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双歧杆菌在含中药培养基中进行有氧发酵的方法
    本说明涉及乳酸菌的培养方法，特别是双歧杆菌的培养方法。

    人体肠道内存在的有益菌群如双歧杆菌、类链球菌、乳杆菌等能调节人体微生态平衡，降解细菌毒素及人体代谢废物。人体菌群生态失调，能引起多种疾病发生，因此国内外均应用乳酸菌制品作为保健品或药品，用于治疗胃肠疾病、心脑血管疾病、增强免疫力及抗肿瘤。乳酸菌制品中又以双歧杆菌活菌制品以及双歧杆菌与其它乳酸菌，如类链球菌、乳杆菌等复合多菌株活菌制品效果最佳。

    目前双歧杆菌的培养都需在厌氧条件下，因此发酵时要充入二氧化碳和氮气，而且培养基中要加入牛心浸液，鲜牛奶等，工业生产投资成本较高。同时由于双歧杆菌的培养条件，包括培养基，与其它乳酸菌，如类链球菌，乳杆菌等，的培养条件差异很大，因此不能在同发酵罐中同时培养双歧杆菌和其它乳酸菌，对生产复合多菌株活菌制品带来困难。

    本发明的目的在于提供一种双歧杆菌成本较低，能有氧发酵培养的方法，并使双歧杆菌能与其它乳酸菌同罐共生培养。

    本发明的方法如下。

    首先驯化双歧杆菌：将从BS或GAM培养基中培养出的双歧杆菌转接种到由一般乳酸菌培养基之营养成份，如豆芽汁、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、奶粉等与枸杞子、薏苡仁，丹参、黄芪四种中药中的任意一种或一种以上的水煮提取液组成的中药培养基中，通入CO₂和N₂进行厌氧培养，然后将所得到的双歧杆菌菌种再回接到BS或GAM培养基中进行厌氧培养，双歧杆菌如此在两种培养基中交替反复培养不少于30代后，在上述方法配制的中药培养基中进行有氧培养，将所得菌种再在中药培养基中进行厌氧培养，双歧杆菌如此有氧培养与厌氧培养交替进行不少于100代的筛选后，便得到优良的驯化的微需氧的双歧杆菌菌种。

    中药培养基可以如下配制：取100份(重量)水加入枸杞子、薏苡仁、丹参、黄芪四种中药之一种或几种，每种中药加入0.5-10份，煮沸10-15分钟后，过滤，加入豆芽汁、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、奶粉等一般乳酸菌培养基之营养成份，搅拌均匀，经高压灭菌后即得到中药培养基。

    将驯化后的双歧杆菌接种到上述地由一般乳酸菌培养基之营养成份与枸杞子、薏苡仁、丹参、黄芪四种中药中的一种或一种以上的水煮提取液配制成的中药培养基中，进行有氧发酵培养。

    将驯化后的双歧杆菌也可以接种到由一般乳酸菌培养基之营养成份与枸杞子、薏苡仁、丹参、黄芪四种中药中的一种或几种再加入酸枣仁或甘草，或同时加入酸枣仁和甘草的水煮提取液配制成的中药培养基中，进行有氧发酵培养。

    双歧杆菌有氧发酵培养所采用的中药培养基与驯化双歧杆菌的中药培养基的配制方法相同。

    为了方便地制取双歧杆菌与其它乳酸菌，如类链球菌、乳杆菌等复合多菌株活菌制品，可以将双歧杆菌和其它乳酸菌同时接种到中药培养基中，同时进行有氧发酵培养。在中药培养基中也可加入酸酸枣仁或/和甘草。

    采用本发明的双歧杆菌有氧发酵培养方法，可以改变双歧杆菌过去的厌氧发酵为有氧发酵，菌株生长正常，从而减少了工业生产的投资，降低了生产成本，特别是采用6种中药水煮提取液配制的中药培养基进行双歧杆菌有氧发酵培养，双歧杆菌的生长比较稳定与采用BS或GAM培养基基本一致，若进行双歧杆菌与基它乳酸菌同罐共生有氧发酵培养，则双歧杆菌与其它乳酸菌如类链球菌、乳杆菌等都能生长良好，克服了双歧杆菌不能与其它乳酸菌同罐发酵培养的困难，简化了制取复合多菌株活菌制品的工艺。用本发明制取的双歧杆菌制品同样具有明显抑制肿瘤生长和预防性抗肿瘤效果等双歧杆菌的药效作用。

    以下是实施例。

    实施例1.双歧杆菌的驯化：取100份(重量)水，加入2份薏苡仁，6份枸杞子，2份黄芪，2份丹参，煮沸10分钟后，过滤，得中药水煮提取液。取100份(重量)中药煮提取液加入10份豆芽汁，0.5份蛋白胨，0.5份酵母膏，2份葡萄糖，0.2份牛奶粉，搅拌均匀，高压来菌后，得到中药培养基。

    从BS培养基中将两歧双歧杆菌转接到上述中药培养基中，在37-38℃进行厌氧培养16小时，然后将得的双歧杆菌回接到BS培养基中进行厌氧培氧16小时。双歧杆菌如此在两种培养基中交替反复进行厌氧培养30代后，将所得双歧杆菌在上述的中药培养基中在37-38℃进行有氧培养16小时随后，将有氧培养的双歧杆菌再在上述中药培养基中进行厌氧培养16小时。双歧杆菌如此经有氧培养与厌氧培养交替进行100代筛选后，得到优良的驯化的双歧杆菌菌种。

    实施例2，取100份(重量)水，加入5份薏苡仁，煮沸10分钟后过滤，得中药水煮提取液，取100份(重量)此中药水煮提取液加入10份豆芽汁，0.5份蛋白胨，0.5份酵母膏，2份葡萄糖，0.2份牛奶粉，搅拌均匀，高压来菌后得到中药培养基。

    取此中药培养基100份(体积)接种驯化后的双歧杆菌5份(体积)(含菌量10⁷-10⁸个/ml)在37-38℃进行有氧发酵培养12小时，所得发酵液每毫升中含双歧杆菌10⁷—10⁸个。

    分别用枸杞子、丹参、黄芪代替薏苡仁做上述实验，所得发酵液中双歧杆菌的含量分别为：枸杞子：≥10⁸个/ml；丹参：≥10⁸个/ml；黄芪：10⁷-10⁸个/ml。

    实施例3.取100份(重量)水，加入6份枸杞子，5份薏苡仁，5份枸杞子，5份丹参煮沸10分钟后过滤，得中药水煮提取液。取100份(重量)此中药水煮提取液加入10份豆芽汁，0.5份蛋白胨，0.5份酵母膏，2份葡萄糖，0.2份牛奶粉，搅拌均匀，高压灭菌后，得到中药培养基。

    取此中药培养基100份(体积)接种驯化后的双歧杆菌5份(体积)(含菌量：10⁸个/ml)在37-38℃进行有氧发酵培养12小时，所得发酵液中含双歧杆菌数≥10⁸个/ml。

    实施例4，取100份(重量)水，加5份薏苡仁，2份枸杞子，2份黄芪，2份丹参，2份甘草，2份酸枣仁，煮沸10分钟后，过滤，得中药水煮提取液。取100份(重量)中药水煮提取液加入10份豆芽汁，0.5份蛋白胨，0.5份酵母膏，2份葡萄糖，0.2份牛奶粉，搅拌均匀，高压灭菌后得到中药培养基。

    取此中药培养基100份(体积)接种驯化后的双歧杆菌1份(体积)，保加利亚乳杆菌0.5份(体积)类链球菌0.1份(体积)，(含菌量均为≥10⁷个/ml)在37-38℃有氧发酵培养16小时，得到含多菌株的发酵液。发酵液中含总菌数≥10⁸个/ml，其中双歧杆菌占60-80％，类链球菌和乳杆菌各占10-20％。制成口服液有较好的口感。保健功效动物试验表明：该产品中双歧杆菌具有生物拮抗与抗肿瘤功能，该产品具有抗疲、抗衰老、增强机体免疫功能，同时该产品还可调节动物体内肠道微生态平衡，治疗多种肠道胃道病，对放疗、化疗引起免疫功能下降也有显著疗效。