡啶甲酸;
B为谷氨酸、天冬氨酸或丝氨酸;
C为天冬氨酸或谷氨酸;
D为赖氨酸或其羧酰胺衍生物;
E是化学键;
F是化学键;
Y1和Y2是CH2，且
x是0或2，
以及手性氨基酸为L绝对构型的化合物。
特别优选的是：
（Pic-Glu-Asp）2Sub（Lys）2[SEQ ID NO：1]
（L-Ppc-Glu-Asp）2Sub（Lys）2[SEQ ID NO：2]
（pGlu-Ser-Asp）2Sub（Lys）2[SEQ ID NO：3]
（pGlu-Ser-Asp）2Adp（Lys）2[SEQ ID NO：4]
（pGlu-Ser-Asp）2Adp（Lys-NH2）2[SEQ ID NO：5]
（Pic-Ser-Asp）2Adp（Lys）2or [SEQ ID NO：6]
（Pic-Ser-Asp）2Adp（Lys-NH2）2[SEQ ID NO：7]
（pGlu-Glu-Asp）2Adp（Tyr-Lys）2[SEQ ID NO：8]
（Pic-Glu-Asp）2Adp（Lys）2[SEQ ID NO：9]
（Pic-Glu-Asp）2Adp（Lys-NH2）2[SEQ ID NO：10]
本发明的肽用Merrifield的固相技术制备（J.Am.Chem.Soc.，85，2149（1964）），或可成功地采用本技术领域已知的溶液法来制备。
记载于J.M.Stewart和J.D.Young的“Solid Phase Peptide Synthesis（Pierce Chemical Company，Rockford，I L（1984））一书，或M.Bodansky，Y.A.Klauser和M.A.Ondetti的“Peptide Synthesis”（John Wiley & Sons.Inc.，New York，NY.（1976））一书中有关肽的一般合成法均可用于生产本发明的肽，这些文献列入本文作为参考文献。
每种氨基酸或肽均可按肽合成领域中已知方法适当加以保护。例如，最好用α-芴基甲氧基羰基（Fmoc）或叔丁氧基羰基（t-Boc）保护氨基，特别是α位的氨基。可用适当取代的苯酯基保护赖氨酸的ε-氨基，而苄基则可分别用于保护Asp和Glu的β和γ羧基。适当取代的苯酯基保护基团是以氯、溴、硝基或甲基于邻位和/或对位取代，用于修饰保护基团的反应活性。除了t-Boc基团外，最常用的是用弱酸处理时不会被除去的那些保护基。这些保护基可用催化加氢，液氨中的钠或HF处理这类本领域已知方法来除去。
假如采用固相合成法，则从肽的羧基末端起始，朝氨基末端方向逐步合成该肽。可通过将经保护的氨基酸的C末端共价连接到一种适当的树脂上以开始固相合成，这些树脂例如是二苯甲基胺树脂（BHA）、甲基二苯甲基胺树脂（MBHA）或氯甲基树脂（CMR），（如记载于U.S专利No.4244946中的一般树脂）或苯基酸氨基甲基树脂（PAM）。如果欲使产品肽的羧基末端为羧酰胺，则可使用BHA或MBHA载体树脂。如果欲使产品肽的羧基末端为羧基基团，则一般可采用ACMR或PAM树脂（但该类树脂也可用于产生羧酰胺或酯）。
用弱酸（即三氟醋酸）处理除去α-氨基上的保护基团。使用本技术领域中已知的适当去保护反应，中和反应及偶合反应循环连续加成氨基酸而无需分离中间产物，直至形成所需之肽为止。然后使完成的肽去封闭和/或按任何顺序从载体树脂上裂解下来。
用HF或HBr/醋酸处理载肽树脂，使肽从树脂上裂解下来，并产生以羧酸或羧酰胺的形式存在的羧基末端氨基酸。
如果要想得到一种酯，可以于三乙胺存在下用适当的醇、例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苯甲醇处理之，使肽从树脂上裂解下来并直接得到酯。
也可以从其前体羧酸以常规方法制备本发明肽的酯。一般情况下，在有酸催化剂存在下用醇处理该羧酸即可。此外，羧酸也可转化为活化的酰基中间体，如酰卤，并最好在碱存在下用醇处理之。
从载体树脂上裂解肽的优选方法是于适当的阳离子清除剂（例如苯甲醚或二甲氧基苯）存在下用无水HF处理载肽树脂。该方法同时除去所有保护基（除保护硫的硫代烷基外），并从树脂上将肽裂解下来。以该方法从CMR和Pam树脂上水解的肽是羧酸，从BHA树脂中裂解则得到羧酰胺。
以本领域一般已知方法，通过烷基化或酰化反应来完成对肽的末端氨基的修饰。可以在结合成肽以前对氨基酸进行这些修饰，或可在肽合成以后，末端氨基释放但保护基尚未除去时对肽进行这些修饰。
一般来说，使用相应烷基或芳基酸的酰卤、酐或活化酯，于叔胺存在下，在游离氨基上完成酰化反应。在弱还原剂（如氰基氢硼化锂或钠）存在下，采用适当的脂族醛或酮，通过氨基的还原烷基化反应最方便地进行单烷基化反应。而二烷基化反应则可于碱存在下，使用过量烷基卤处理氨基来完成。
溶液法合成肽采用对酰胺键常用的方法进行。一般是采用适当的偶合剂，例如N，N-二环己基碳二亚胺（DCC），并可于存在1-羟基苯并三唑（HOBT）或二甲基氨基吡啶（DMAP）这类催化剂的情况下，将带有游离羧基的被保护的t-Boc氨基酸偶联到带有游离氨基的被保护的氨基酸上。其它方法，例如活化酯、酐或酰卤的形成，被保护的t-Boc氨基酸的游离羧基的形成，以及在有或没有碱存在下，与被保护之氨基酸的游离氨基反应也是适用的。例如，在无水溶剂（如二氯甲烷或四氢呋喃（THF））中，在碱（如N-甲基吗啉、DMAP（二甲基氨基吡啶）或三烷基胺）存在下，用氯代甲酸异丁酯处理被保护的Boc-氨基酸或肽以形成“活化的酐”，随后再将其与另一个经保护的氨基酸或肽的游离胺反应。按此方法形成的肽，可使用常规技术选择性地除去氨基或羧基末端保护基，并采用相似方法再偶联到其他肽或氨基酸上。肽合成完毕后，使用前面介绍的方法除去保护基，例如在钯或铂催化剂存在下氢化，于液氨、氢氟酸或碱中用钠处理之。
去保护以后，假如最终的肽含有一个碱基团，则可制备酸加成盐。肽的酸加成盐按标准方式，在适当溶剂中，从其母体化合物和稍微过量的酸（如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、醋酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸）制备。醋酸盐形式是特别有用的。如果最终的肽含有酸性基团，则可制备阳离子盐。一般可用稍过量的碱试剂例如含适当阳离子的氢氧化物，碳酸盐或醇盐处理母体化合物。诸如Na+、K+、Ca++和NH+4这类阳离子即是适于药用之盐的典型阳离子。特别优选的是Na+和NH+4。
总的来说，为了发挥刺激效果，本发明的肽可以以0.5ng-1mg（优选5-500ng）的剂量给病人注射或以50ng-5mg（例如每天每70Kg体重0.01mg-1mg）的剂量给病人口服;假如采用输注或类似技术给药，其剂量为每70Kg体重0.005ng-1mg，例如六天期间大约0.03ng，其原则是期望病人细胞外液中肽的浓度为10-15M-10-5M左右。
根据本发明的另一特征，本发明提供了含前面定义的式（Ⅰ）的一种或多种化合物，或者其生理学上相容的盐作为活性成份并与药用载体或赋形剂相结合的药物组合物。本发明的组合物可配成适于口服、滴鼻、非肠道或直肠给药的剂型。
本文所使用的术语“药用的”也包括本发明作为兽药的应用。这些肽可以制成胶囊、片剂或配成乳剂或糖浆供口服。加入适于药用的固体或液体载体以提高组合物的稳定性或有利于组合物制备。液态载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体也包括诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯这类缓释物质，可单加或其与石腊一起添加。固体载体的量可以有所变化，但较好每剂量单位约含20mg-1g。该药物制剂可按照制药常规技术制得、包括经碾磨、混合、成粒和压片等步骤制成片剂;或经碾磨、混合及填充等工艺制成硬胶囊。可制成含一种或几种活性成份的胶囊，例如将活性成份与惰性载体（例如乳糖或山梨醇）混合、将混合物填入明胶胶囊内。当使用液体载体时，可将制剂配成糖浆、酏剂、乳剂或水或非水悬浮剂。这类液体制剂可直接口服或填入软胶囊中口服。也可以使用器官特异性载体系统。
本发明肽或其衍生物的其他药物组合物可以配制成冻干粉的溶液经胃肠道外途径给药。可以在使用前加入适当的稀释剂或其它可药用的载体来再加工粉末。液体制剂一般是缓冲的、等渗的水溶液。适当稀释剂的典型例子是普通等渗盐水、溶于水中的标准5%葡萄糖或缓冲乙酸钠或乙酸铵溶液。这类制剂特别适于非胃肠道给药，但也可口服使用及装入计数剂量的吸入器或喷雾器中供吸入用。加入诸如聚乙烯吡咯啉酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠或柠檬酸钠这类赋形剂也是适宜的。
为直肠给药，可将磨碎的本发明肽粉末与诸如可可脂、甘油、明胶或聚乙二醇这类赋形剂相结合制成栓剂。磨碎的粉末也可以与油制剂、胶、乳霜或乳剂混合，经缓冲或不经缓冲并通过透皮膏给药。
可以用相似方法在水溶液中配制鼻喷雾剂，并装入带有气雾推进器或配有供手动压出配件的喷注容器中。
含本发明化合物的剂量单位最好含有0.1-100mg，例如含1-50mg式（Ⅰ）的肽或其盐。
根据本发明的再一个特征，本发明提供了一种抑制骨髓组织生长的方法，该方法包括给病人使用前面定义的有效量的药物组合物。
当根据本发明使用本发明化合物时，不会产生不可接受的毒性作用。
通过下面的试验来证明式（Ⅰ）化合物的生物活性。
通过基质（Stromal）细胞诱导集落刺激活性
使人骨髓基质细胞系C6在塑料组织培养皿中，于RPMI-1640培养基和5%FBS中生长至融合。试验前一天，将该培养基换成不加血清的DMEM。将化合物以一个小时的时间加到这些培养物中，然后从培养物中洗出。用新鲜DMEM代替培养基并于5%CO2，37℃下将细胞保温24小时。24小时后收集C6细胞培养物上清液、无菌过滤、并冷冻直至可以按下述方法检测造血集落刺激活性（CSA）的存在。
软琼脂试验
取路易士小鼠的骨髓细胞。在无血清DMEM中将其调到106个细胞/ml。所用的单层琼脂系统是：富集营养素（NaHCO3，丙酮酸盐，氨基酸，维生素和HEPES缓冲剂）的DMEM;0.3Bacto琼脂和20%Lewis大鼠血清。向该培养基中加入大鼠骨髓细胞（最终浓度为105个细胞/毫升）及C6细胞系上层清液的稀释液（10-2.5%）。该琼脂板在37℃，5%CO2下保温7到8天。用显微镜计数增殖的骨髓细胞（CFU-C）集落。计数出的琼脂集落数与在C6骨髓基质细胞系上清液内存在之CSA的量成比例的。
单纯疱疹小鼠模型
感染前7天，给Balb/c小鼠每天一次腹腔内注射0.2ml剂量为10和1ng/Kg的化合物。对照组小鼠则注射0.1ml的稀释缓冲液，DPBS和0.5%热失活的正常小鼠血清的混合物。
通过在小鼠每只后足掌中注入悬浮于0.05ml PBS内的5.0×105pfu病毒用单纯疱疹病毒（MS株）感染小鼠。直到濒死之前（不给食物或水）连续给小鼠注射化合物或对照注射液。通常在大约感染8天后出现后肢麻痹。瘫痪过程一直进行到了发生脑炎为止。
另一种方法是通过阴道途径接种病毒。把含有5.0×105/pfu MS-NAP病毒株的棉塞插入小鼠阴道内。
使用Wilcoxin实验来测定是否被治疗小鼠比对照组小鼠的存活率有显著增加。
抗念珠菌攻击
使用白色念珠菌B311a菌株。该菌株已在小鼠体内传代，然后在-70℃下冷冻。B311a对免疫抑制小鼠在5.0到8.0×104cfu/小鼠范围内和正常小鼠在1.0到2.0×105cfu/小鼠范围内有毒力。使白色念珠菌冷冻材料中的样品生长于Sabouroud葡萄糖斜面上，然后转移到50ml振荡的Sabouroud肉汤培养液中培养18小时。将细胞洗三次，然后用血细胞计数器计数，并用亚甲兰染料排除法证实其存活性。对接种物进行存活率计数以证实这一计数。
通过静脉注射悬浮于0.2ml盐水中的细胞用念珠菌感染所有小鼠（Balb/c），经用300拉德射线照射使一些小鼠发生亚致死性骨髓抑制。照射开始后2小时，每天给动物注射CSF化合物（作阳性对照）或赋形剂。照射后7天开始治疗，通过静脉给药用白色念珠菌攻击小鼠。这差不多代表了正常小鼠的LD75。在其他研究中小鼠没有受到免疫抑制。在这些研究中，小鼠以与被照射小鼠相同方法感染后7天开始治疗。在这两种模型中均观察小鼠直到濒死期为止，并用Wilcoxin实验比较存活率的变化。
下列实施例用来详细说明本发明。这些实施例并不是限定本发明的范围，而是举例说明如何制备和使用本发明的化合物。
在这些实施例中，所有的温度均为摄氏度。在Dionex Autoion100上进行氨基酸分析。肽含量分析是以氨基酸分析为基础的。在VG ZAB质谱仪上用快原子轰击FAB质谱分析。所使用的缩写字如下：
Arg＝精氨酸
Asp＝天冬氨酸
t-BOC＝叔丁氧基羰基
Bz＝苄基
Cl-Z＝对位氯苄氧羰基碳酰（Z＝苄氧羰基碳酰）
DCC＝二环己基碳化二亚胺
DIEA＝二异丙基乙胺
EDC＝（N-乙基-N′-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺
Glu＝谷氨酸
p-Glu＝焦谷氨酸
Tyr＝酪氨酸
Hna＝二氨基己炔酸
HOBT＝羟基苯并三唑
Lys＝赖氨酸
NMP＝N-甲基-2-吡咯烷酮
Pro＝脯氨酸
Gln＝谷氨酰胺
Cys＝胱氨酸
N-MeArg＝N-甲基精氨酸
Prc＝双Boc-S，S′-1，3-丙二基胱氨酸
Etc＝双Boc-S，S′-1，2-乙二基胱氨酸
Buc＝双Boc-S，S′-1，4-丁二基胱氨酸
Chc＝环己烷羧酸
Tfc＝四氢-2-糠酸
Otz＝2-氧代-4-噻唑烷
Cpa＝环戊烷
Tpc＝3-噻吩羧酸
S-Otf＝（S）-（+）-5-氧代-2-四氢呋喃羧酸
R-Otf＝（R）-（-）-5-氧代-2-四氢呋喃羧酸
Ppc＝2-哌啶酸
Ser＝丝氨酸
Nle＝正亮氨酸
实施例1
（Pic-Glu-Asp）2-Sub-（Lys）2[SEQ ID NO∶1]
a.Boc-Lys（Cl-Z）-树脂的合成
将Boc-Lys（Cl-Z）[16.6g，40mmol]溶解于150毫升含10%水的甲醇溶液中。用40ml 1M CsCO3溶液中和该溶液。用旋转蒸发器浓缩中和过的溶液。用DMF稀释所得到的铯盐并用旋转蒸发器除去DMF。将该步骤重复两次以上。将该盐在真空中干燥4小时。
用120ml DMF稀释Boc-Lys（Cl-Z）的铯盐。向其中加入20g氯甲基树脂（1meq/g）。在40℃下把反应混合物旋动48小时。
将树脂冷却到室温并用熔结漏斗过滤之，然后按下列次序依次洗涤：500ml DMF;500ml DMF∶H2O（1∶1）;500ml DMF;500ml MeOH和1000ml CH2Cl2。把树脂在真空中干燥。回收所要的Boc-Lys（Cl-Z）树脂23.9g。
对所得树脂进行氨基酸分析。以氮（N）和氯（Cl）的测定结果为基础，计算出树脂上的取代为0.493meq/g。
b.Boc-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂的合成
把23g（11.339mmol）的Boc-Lys（Cl-Z）-树脂转移到反应容器内并悬浮于CH2Cl2中。
用40ml在CH2Cl2中的50% TEA洗涤树脂5分钟，再用另外40ml50%TFA洗涤30分钟以除去Boc-Lys（Cl-Z）树脂的Boc保护。然后再用40ml CH2Cl2洗3次。
所得TFA盐用40ml溶于CH2Cl2中的10%DIEA处理（1分钟）两次，用40ml CH2Cl2洗涤一次并用40ml在CH2Cl2中的10%DIEA洗涤一次以上。用CH2Cl2（6×40ml）彻底洗涤该树脂。
为使N，N′-双-Boc二氨基辛二酸（Boc-Sub-OH）与NH2-Lys（Cl-Z）-树脂偶联，将树脂悬浮于加在手动振摇容器内的100ml二氯甲烷（CH2Cl2）中。在另一个50ml烧瓶中，将2.29g（5.66mmol）（Boc-Sub-OH）和HOBt（1.53g，11.34mmol）溶于5ml N-甲基吡咯烷酮（NMP）和20mlCH2Cl2中。用冰浴将溶液冷却到0℃。在所得溶液中加入DCC（2.34g，11.34mmol）并在0℃下将反应混和物搅拌15分钟。滤去所得到的二环己脲沉淀物，把预形成的活性酯加到NH2-Lys（2-Cl-Z）-树脂悬浮液中。用Kaiser试验（茚三酮）监测反应。96小时后，用CH2Cl2（3×40ml）、（3×40ml）和CH2Cl2（6×40ml）洗此二肽键-树脂。处理后茚三酮试验得到一种与阴性对照差不多的浅蓝色溶液。然后用溶在CH2Cl2中的10%乙酐将树脂洗一次（10分钟），最后再用CH2Cl2（6×40ml）洗涤。
c.[Boc-Asp（OBz）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂的合成
重复TFA去保护和中和步骤以制备与Boc-Asp（OBz）偶联的双肽键-树脂。为偶联该氨基酸，使用3.67g（11.339mmol）Boc-Asp（OBz），2.34g（11.339mmol）和1.53gHOBt。阴性茚三酮试验指示24小时后完成了偶联。该三肽-树脂也被用来制取在2（B）位上有不同氨基酸的其他肽。
d.[Boc-Glu（OBz）-Asp（OBz）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂的合成
将5g（2.465mmol）三肽-树脂转移到一个较小的反应容器中。如上面所描述的，重复TFA去保护步骤和DIEA中和步骤。为了偶联，使用Boc-Glu（OBzl）[3.66g，10.846mmol]，HOBt[1.47g，10.846mmol]和DCC[2.23g，10.846mmol]。偶联24小时后，反应完成并回收到5.4g[Boc-Glu（OBzl）-Asp（OBzl）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂。偶联是在60ml DMF/CH2Cl2中进行的。用该四肽制取本发明化合物之1（A）位上有不同氨基酸的其他肽。
e.（Pic-Glu-Asp）2-Sub-（Lys）2[SEQ ID NO∶1]的合成
从[Boc-Glu（OBzl）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂中除去Boc基团，使用146mg（1.0846mmol）HOBt和223mg（1.0846mmol）DCC在DMF中偶联132.8mg吡啶甲酸。
使肽去保护，并用液体HF/甲氧基苯（10ml HF和0.35ml甲氧基苯）在0℃下处理1小时从树脂上裂开之。在真空下除去HF，用乙醚洗涤肽/树脂混和物，并用0.1%TFA/水溶液提取之。冻干该溶液。裂解350mg肽-树脂后产生110mg粗肽。在C-18VYDAC制备柱上纯化粗肽（50mg），并使用乙腈/水TFA缓冲系统洗脱后得到8毫克纯肽。FAB MS：（M+H1159.3）氨基酸分析：Asp1.9（2），Glu2.2（2）和Lys（2）
（未分析Pic和Sub）
HPLC纯度＞95%
实施例2
（pGlu-Ser-Asp）2-Sub-（Lys）2[SEQ ID NO∶3]
按实施例18中描述的方法合成[Boc-Asp（OBzl）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂。从[Boc-Asp（OBzl）]2-Sub-[Lys（Cl-Z）]2-树脂（0.5克）上裂开掉Boc基团。用146mg（1.0846mmol）HOBt和223mg（1.0846mmol）DCC在DMF/CH2Cl2中偶联318.96mg Boc-Ser（OBz）-OH（1.08mM）和139.45mg pGlu（1.08mM）。使肽去保护并用液态HF/甲氧基苯（10ml HF和0.35ml甲氧基苯）在0℃下处理1小时从树脂上裂开之。在真空下除去HF，用乙醚洗涤肽/树脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取之。冷冻干燥该溶液。裂解350mg肽-树脂产生125mg粗肽。在C-18VYDAC制备柱上纯化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA缓冲系统洗脱之。获得11毫克纯肽。
FAB MS：（M+H 1087.4）
氨基酸分析：Asp2.01（2），Ser1.50（2），Glu2.6（2）和Lys2（2）
（没有分析Sub，且因水解期间分解致使Ser值不正确）HPLC纯度＞95%
实施例3
（Pic-Ser-Asp）2-Adp-（Lys）2[SEQ ID NO∶6]
按实施例18（a）所述方法合成该肽的Boc-Lys（Cl-Z）-树脂。除N，N′-双-Boc·二氨基辛二酸（Boc-Sub-OH）用N，N′二-Boc二氨基己二酸（Boc-Adp-OH）取代外，使用如实施例18（b）和18（c）中所述的合成[Boc-Asp（OBz）]2-Adp-[Lys（Cl-Z）]2-树脂的相同方法。使用0.5克[Boc-Asp（OBz）]2-Adp-[Lys（Cl-Z）]2-树脂合成（Pic-Ser-Asp）2-Adp-（Lys）2[SEQ ID NO∶6]。用Boc-Ser（Bz）-OH和吡啶甲酸重复去保护，中和及偶联循环。偶联中使用1.8mM氨基酸，DCC和HOBt。偶联在10mlDMF/CH2Cl2中进行。裂解400mg肽-树脂，得到113mg粗肽，在C-18Vydac 制备柱上纯化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA缓冲系统洗脱，得到13毫克纯肽。
FAB MS：（M+H1047.4）
氨基酸分析：Asp2.00（2），Ser1.62（2），Lys1.81（2）（Pic和Adp没有分析）
HPLC纯度＞95%
实施例4
（Pic-Ser-Asp）2-Adp-（Lys-CONH2）2[SEQ ID NO∶11]
把5克Boc-Lys（Cl-Z）-BHA树脂（2.15mM，取代值＝0.43meq/g，Applied Biosystem Inc.）装入振荡器内并进行标准去保护和中和循环。使用974mg（4.3mM）DCC和638mg（4.3mM）HOBt偶联N，N′-二Boc-二氨基己二酸（Boc-Adp-OH/404mg，1.075mM）。偶联在N-甲基-吡咯烷酮（NMP）和二氯甲烷中进行。72小时后用在CH2Cl2中的10%乙酐封住未反应的氨基。去保护和中和之后，使用DCC1.95g（9.46mM），HOBt 1.28g（9.46mM）在DMF/CH2Cl2使Boc-Asp（OBz）-OH3.1g（9.46mM）与树脂偶联。经过下一次去保护和中和循环后，用二氯甲烷洗树脂并干燥之。将0.5g该三肽树脂装入一个较小的手动振摇容器内，按实施例18中所描述的方法使其他两种残基（Boc-Ser（OBz）-OH和Pic）与树脂相偶联。用10mlHF和0.35ml苯甲醚裂解350mg肽树脂。用乙醚洗肽/树脂混和物并在0.1%TFA/水溶液中提取肽。冷冻干燥提取液得到大约120mg的粗肽。在C-18Vydac制备柱上使用TFA/乙腈/水缓冲液梯度洗脱纯化50毫克粗肽。
ES MS：（M+H1045.4）
氨基酸分析：Asp2.00（2），Ser1.67（2），Lys1.74（2）。
HPLC纯度＞95%
实施例5
（pGlu-Glu-Asp）2-Adp-（Tyr-Lys）2∶[SEQ ID NO∶8]
将1克（0.64mM）Boy-Lys（Cl-Z）-树脂装入一手动振荡容器内。经去保护和中和循环之后，用DCC2.01g（10mM）和HOBt1.53g（10mM）将树脂与Boc-Tyr（Br-Z）-OH 4.9g（10mM）偶联。偶联反应在DMF/CH2Cl2中进行。用Kaiser′s试验监测偶联完成情况。除去Boc基团并中和后，使用DCC128.4mg（0.64mM）和HOBt98mg（0.64mM）在20ml DMF/CH2Cl2中偶联N，N′-二-Boc-二氨基己二酸127.4mg（0.33mM）。用Kaiser′s试验监测偶联反应。72小时后（反应还没有完成）加入另外1毫摩尔DCC（201mg）和HOBt（153mg）。再过72小时之后，用加在二氯甲烷中的10%乙酐封住在未反应的氨基基团上。用标准的去保护、中和和偶联循环偶联其余的氨基酸。使用10毫摩尔各氨基酸，DCC和HOBt。偶联是在DMF/CH2Cl2中进行的。用30ml HF和1ml苯甲醚裂解整个肽树脂。用乙醚洗肽/树脂混和物并用0.1%TFA/水提取肽。冷冰干燥该提取液。在C-18制备柱上用TFA/乙腈/水缓冲梯度系统纯化350mg粗肽。得到112mg纯肽。
ES MS：（M+H1470.8）
氨基酸分析：Asp 2.27（2），Glu4.17（4），Tyr1.74（2）和Lys2（2）（没有分析Adp，Tyr的值，因水解期间分解测定不准确）
HPLC纯度＞95%
实施例6
（pGlu-Glu-Lys）2-Sub-（Asp）2∶[SEQ ID NO∶12]
将1克Boc-Asp（OcHex＊）PAM树脂（Bachem CA.，0.5mM/g）装入手动力振荡的容器内。在去保护和中和循环后，用实施例18中所描述的方法将N，N′-二-Boc-二氨基辛二酸偶联到树脂上。用标准的去保护、中和和偶联方法偶联其余的三个氨基酸（Boc-Lys（Cl-Z）-OH，Boc-Glu（OBz）-OH和pGlu）。使用了3毫摩尔氨基酸，DCC和HOBt。偶联是在DMF/CH2Cl2中进行的。用10ml HF和1.0ml苯甲醚裂解肽树脂。用乙醚洗肽/树脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取肽。冷冻干燥该提取液得到大约4789mg粗肽。在C-18Vydac制备柱上使用TFA/乙腈/水缓冲梯度洗脱纯化60mg粗肽。获得19mg纯肽。
＊环己基
ES MS：（M+H1171.4）
氨基酸分析：Asp1.98（2），Glu4.56（2），和Lys2（2）（没有分析Sub）
HPLC纯度＞95%
实施例7-8
按上面给出的方法制备下列化合物：
（Pic-Glu-Asp）2-Adp（Lys）2[SEQ ID NO∶9]
（Pic-Glu-Asp）2-Adp（Lys-NH2）2[SEQ ID NO∶10]
实施例9
（Pic-Ser-Ala）2-Sub（Nle-NH2）2[SEQ ID NO∶13]
将Boc-Nle.DCHA（1.24g，3.0mM），HOBt（0.46g，3.0mM）和PyBOP（1.56g，3.0mM）一起溶于10ml DMF中。加入DIEA（0.77ml，4.5mM）并搅拌混和物10分钟。然后将活化的氨基酸装入手动振荡容器内，该容器中含有在5ml DMF中溶胀的1.61g（1.0mM）对位甲基二苯甲基胺树脂。树脂已预先用加在DMF中的5%DIEA（2×）处理过并用DMF（3×）洗过。将反应容器振荡1小时30分钟Kaiser试验结果为阴性。用DMF（2×），iPrOH/DCM（1/1）（2×）和DCM（2×）洗树脂，用33%TFA的DCM溶液除去Boc基团。用5%DIEA的DMF溶液中和后，在DMF/DCM（1/4）中用0.5mM（76.6mg）HOBt和0.5mM（78.6μl）DICC使0.25mM（101.0mg）的Boc-Sub与0.5mM Nle-树脂偶联。48小时后Kaiser试验稍显阳性;把另外的HOBt和DICC（各0.25mM）加入树脂中。72小时后定量Kaiser试验表明偶联得率为93%。用20%乙酐和在DMF中的5%DIEA溶液封住未反应的氨基基团。重复前述去保护、中和和偶联循环以偶联Boc-Ala，Boc-Ser（OBz）和Pic。其中使用加在10ml DMF中的1.5mM氨基酸、PyBOP和HOBt。在加入2.25mM DIEA后将氨基酸预活化10分钟，然后将此混合物加入树脂中。用Kaiser试验监测偶联完成情况，如果实验结果是阳性，即重复偶联步骤。使0.5g所得树脂肽（总共获得1.34g）去保护，并用1.0ml苯甲醚和10ml HF在-5℃下裂解1小时。蒸发掉HF，用乙醚洗肽树脂混合物。用0.5%TFA水溶液，然后用冰醋酸提取肽。冷冻干燥后，得到57.7mg粗肽。用乙腈-水（0.1%TFA缓冲系统）在C-18Vydac制备柱上纯化粗肽（22.6mg）。得到3.5mg纯肽。氨基酸分析和FAB-MS进一步证实其结构。
氨基酸分析：Ser（2），Ala（2），Sub（1），Nle（2）。
实施例10-11
按上面给出的方法合成下列化合物：
（Pic-Ser-Ser）2-Sub（Gln-NH2）2[SEQ ID NO∶14]
（Pic-Ser-Phe）2-Sub（Phe-NH2）2[SEQ ID NO∶15]
实施例12
可按不同剂型并加入多种不同的赋形剂制备掺入了本发明化合物的药用配制剂。下面给出这类配方的例子：
片剂/每片成分
1.活性成分（式Ⅰ的化合物） 0.5mg
2.玉米淀粉 20mg
3.藻酸 20mg
4.藻酸钠 20mg
5.硬脂酸镁 1.3mg
片剂制备方法：
步骤1：在一个适当的混和器/搅拌器中混和成分No.1，No.2，No.3和No.4。
步骤2：分批添加足量水到步骤1中的掺合物中，每次加入后都仔细混和之。加水并混和直到团块的稠度可以转化为湿颗粒为止。
步骤3：使湿团块通过一个No.8筛目（2.38mm）筛的摇摆式造粒机使之成为颗粒。
步骤4：然后在干燥箱内于140°F（60℃）下烘干湿颗粒，直到干燥为止。
步骤5：用成分No.5润滑干颗粒。
步骤6：用一台合适的压片机榨压润滑过的颗粒。
胃肠道外给药的制剂：
制备胃肠道外给药的药物组合物，即将适量的式Ⅰ化合物加热溶入聚乙二醇中。然后用注射用水Ph Eur.稀释该溶液（至100ml）。再通过0.22微米膜滤器过滤除菌并在无菌容器中密封之。