用于控制出血和药物递送的纳米粒子.pdf

提供一种温度稳定的纳米粒子，其包含芯、水溶性聚合物和肽，所述水溶性聚合物在所述水溶性聚合物的第一末端连接于所述芯，所述肽连接于所述水溶性聚合物的第二末端，所述肽包含RGD氨基酸序列，所述水溶性聚合物具有足以允许所述肽结合于糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的长度。一方面，所述纳米粒子的熔化温度超过35℃。在多个方面，所述纳米粒子具有球体形状并且直径小于1微米。

1.  一种温度稳定的纳米粒子，其包含芯、水溶性聚合物和肽，所述水溶性聚合物在所述水溶性聚合物的第一末端连接于所述芯，所述肽连接于所述水溶性聚合物的第二末端，所述肽包含RGD氨基酸序列，所述水溶性聚合物具有足以允许所述肽结合于糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的长度。

2.  如权利要求1所述的纳米粒子，其熔化温度超过35℃。

3.  如权利要求1或者2所述的纳米粒子，其具有球体形状并且直径小于1微米。

4.  如权利要求3所述的纳米粒子，其直径介于0.1微米与1微米之间。

5.  如权利要求1或者2所述的纳米粒子，其为非球体。

6.  如权利要求5所述的纳米粒子，其为杆状、纤维状或者须状。

7.  如权利要求6所述的纳米粒子，其纵横长宽比为至少3。

8.  如权利要求1-7中任一项所述的纳米粒子，其在室温下保持稳定至少14天。

9.  多个纳米粒子，每个纳米粒子如权利要求1-8中任一项所述，其中所述多个纳米粒子中的纳米粒子的平均直径介于0.1微米与1微米之间。

10.  如权利要求9所述的多个纳米粒子，其中所有纳米粒子中超过75％的直径介于0.1微米与1微米之间。

11.  如权利要求1-8中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯是结 晶聚合物。

12.  如权利要求11所述的纳米粒子，其中所述芯是单一聚合物、嵌段共聚物、三嵌段共聚物或者四嵌段聚合物。

13.  如权利要求1-8、11和12中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯包含PLGA、PLA、PGA、(聚(ε-己内酯)PCL、PLL或者其组合。

14.  如权利要求1-8和11-13中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯是可生物降解的。

15.  如权利要求1-8中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯是固体。

16.  如权利要求1-8和15中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯是不可生物降解的。

17.  如权利要求1-8、15和16中任一项所述的纳米粒子，其中所述芯是选自以下的材料：金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍、ZnS、ZnO、Ti、TiO₂、Sn、SnO₂、Si、SiO₂、Fe、Fe⁺⁴、钢、钴铬合金、Cd、CdSe、CdS和CdS、钛合金、AgI、AgBr、HgI₂、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In₂S₃、In₂Se₃、Cd₃P₂、Cd₃As₂、InAs、GaAs、纤维素或者树枝状结构。

18.  如权利要求1-8和11-17中任一项所述的纳米粒子，其中所述水溶性聚合物是选自以下：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚氧化烯(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基铵(MPC)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、 单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或者无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其它聚氧化烯、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇或者聚氧乙基化葡萄糖、结肠酸或者其它碳水化合物聚合物、菲科尔(Ficoll)或者葡聚糖及其组合或者混合物。

19.  如权利要求18所述的纳米粒子，其中所述水溶性聚合物是PEG。

20.  如权利要求19所述的纳米粒子，其中所述PEG的平均分子量介于100Da和10,000Da之间。

21.  如权利要求19的纳米粒子，其中PEG的平均分子量为至少约100。

22.  如权利要求1-8和11-21中任一项所述的纳米粒子，其中所述肽包含选自以下的序列：RGD、RGDS、GRGDS、GRGDSP、GRGDSPK、GRGDN、GRGDNP、GGGGRGDS、GRGDK、GRGDTP、cRGD、YRGDS或者其变体。

23.  如权利要求1-8和11-22中任一项所述的纳米粒子，其中所述RGD肽呈串联重复。

24.  如权利要求1-8和11-23中任一项所述的纳米粒子，其包含所述RGD肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或者更多个拷贝。

25.  如权利要求1-8和11-22中任一项所述的纳米粒子，其包含所述RGD肽的多个拷贝。

26.  如权利要求25所述的纳米粒子，其中所述RGD肽的所有拷贝都是相同的。

27.  如权利要求25所述的纳米粒子，其中所述RGD肽的两个拷贝具有不同序列。

28.  如权利要求1-8和11-27中任一项所述的纳米粒子，其中所述水溶性聚合物以0.1∶1到1∶10或者更大的摩尔比连接于所述芯。

29.  如权利要求1-8和11-27中任一项所述的纳米粒子，其进一步包含治疗性化合物。

30.  如权利要求29所述的纳米粒子，其中所述治疗性化合物是疏水性的。

31.  如权利要求29所述的纳米粒子，其中所述治疗性化合物是亲水性的。

32.  如权利要求29-31中任一项所述的纳米粒子，其中所述治疗性化合物共价连接于所述纳米粒子，与所述纳米粒子非共价缔合，通过静电相互作用与所述纳米粒子缔合，或者通过疏水性相互作用与所述纳米粒子缔合。

33.  如权利要求29-31中任一项所述的纳米粒子，其中所述治疗性化合物是生长因子、细胞因子、类固醇或者小分子。

34.  如权利要求29-32中任一项所述的纳米粒子，其中所述治疗性化合物是抗癌化合物。

35.  一种药物组合物，其包含如权利要求1-8和11-38中任一项所述的纳米粒子。

36.  如权利要求35所述的药物组合物，其呈静脉内施用制剂形式。

37.  如权利要求35所述的药物组合物，其为冻干的或者粉末。

38.  一种治疗个体病状的方法，其包括以下步骤：向有需要的患者施用可有效治疗所述病状的量的如权利要求1-8和11-38中任一项所述的纳米粒子。

39.  如权利要求38所述的方法，其中所述个体具有出血性病症。

40.  如权利要求39所述的方法，其中所述纳米粒子是以与不施用或者施用生理盐水相比可有效地使出血时间缩短15％以上的量施用。

41.  如权利要求39或者40所述的方法，其中所述出血性病症是凝血障碍、血小板减少症、伤口愈合障碍、创伤、冲击波创伤、脊髓损伤或者出血的症状。

用于控制出血和药物递送的纳米粒子
相关申请
本申请要求于2011年10月13日提交的美国临时专利申请No.61/564826的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
政府利益声明
本发明在政府支持下根据由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号1DP2OD007338-01和由美国国防部(United States Department of Defense)授予的资助号W81XWH-11-2-0014来创制。政府对本发明具有某些权利。
发明背景
通常，当发生损伤时，血小板在损伤部位会被激活并且活化的血小板产生纤维蛋白且细胞和纤维蛋白形成阻止出血的栓塞(5)。在出血不受控制时，血小板无法形成栓塞。在野外和临床中存在许多增强止血的方法，包括加压敷裹、吸收性材料(例如)和静脉内(IV)输注活化的重组因子VII(rFVIIa)，但前两者仅适用于暴露的伤口，而rFVIIa则好坏参半，需要冷藏，并且异常昂贵，从而使得在野外或者在创伤部位进行施用具有挑战性。显然，需要一种阻止出血的新方法，其适合在野外进行施用。
出血也是损伤级联反应中，例如中枢神经系统(CNS)中的第一步。在脊髓和创伤性脑损伤两者中，不管损害机制，第一个可观察到的现象是出血。如果可以停止出血，那么大概就可以保护组织和改善结果。初级机械损害经常是损伤的一小部分。在损伤后数小时、数天和数周 内发生的次级损伤过程导致发生进展和不良功能性结果。阻止那些次级损伤过程将意味着保护更多组织。保护组织意味着更好的功能性结果。
受伤后，止血是通过一系列凝结事件形成。就血小板来说的关键步骤涉及其活化、结合和释放许多生长因子和其它分子，包括纤维蛋白原。在血管损伤期间，胶原蛋白被暴露，从而触发血小板活化。血小板形态从盘状转变为星状，并且其粘着于暴露的胶原蛋白。一旦血小板开始聚集，从其贮存颗粒释放数种致炎因子(inflammatory agent)，包括引起附近循环的血小板的表面成为附着的二磷酸腺苷(ADP)。血清素、肾上腺素和血栓素A2进一步诱发极度血管收缩。最终步骤，凝块形成是纤维蛋白原(一种由肝产生并且通常存在于血浆中的大的可溶性血浆蛋白)转化为纤维蛋白(一种不溶性丝状分子)。
在数种损伤中，这些内源性过程产生短的并且不受控制的出血结果。除外部方法以外存在许多增强这些过程并且诱发止血的方法。代替或者增强存在的血小板的血小板代替物已探讨了多年(6)。施用同种异体型血小板可有助于阻止出血；然而，血小板具有短的保存期，且施用同种异体型血小板可引起移植物抗宿主疾病、同种异体免疫作用和输液相关肺损伤(6)。包括经Arg-Gly-Asp(RGD)序列改性的红细胞、涂油纤维蛋白原的基于白蛋白的微胶囊和脂质体系统的非血小板替代物已作为凝血剂进行研究(7)，但毒性、血栓形成和有限的功效是临床应用这些产物的主要问题(8)。
包括rFVIIa的重组因子可通过促进产生纤维蛋白原来增强止血，但免疫原性和血栓性并发症是不可避免的危险(9)。然而，正在临床上用于多种创伤和无法以其它方式控制出血的手术情况(9)。有关其功效的数据是多变的，但不可能是NovoSeven还非常昂贵。单次剂量成本大约$10,000，而典型地需要多次剂量来影响止血(9)。
关于对于复杂创伤有效的止血剂，系统当贮存在室温下(即医生的包)时需要无毒、稳定的，具有立即I.V.施用的可能性，并且具有损伤部位特异性聚集性质以便避免非特异性血栓形成。关于临床上可转移的这一系统，理论上其需要用预先由FDA批准的材料制备。实际上，其还需要价格实惠。
发明概要
提供一种温度稳定纳米粒子，其包含芯、水溶性聚合物和肽，所述水溶性聚合物在水溶性聚合物的第一末端连接于所述芯，所述肽连接于水溶性聚合物的第二末端，所述肽包含RGD氨基酸序列，所述水溶性聚合物具有足以允许肽结合于糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的长度。一方面，所述纳米粒子的熔化温度超过35℃。在多个方面，纳米粒子具有球体形状并且直径小于1微米。
在多个方面，纳米粒子的直径介于0.1微米与1微米之间。
在多个方面，纳米粒子为非球体、杆状、纤维状或者须状。在这一方面的多种实施方案中，纳米粒子的纵横长宽比为至少3。
在多个方面，纳米粒子在室温下稳定至少14天。
还提供多个纳米粒子，其中如本公开所提供的每个纳米粒子的平均直径介于0.1微米与1微米之间。
在所述多个纳米粒子的多个方面，所有纳米粒子中超过75％的直径介于0.1微米与1微米之间。
在多个方面，本公开的纳米粒子具有的芯是结晶聚合物、单一聚合物、嵌段共聚物、三嵌段共聚物或者四嵌段聚合物。在多个方面，芯包含PLGA、PLA、PGA、(聚(ε-己内酯)PCL、PLL或者其组合。
在多个方面，纳米粒子芯是可生物降解的，固体，不可生物降解 的和/或者包含选自以下的材料：金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍、ZnS、ZnO、Ti、TiO₂、Sn、SnO₂、Si、SiO₂、Fe、Fe⁺⁴、钢、钴铬合金、Cd、CdSe、CdS和CdS、钛合金、AgI、AgBr、HgI₂、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In₂S₃、In₂Se₃、Cd₃P₂、Cd₃As₂、InAs、GaAs、纤维素或者树枝状结构。
在多个方面，纳米粒子中的水溶性聚合物是选自以下：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚氧化烯(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基铵(MPC)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或者无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其它聚氧化烯、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇或者聚氧乙基化葡萄糖、结肠酸或者其它碳水化合物聚合物、菲科尔(Ficoll)或者葡聚糖及其组合或者混合物。在多个方面，水溶性聚合物是平均分子量介于100Da和10,000Da之间或者至少为约100的PEG。
在多个方面，纳米粒子的肽包含选自以下的序列：RGD、RGDS、GRGDS、GRGDSP、GRGDSPK、GRGDN、GRGDNP、GGGGRGDS、GRGDK、GRGDTP、cRGD、YRGDS或者其变体。在多个方面，肽呈线性，且在其它方面，肽呈环状。环状肽在本领域中应理解为包括那些因共价缔合而呈环状的肽，和那些因构象偏好而呈环状的肽。因此，环状肽包括那些通过共价结合而不呈环状的肽。在多个方面，RGD肽呈串联重复。在多个方面，纳米粒子包含RGD肽的1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10个或者更多个拷贝，或者RGD肽的多个拷贝。在多个方面，纳米粒子中的所有RGD肽都是相同的，且在其它方面，RGD肽的两个拷贝具有不同序列。
在多个方面，水溶性聚合物以0.1∶1到1∶10或者更大的摩尔比连接于芯。
在多个方面，本公开的纳米粒子进一步包含治疗性化合物。在多个方面，所述治疗性化合物是疏水性的，治疗性化合物是亲水性的，治疗性化合物共价连接于纳米粒子，与纳米粒子非共价缔合，通过静电相互作用与纳米粒子缔合，或者通过疏水性相互作用与纳米粒子缔合，治疗性化合物是生长因子、细胞因子、类固醇或者小分子，和/或者治疗性化合物是抗癌化合物。
提供一种包含本公开的纳米粒子的药物组合物。在多个方面，所述药物组合物是静脉内施用制剂、冻干制剂或者粉末。
还提供一种治疗个体病状的方法，其包括向有需要的患者施用可有效治疗所述病状的量的本公开的纳米粒子的步骤。在多个方面，个体具有出血性病症。在所述方法的各种方面，纳米粒子是以与不施用或者施用生理盐水相比可有效地使出血时间缩短15％以上的量施用。在多个方面，出血性病症是凝血障碍、血小板减少症、伤口愈合障碍、创伤、冲击波创伤、脊髓损伤或者出血的症状。
发明详述
提供一种功能化的纳米粒子，其是基于具有多种用途的FDA批准的材料。在多个方面，所述纳米粒子缩短损伤部位的出血时间，在创伤后止血中对中枢神经系统(CNS)起作用并且提供用于局部药物递送的手段。
提供基于聚合物芯、水溶性聚合物和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)部分的变体的纳米粒子。
I.纳米粒子
本公开提供一种纳米粒子，其包含芯、水溶性聚合物和肽，所述水溶性聚合物在水溶性聚合物的第一末端连接于所述芯，所述肽连接于水溶性聚合物的第二末端，所述肽包含RGD氨基酸序列，所述水溶性聚合物具有足以允许肽结合于糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的长度。在多个方面，肽呈线性或者环状。应了解在包含本公开的多个纳米粒子的组合物中，组合物预期包括其中存在所有肽都呈线性、所有肽都呈环状或者线性和环状肽的混合物的纳米粒子。
本公开的纳米粒子是温度稳定的，即其在广泛温度范围内基本上维持相同结构和/或者基本上相同功能。在“基本上相同结构”和“基本上相同功能”中，本公开预期“基本上相同”意味着无影响纳米粒子在以下剂量下实现其用途的能力的变化：原始剂量加或者减10％、原始剂量加或者减10％、原始剂量加或者减10％、原始剂量加或者减9％、原始剂量加或者减8％、原始剂量加或者减7％、原始剂量加或者减6％、原始剂量加或者减5％或者原始剂量加或者减5％-10％。在多种实施方案中，不管制造纳米粒子的温度，纳米粒子在生理学温度下维持基本上相同结构和/或者基本上相同功能。也涵盖在大大超过生理学温度的高温下维持基本上相同结构和/或者基本上相同功能的纳米粒子。出于许多原因，包括(例如且不限于)灭菌过程，在高温下维持基本上相同结构和/或者基本上相同功能的能力是重要的。另一方面，也涵盖在低温下维持基本上相同结构和/或者基本上相同功能的纳米粒子。举例来说，对于需要或者受益于长期贮存的制剂来说涵盖在冰点温度或者冰点温度以下维持基本上相同结构和/或者基本上相同功能的纳米粒子。在多个方面，本公开的纳米粒子的熔化温度超过35℃、超过40℃、超过45℃、超过50℃、超过55℃、超过60℃、超过65℃、超过70℃、超过71℃、超过72℃、超过73℃、超过74℃、超过75℃、超过76℃、超过77℃、超过78℃、超过79℃或者超过80℃。
本公开的所有方面的纳米粒子在室温下都会稳定至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或者至少14天或者更长。
预期本公开的纳米粒子具有许多不同形状中的任一种。在某些方面，纳米粒子的形状与其制造方法有关。在其它方面，纳米粒子在其制造过程之前、期间或者之后获得形状。在多种实施方案中，提供具有球体形状的纳米粒子。涵盖具有多种大小的球体纳米粒子(在本文中称为纳米球)，其中涵盖例如具有以下直径的纳米粒子：介于0.1微米与0.5微米之间、介于0.2微米与0.4微米之间、介于0.25微米与0.375微米之间、介于0.3微米与0.375微米之间、介于0.325微米与0.375微米之间、介于0.12微米与0.22微米之间、介于0.13微米与0.22微米之间、介于0.14微米与0.22微米之间、介于0.15微米与0.22微米之间、介于0.16微米与0.22微米之间、介于0.17微米与0.22微米之间、介于0.18微米与0.22微米之间、介于0.19微米与0.22微米之间、介于0.20微米与0.22微米之间、介于0.21微米与0.22微米之间、介于0.12微米与0.21微米之间、介于0.12微米与0.20微米之间、介于0.12微米与0.19微米之间、介于0.12微米与0.18微米之间、介于0.12微米与0.17微米之间、介于0.12微米与0.16微米之间、介于0.12微米与0.15微米之间、介于0.12微米与0.14微米之间或者介于0.12微米与0.13微米之间。在多个方面，涵盖具有以下直径的纳米粒子：0.01微米到1.0微米、0.05微米到1.0微米、0.05微米到0.95微米、0.05微米到0.9微米、0.05微米到0.85微米、0.05微米到0.8微米、0.05微米到0.75微米、0.05微米到0.7微米、0.05微米到0.65微米、0.05微米到0.6微米、0.05微米到0.55微米、0.05微米到0.5微米、0.1微米到1微米、0.15微米到1.0微米、0.2微米到1微米、0.25微米到1.0微米、0.3微米到1微米、0.35微米到1.0微米、0.4微米到1微米、0.45微米到1.0微米或者0.5微米到1微米。在本公开提供的纳米粒子组合物中，球形纳米粒子是均质的，即全部都具有相同直径，或者其为非均质的，即组合物中的至少两个纳米粒子具有 不同直径。
还提供非球体纳米粒子。其它纳米粒子包括那些具有杆状、纤维状或者须状形状的纳米粒子。在杆状、纤维状或者须状实施方案中，纳米粒子具有足够高的长宽比以避免、减慢或者降低从循环中清除的速率。
长宽比是本领域中了解的术语，高长宽比指示长又窄的形状而低长宽比指示短又粗的形状。
涵盖具有以下纵横长宽比的本公开的纳米粒子：至少3、至少3.5、至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.5、至少7.0、至少7.5、至少8.0、至少8.5、至少9.0、至少9.5、至少10.0或者更大。在所涵盖的纳米粒子组合物中，纳米粒子在一个实施方案中具有相同长宽比，且在替代性实施方案中，组合物中的至少两个纳米粒子具有不同长宽比。纳米粒子组合物的特征还有平均具有基本上相同长宽比。如在这一情况下所使用的“基本上相同”指示涵盖约10％、约9％、约8％、约7％约6％或者至多约5％的长宽比变化。在其它方面，提供纳米粒子组合物，其中组合物中的纳米粒子的长宽比介于约1％和200％之间、介于约1％和150％之间、介于约1％和100％之间、介于约1％和约50％之间、介于约50％和200％之间、介于约100％和200％之间和介于约150％和200％之间。可选地，组合物中的纳米粒子的长宽比为约X％到Y％，其中X为1到100且Y是100到200。
本公开还提供多个纳米粒子。在本公开提供的包含多个球形纳米粒子的组合物中，所述多个纳米粒子中的纳米粒子的平均直径介于0.1微米与0.5微米之间、介于0.2微米与0.4微米之间、介于0.25微米与0.375微米之间、介于0.3微米与0.375微米之间、介于0.325微米与0.375微米之间、为约0.12微米、约0.13微米、约0.14微米、约0.15微米、约0.16微米、约0.17微米、约0.18微米、约0.19微米、约0.20微米、约0.21微米、约0.22微米、约0.23微米、约0.24 微米、约0.25微米、约0.26微米、约0.27微米、约0.28微米、约0.29微米、约0.30微米、约0.31微米、约0.32微米、约0.33微米、约0.34微米、约0.35微米、约0.36微米、约0.37微米、约0.38微米、约0.39微米、约0.40微米、约0.41微米、约0.42微米、约0.43微米、约0.44微米、约0.45微米、约0.46微米、约0.47微米、约0.48微米、约0.49微米、约0.50微米、约0.41微米、约0.52微米、约0.53微米、约0.54微米、约0.55微米、约0.56微米、约0.57微米、约0.58微米、约0.59微米、约0.60微米、约0.61微米、约0.62微米、约0.63微米、约0.64微米、约0.65微米、约0.66微米、约0.67微米、约0.68微米、约0.69微米、约0.70微米、约0.71微米、约0.72微米、约0.73微米、约0.74微米、约0.75微米、约0.76微米、约0.77微米、约0.78微米、约0.79微米、约0.80微米、约0.81微米、约0.82微米、约0.83微米、约0.84微米、约0.85微米、约0.86微米、约0.87微米、约0.88微米、约0.89微米、约0.90微米、约0.91微米、约0.92微米、约0.93微米、约0.94微米、约0.95微米、约0.96微米、约0.97微米、约0.98微米、约0.99微米、约1.0微米或者更大。
在多个方面，多个球形纳米粒子的特征在于所有纳米粒子中超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％或者超过99％的直径介于0.1微米与0.5微米之间、介于0.2微米与0.4微米之间、介于0.25微米与0.375微米之间、介于0.3微米与0.375微米之间、介于0.325微米与0.375微米之间、介于0.12微米与0.22微米之间、介于0.13微米与0.22微米之间、介于0.14微米与0.22微米之间、介于0.15微米与0.22微米之间、介于0.16微米与0.22微米之间、介于0.17微米与0.22微米之间、介于0.18微米与0.22微米之间、介于0.19微米与0.22微米之间、介于0.20微米与0.22微米之间、介于0.21微米与0.22微米之间、介于0.12微米与0.21微米之间、介于0.12微米与0.20微米之间、介于0.12微米与0.19微米之间、介于0.12微米与0.18微米之间、介于0.12微米与0.17微 米之间、介于0.12微米与0.16微米之间、介于0.12微米与0.15微米之间、介于0.12微米与0.14微米之间、介于0.12微米与0.13微米之间、0.01微米到1.0微米、0.05微米到1.0微米、0.05微米到0.95微米、0.05微米到0.9微米、0.05微米到0.85微米、0.05微米到0.8微米、0.05微米到0.75微米、0.05微米到0.7微米、0.05微米到0.65微米、0.05微米到0.6微米、0.05微米到0.55微米、0.05微米到0.5微米、0.1微米到1微米、0.15微米到1.0微米、0.2微米到1微米、0.25微米到1.0微米、0.3微米到1微米、0.35微米到1.0微米、0.4微米到1微米、0.45微米到1.0微米或者0.5微米到1微米。
本公开进一步提供具有基本上任何形状的纳米粒子，其是使用众所周知和本领域中常规实践的微加工方法来形成的。在微加工方法中，纳米粒子的大小和形状由设计预先确定。
在采用形状是非球形的纳米粒子的方面，涵盖众所周知和本领域中常规使用的纳米加工技术来用于制造。Daum等人，(2012)Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol4：52-65；Gang等人，(2011)ACS Nano5：8459-8465；Grilli等人，(2011)Proc Natl Acad Sci U S A108：15106-15111；Lin等人，(2011)Control Release154：84-92；Slingenbergh等人，(2012)Selective Functionalization of Tailored Nanostructures.ACS Nano。模具是由例如硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或者本领域中熟知的其它材料材料制成，且用例如明胶的水凝胶来铸造。使用如本文中所述的任何聚合物来铸造纳米粒子。在多个方面，基于原始模具的所得结构是多臂星形，其中臂长度为200nm到数微米且臂直径为200nm到数微米。因为其是一种铸造程序，所以铸造过程允许各臂具有不同长度和3个臂到数十个臂的维度。
A.芯
提供如上文所述的纳米粒子，其中芯是聚合物。在多个方面，芯是结晶聚合物。如本文中所使用和本领域中所理解的“结晶”定义为 意味呈规则三维阵列的分子排列。在其它方面，聚合物是半结晶，其含有结晶和非晶形区而非所有分子都以规则三维阵列排列。在多个方面，芯是单一聚合物、嵌段共聚物或者三嵌段共聚物。在特定方面，芯包含PLGA、PLA、PGA、(聚(ε-己内酯)PCL、PLL、纤维素、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、基于树枝状分子的聚合物或者其组合。
在多个方面，芯是可生物降解的或者不可生物降解的，或者在多个纳米粒子中，涵盖配制可生物降解和不可生物降解的芯的组合。在多个方面，芯是固体、多孔或者空心的。在多个纳米粒子中，设想包括固体、多孔和/或者空心芯的混合物。
本公开的任何方面的纳米粒子包括那些其中芯可选地是选自以下的材料的纳米粒子：金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍、ZnS、ZnO、Ti、TiO₂、Sn、SnO₂、Si、SiO₂、Fe、Fe⁺⁴、钢、钴铬合金、Cd、CdSe、CdS和CdS、钛合金、AgI、AgBr、HgI₂、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In₂S₃、In₂Se₃、Cd₃P₂、Cd₃As₂、InAs、GaAs、纤维素或者树枝状结构。
还提供水凝胶芯。一方面，水凝胶芯提供较高温度稳定程度，剪切血管的可能性较小和诱发非特异性血栓形成并且允许形成较大纳米粒子。
B.水溶性聚合物
提供一种本公开的纳米粒子，其中水溶性聚合物是选自以下：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚氧化烯(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛)(PHF)、 磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基铵(MPC)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或者无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其它聚氧化烯、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇或者聚氧乙基化葡萄糖、结肠酸或者其它碳水化合物聚合物、菲科尔或者葡聚糖及其组合或者混合物。在本公开涵盖的多个纳米粒子中，预期在多个方面，每个纳米粒子具有相同水溶性聚合物，或者可选地所述多个纳米粒子中的至少两个纳米粒子各自连接有不同水溶性聚合物。
在一特定方面，本公开的纳米粒子是一种其中水溶性聚合物是PEG的纳米粒子。对于这一方面的纳米粒子，PEG的平均分子量介于100Da和10,000Da、500Da和10,000Da、1000Da和10,000Da、1500Da和10,000Da、2000Da和10,000Da、2500Da和10,000Da、3000Da和10,000Da、3500Da和10,000Da、4000Da和10,000Da、4500Da和10,000Da、5000Da和10,000Da、5500Da和10,000Da、1000Da和9500Da、1000Da和9000Da、1000Da和8500Da、1000Da和8000Da、1000Da和7500Da、1000Da和7000Da、1000Da和6500Da或者1000Da和6000Da之间。可选地，纳米粒子是一种其中PEG的平均分子量如下的纳米粒子：约100、Da、200Da、300Da、400Da、1000Da、1500Da、3000Da、3350Da、4000Da、4600Da、5,000Da、8,000Da或者10,000Da。在多个纳米粒子中，预期每个纳米粒子连接于相同分子量的PEG水溶性聚合物，或者在替代方案中，所述多个纳米粒子中的至少两个纳米粒子各自连接于不具有相同分子量的PEG水溶性聚合物。
本公开的纳米粒子包括那些其中水溶性聚合物以如下摩尔比连接于芯的纳米粒子：0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或 者更大。在多个方面，提供多个纳米粒子，其中对于所述多个纳米粒子中的每个纳米粒子来说水溶性聚合物与芯的比率是相同的，且在替代方面，所述多个纳米粒子中的至少两个纳米粒子具有不同的水溶性聚合物与芯的比率。
在多个方面，纳米粒子与水溶性聚合物缔合的程度由所选的施用途径确定。
C.肽
本公开的纳米粒子的特征是肽与其缔合。在本公开的多个方面。肽呈线性或者环状。在特定实施方案中，肽包含选自以下的芯序列：RGD、RGDS、GRGDS、GRGDSP、GRGDSPK、GRGDN、GRGDNP、GGGGRGDS、GRGDK、GRGDTP、cRGD、YRGDS或者其变体。如本文中所使用的变体包括具有如本文中所定义的芯序列和在芯序列的一个末端或者两个末端连接的一个或者多个其它氨基酸残基的肽，具有如本文中所定义的芯序列但其中芯序列中的一个或者多个氨基酸残基经替代性氨基酸残基取代的肽；所述替代性氨基酸残基是天然存在的氨基酸残基或者非天然存在的氨基酸残基，具有如本文中所定义的芯序列但其中芯序列中的一个或者多个氨基酸残基缺失的肽，或者其组合，其中其它氨基酸残基、氨基酸取代、氨基酸缺失或者变化组合基本上不改变纳米粒子的活性。如这一方面中所使用的“基本上”与本公开别处所述的含义相同。
在多个方面，RGD肽呈串联重复排列，且在这一方面的实施方案中，涵盖RGD肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个拷贝。在另一方面，RGD肽的多个拷贝连接于同一纳米粒子，尽管并未呈无规重复排列。
在其中纳米粒子与多个RGD肽缔合的多个方面，本公开提供一种纳米粒子，其中RGD肽的所有拷贝都是相同的，以及其中两个RGD肽具有不同序列的方面。
在所涵盖的多个纳米粒子中，提供其中RGD肽(或者RGD肽的多个拷贝)在所述多个纳米粒子中的每个纳米粒子上都是相同的实施方案。在替代性方面，所述多个纳米粒子中的至少两个纳米粒子各自与一个或者多个独特的RGD肽缔合。
在多个方面，纳米粒子上肽的数目(即肽密度)影响血小板聚集。
E.具有纳米粒子的其它化合物
还涵盖一种本公开的纳米粒子，其进一步包含治疗性化合物。在多个方面，所述治疗性化合物是疏水性的，且在其它方面，所述治疗性化合物是亲水性的。提供一种本公开的纳米粒子，其中治疗性化合物共价连接于纳米粒子，与纳米粒子非共价缔合，通过静电相互作用与纳米粒子缔合，或者通过疏水性相互作用与纳米粒子缔合。在多种实施方案中，治疗性化合物是生长因子、细胞因子、类固醇或者小分子。涵盖其中一种以上治疗性化合物与纳米粒子缔合的实施方案。在这一方面，与纳米粒子缔合的每种治疗性化合物都是相同的，或者与纳米粒子缔合每种治疗性化合物是不同的。在本公开提供的多个纳米粒子中，所述多个纳米粒子中的每个纳米粒子与同一种治疗性化合物或者化合物缔合，或者在替代方案中，所述多个纳米粒子中的至少两个纳米粒子各自与一种或者多种不同治疗性化合物缔合。
在多个方面，治疗性化合物是抗癌化合物，且在特定实施方案中，治疗性化合物是选自以下：烷基化剂，包括(但不限于)氮芥类，例如氮芥(mechlor-ethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲，例如(但不限于)卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)和司莫司汀(semustin，甲基-CCNU)；乙基亚胺/甲基三聚氰胺，例如三亚乙基三聚氰胺(thriethylenemelamine，TEM)、三亚乙基、硫代磷酰胺(塞替派(thiotepa))、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine，HMM，六甲蜜胺(altretamine))；烷基磺酸酯， 例如(但不限于)白消安(busulfan)；三嗪，例如达卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘧啶类似物，例如(但不限于)5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(AraC、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮杂胞苷、2，2′--二氟脱氧胞苷；嘌呤类似物，例如(但不限于)6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2′-脱氧柯福霉素(2′-deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))、赤羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)、2-CdA)；天然产物，包括(但不限于)抗有丝分裂药物，例如紫杉醇；长春花生物碱，包括(但不限于)长春碱(vinblastine，VLB)、长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)，例如(但不限于)依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如(但不限于)放线菌素D(actimomycin D)、道诺霉素(daunomycin)(红比霉素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))、丝裂霉素(mitomycin C)和放线菌素；酶，例如(但不限于)L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，例如(但不限于)干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；其它药剂，包括(但不限于)铂配位络合物，例如顺铂(cisplain)和卡铂(carboplain)；蒽二酮，例如(但不限于)米托蒽醌；取代脲，例如(但不限于)羟基脲；甲基肼衍生物，包括(但不限于)N-甲基肼(N-methylhydrazine，MIH)和丙卡巴肼(procarbazine)；肾上腺皮质抑制剂，例如(但不限于)米托坦(mitotane)(o，p′-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括(但不限于)肾上腺皮质类固醇拮抗剂，例如强的松(prednisone)和等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特；孕激素，例如(但不限于)己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；雌激素，例如(但不限于)二乙基己烯雌酚和炔雌 醇等效物；抗雌激素药，例如(但不限于)他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素药，例如(但不限于)氟他胺(flutamide)、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；非类固醇抗雄激素药，例如(但不限于)氟他胺；叶酸抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂，例如(但不限于)AGl478和放射敏感性化合物。
在多个方面，治疗性化合物是选自以下：AGl478、阿西维辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、阿克罗宁(acronine)、阿多来新(adozelesin)、阿地白介素(aldesleukin)、阿利维A酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺、安波霉素(ambomycin)、阿美蒽醌(ametantrone)、氨磷汀(amifostine)、氨鲁米特、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、氨茴霉素(anthramycin)、三氧化二砷、天冬酰胺酶(asparaginase)、曲林菌素(asperlin)、阿扎胞苷(azacitidine)、阿扎替派(azetepa)、阿佐霉素(azotomycin)、巴马司他(batimastat)、苯佐替派(benzodepa)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)、比折来新(bizelesin)、博来霉素(bleomycin)、布喹那(brequinar)、溴匹立明(bropirimine)、白消安(busulfan)、放线菌素C(cactinomycin)、卡普睾酮(calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、卡醋胺(caracemide)、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂、卡莫司汀、卡柔比星(carubicin)、卡折来新(carzelesin)、西地芬戈(cedefingol)、塞来考昔(celecoxib)、苯丁酸氮芥、西罗霉素(cirolemycin)、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、右奥马铂(dexormaplatin)、地扎胍宁(dezaguanine)、甲磺酸地扎胍宁(dezaguanine mesylate)、地吖醌(diaziquone)、多西紫杉醇(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、达佐霉素(duazomycin)、依达曲沙(edatrexate)、依氟鸟氨酸(eflomithine)、依沙芦星(elsamitrucin)、恩洛 铂(enloplatin)、恩普氨酯(enpromate)、依匹哌啶(epipropidine)、表柔比星(epirubicin)、厄布洛唑(erbulozole)、依索比星(esorubicin)、雌莫司汀、雌莫司汀、依他硝唑(etanidazole)、依托泊苷、依托泊苷、氯苯乙嘧胺(etoprine)、法倔唑(fadrozole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟西他滨(flurocitabine)、磷喹酮(fosquidone)、福司曲星(fostriecin)、氟维司群(fulvestrant)、吉西他滨、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新(ilmofosine)、白细胞介素II(IL-2，包括重组白细胞介素II或者rIL2)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-1a、干扰素γ-I b、异丙铂(iproplatin)、伊立替康(irinotecan)、兰瑞肽(lanreotide)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林、利阿唑(liarozole)、洛美曲索(lometrexol)、洛莫司汀(lomustine)、洛索蒽醌(losoxantrone)、马索罗酚(masoprocol)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥(mechlorethamine hydrochlride)、甲地孕酮(megestrol)、乙酸美仑孕酮(melengestrol acetate)、美法仑、美诺立尔(menogaril)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤、氯苯氨啶(metoprine)、美妥替哌(meturedepa)、米丁度胺(mitindomide)、米托卡星(mitocarcin)、丝裂红素(mitocromin)、米托洁林(mitogillin)、米托马星(mitomalcin)、丝裂霉素(mitomycin)、奈妥斯普(nitosper)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、霉酚酸(mycophenolic acid)、奈拉滨(nelarabine)、诺考达唑(nocodazole)、诺加霉素(nogalamycin)、奥马铂(ormnaplatin)、奥昔舒仑(oxisuran)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、培门冬酶(pegaspargase)、佩里霉素(peliomycin)、奈莫司汀(pentamustine)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、哌泊溴烷(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)、普卡霉素、普洛美坦(plomestane)、卟吩姆(porfimer)、泊非霉素(porfiromycin)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、嘌呤霉素(puromycin)、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、利波腺苷(riboprine)、罗谷亚胺(rogletimide)、沙芬戈(safingol)、沙芬戈、司莫司汀(semustine)、辛曲秦(simtrazene)、斯帕福斯特(sparfosate)、稀疏 霉素(sparsomycin)、锗螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、螺铂(spiroplatin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、他利霉素(talisomycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替可加兰(tecogalan)、替加氟(tegafur)、替洛蒽醌(teloxantrone)、替莫泊芬(temoporfin)、替尼泊苷(teniposide)、替罗昔隆(teroxirone)、睾内酯(testolactone)、硝咪硫鸟嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派、噻唑呋林(tiazofurin)、替拉扎明(tirapazamine)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(torernifene)、曲托龙(trestolone)、曲西立滨(triciribine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、妥布氯唑(tubulozole)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、乌瑞替派(uredepa)、伐普肽(vapreotide)、维替泊芬(verteporlin)、长春碱、硫酸长春新碱(vincristine sulfate)、长春地辛(vindesine)、长春匹定(vinepidine)、长春甘酯(vinglycinate)、长春罗新(vinleurosine)、长春瑞滨、长春罗定(vinrosidine)、长春利定(vinzolidine)、伏氯唑(vorozole)、折尼铂(zeniplatin)、净司他丁(zinostatin)、唑来膦酸(zoledronate)和佐柔比星(zorubicin)。这些和其它抗肿瘤治疗剂描述于例如Goodman&Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill Professional，第10版，2001中。
在多个方面，治疗性化合物是选自以下的消炎药：糖皮质激素；激肽释放酶(kallikrein)抑制剂；皮质类固醇(例如(但不限于)强的松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、地塞米松或者曲安奈德(triamcinalone acetinide))；消炎剂(例如(但不限于)非皮质类固醇消炎化合物(例如(但不限于)布洛芬(ibuprofen)或者氟比洛芬(flubiproben)))；维生素和矿物质(例如(但不限于)锌)；抗氧化剂(例如(但不限于)类胡萝卜素(例如(但不限于)叶黄素类胡萝卜素，如玉米黄素或者叶黄素))和抑制肿瘤坏死因子(TNF)活性的药剂，例如(但不限于)阿达木单抗(adalimumab)英夫利昔单抗(infliximab)赛妥珠单抗(certolizumab)戈利木单抗 (golimumab)和依那西普(etanercept)
在多个方面，治疗性化合物是M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、、TNFl、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。用于本文中的其它生长因子包括血管生成素、骨形态形成蛋白-1、骨形态形成蛋白-2、骨形态形成蛋白-3、骨形态形成蛋白-4、骨形态形成蛋白-5、骨形态形成蛋白-6、骨形态形成蛋白-7、骨形态形成蛋白-8、骨形态形成蛋白-9、骨形态形成蛋白-10、骨形态形成蛋白-11、骨形态形成蛋白-12、骨形态形成蛋白-13、骨形态形成蛋白-14、骨形态形成蛋白-15、骨形态形成蛋白受体IA、骨形态形成蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导中性粒细胞、趋化因子、细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子内皮细胞生长因子、内皮素1、上皮源性中性粒细胞引诱剂、胶质细胞系源性神经营养因子受体、胶质细胞系源性神经营养因子受体、生长相关蛋白、生长相关蛋白、生长相关蛋白、生长相关蛋白、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体、神经生长因子神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子、转化生长因子、转化生长因子、转化生长因子、转化生长因子、转化生长因子、转化生长因子、潜在转化生长因子、转化生长因子结合蛋白I、转化生长因子结合蛋白II、转化生长因子结合蛋白III、I型肿瘤坏死因子受体、II型肿瘤坏死因子受体、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化子受体、细胞内σ肽(ISP)和嵌合蛋白和其生物学或者免疫学活性片段。
还提供使用抗凝药物的方法。包括(例如且不限于)氯吡格雷 (plavix)、阿司匹林(aspirin)、华法林(war细in)、肝素、噻氯匹定(ticlopidine)、依诺肝素(enoxaparin)、香豆素(Coumadin)、双香豆素(dicumarol)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、柠檬酸、来匹卢定(lepirudin)及其组合。
这一方面的方法克服了将在手术中极其有用的这些抗凝血剂药物的作用。
II.药物组合物
本公开提供一种包含本公开的纳米粒子的药物组合物。在多个方面，所述药物组合物是单位剂量制剂。在多个方面，药物组合物是静脉内施用制剂。在多个方面，药物组合物是冻干的或者粉末。在多个方面，药物组合物进一步包含聚丙烯酸。
在多个方面，提供一种局部用制剂。其中提供内部和外部用途。用于局部施用的药物组合物任选地包括载剂，并且配制成溶液、乳液、软膏或者凝胶基剂。所述基剂例如任选地包含以下一种或者多种：石蜡油、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(例如水和醇)和乳化剂和稳定剂。增稠剂任选地存在于用于局部施用的药物组合物中。在某些方面，溶剂在制剂中，所述溶剂包括(例如且不限于)MMP、DMSO或者类似化合物。
本公开提供配制用于递送以下剂量的纳米粒子的药物组合物：1mg/kg到1g/kg、10mg/kg到1g/kg、20mg/kg到1g/kg、30mg/kg到1g/kg、40mg/kg到1g/kg、50mg/kg到1g/kg、60mg/kg到1g/kg、70mg/kg到1g/kg、80mg/kg到1g/kg、90mg/kg到1g/kg、10mg/kg到900mg/kg、10mg/kg到800m/kg、10mg/kg到700mg/kg、10mg/kg到600mg/kg、10mg/kg到500mg/kg、10mg/kg到400mg/kg、10mg/kg到300mg/kg、10mg/kg到200mg/kg、10mg/kg到100mg/kg、10mg/kg到75mg/kg、10mg/kg到50mg/kg、50mg/kg到900mg/kg、100mg/kg到800mg/kg、200mg/kg到700mg/kg、300mg/kg到600mg/kg、400 mg/kg到500mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg或者更多。
提供单次剂量施用，以及多次剂量施用。多次剂量施用包括那些其中第二剂量在初次施用后数分钟、数小时、数天、数周或者数月内施用的施用。在方法中
III.用途
提供一种治疗个体病状的方法，其包括向有需要的患者施用可有效治疗所述病状的量的本公开的纳米粒子的步骤。在多个方面，所述个体具有出血性病症。提供如下方法：其中纳米粒子是以与不施用或者施用生理盐水相比使出血时间有效缩短15％以上、20％以上、25％以上或者30％以上的量施用。在多个方面，使用所述方法，其中出血性病症是以下疾病的症状：凝血障碍、获得性血小板功能缺陷、先天性血小板功能缺陷、先天性蛋白C或者S缺乏症、散播性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)、因子II缺乏症、因子V缺乏症、因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XII缺乏症、血友病A、血友病B、特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)、冯威里氏病(von Willebrand′s disease)(I、II和III型)、巨核细胞/血小板缺乏症。在多个方面，提供一种方法，其中病状是由化学疗法和使用各种药物的其它疗法、放射疗法、手术、意外失血和其它特殊疾病病状引起的血小板减少症。在多个方面，提供一种方法，其中病状是再生障碍性贫血、特发性或者免疫性血小板减少症(idiopathic or immune thrombocytopenia，ITP)、包括与导致血小板减少症的乳癌转移性肿瘤相关的特发性血小板减少性紫癜、全身性红斑狼疮(包括新生儿狼疮综合症)、导致血小板减少症的转移性肿瘤、脾肿大、范可尼综合症(Fanconi′s syndrome)、维生素B12缺乏症、叶酸 缺乏症、梅赫异常(May-Hegglin anomaly)、威奥综合症(Wiskott-Aldrich syndrome)、阵发性夜间性血红蛋白尿、HIV相关ITP和HIV相关血栓性血小板减少性紫癜；慢性肝病；与血小板减少症相关的骨髓增生异常综合症；阵发性夜间性血红蛋白尿、C7E3Fab(阿昔单抗(Abciximab))疗法后的急性严重血小板减少症；同种免疫血小板减少症，包括母性同种免疫血小板减少症；与抗磷脂抗体和血栓形成相关的血小板减少症；自体免疫血小板减少症；药物诱导免疫血小板减少症，包括卡铂诱导血小板减少症、肝素诱导血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠期血小板减少症；休斯综合症(Hughes′syndrome)；狼疮状血小板减少症；意外和/或者大量失血；骨髓增生性疾病；恶性肿瘤患者的血小板减少症；血栓性血小板减少性紫癜，包括在癌症患者中表现为血栓性血小板减少性紫癜/溶血性尿毒症综合症的血栓性微血管病；自体免疫溶血性贫血；隐匿性空肠憩室穿孔；纯红细胞再生障碍性贫血；自体免疫血小板减少症；流行性肾病；利福平(rifampicin)相关急性肾功能衰竭；巴黎特鲁索血小板减少症(Paris-Trousseau thrombocytopenia)；新生儿同种免疫血小板减少症；阵发性夜间性血红蛋白尿；胃癌血液学变化；童年溶血性尿毒综合症；和与病毒感染相关的血液学表现，包括甲型肝炎病毒和CMV相关血小板减少症。在多个方面，提供一种方法，其中病状由导致血小板减少症的AIDS治疗引起。在多个方面，所述AIDS治疗是施用AZT。
在多个方面，所治疗得个体正罹患伤口愈合障碍、创伤、冲击波创伤、脊髓损伤、出血性中风、施用TPA后的出血或者在许多病状中可见但在早产中尤其严重的心室内出血。
实施例1
用于测试控制出血的纳米粒子的第一模型是仓鼠提睾肌准备，其中通过施用荧光素和用UV光激发它来破坏微血管并且诱发血小板活化来将微血管暴露和损伤。记录形成凝块的时间。
第一纳米粒子是分子量为10,000g/mol的4臂PEG。在末端用N，N′-羰基二咪唑(CDI)和偶联的RGD活化PEG分子。认为这种纳米粒子将在活化血小板之间充当桥梁并且减少凝块形成时间，但发现其显著加重出血。
基于这一结果，提出在粒子之间桥接较大分子量的PEG，但因为PEG变大，所以其呈现不利于暴露肽的构象。因此，设计出基于芯的系统以促进肽呈现并且足够大到在活化血小板之间进行桥接以参与凝块形成。
实施例2
纳米粒子的降解速率是通过分子量和乳酸与乙醇酸单元的比率来调节。除用于FDA批准的产品中以外使用PLGA的主要吸引力之一在于其可用于递送药物，从而在合成血小板平台上利用药物递送技术。PLL提供游离胺，可使用基于N，N′-羰基二咪唑(CDI)的传统偶联化学来将PEG偶联于其上。连接于PLGA-b-PLL的PEG的一个吸引力在于可连接多个PEG臂。多个分支增加了表面分离的倾向并且导致官能性部分的较大暴露。PEG使得纳米粒子呈亲水性的，使其通过血流移动并且减小纳米粒子收集在肝中的倾向。PEG是一种无毒、非血栓性材料，且其使得纳米粒子与其靶特异性结合。RGD部分或者其变化提供与活化血小板结合和增强其凝血行为的功能。已显示用RGD肽或者其变体(RGDS、GRGDS)之一进行化学修饰可增强其它系统中的血小板行为。RGD部分可见于许多系统中；在血小板中，当血小板被激活时其出现，释放引起血小板在损伤部位聚集的纤维蛋白原。
使用多种工具来表征纳米粒子，包括1H-NMR、UV-vis、氨基酸分析和动态光散射。从这一分析，显示纳米粒子的芯是约170nm，且PEG臂的长度是随着PEG分子量从1500Da变到8000Da而从90变到150nm。使用RGD部分的三种变体(RGD、RGDS和GRGDS) 且对于所有肽的偶联效率都是约35％。
实施例3
研发出一种体外系统，其用于高通量地筛选合成血小板的凝结功效，其中所述血小板使用CellTracker绿作沿循标记，以便有助于容易地分析。基本上，这一分析涉及活化已预先用CellTracker标记的血小板，并且在搅动下观察结合于经聚合物系统修饰的表面的数目。用胶原蛋白验证这一分析。这种系统允许有效地且独立地改变PEG分子量和RGD基序(即RGD、RGDS和GRGDS)。
在初步工作中，用PEG4600增强活化纳米粒子结合且GRGDS肽导致有效粘着和聚集。已确定通过将侧接氨基酸引入RGD基序，获得活性构象。这种生物活性转而又会影响RGD部分的整合素亲和性，并且增加细胞附着。显示GRGDS肽使得活化血小板良好结合和粘着。
其他人的先前工作已显示肽的长度会影响其温度稳定性以及生产成本。这些合成血小板经过设计在室温下是稳定的以有助于在野外进行其施用。
实施例4
在体外优化后，在股动脉部分切断模型中进行纳米粒子功效测试。静脉内注射约20mg/ml粒子并且使血流成像以确定凝血时间。
全身性施用经PEG4600和GRGDS肽功能化的纳米粒子使得股动脉的凝血时间减半。切除的凝块的扫描电子显微术显示合成血小板(由红色箭头标示)与凝块密切相关。重要的是，未见包括与CNS或者肺中粒子积累或者血栓形成相关的中风或者呼吸问题征兆的副作用。生物分布数据指示未结合的合成血小板在24小时内清除，且在受伤或者未受伤情况下未见不同。这些数据表明合成血小板积极地增强凝血并且是研究CNS创伤止血作用的重要工具。
实施例5
在CNS机械创伤后首先观察到的现象是微血管破裂。在这一现象之后是损伤级联反应，包括在损伤后数小时和数天内发生的局部缺血、缺氧、自由基形成和兴奋毒性。如果可阻止初期出血，那么会产生是否可抑制继发性变性和保护组织和功能的问题。
在人类中，出血的程度与CNS创伤后的功能缺损程度有关。在啮齿动物模型中，其还与损伤程度有关。虽然有限的文献关注阻止出血，因为目前诱发止血的药物具有引起CNS创伤后中风的危险，但早期临床证据表明通过施用rFVIIa来诱发止血可改善结果。这一结果表明比rFVIIa更有效阻止出血的方法具有显著改善结果的可能性。
最终，纳米粒子结合于损伤部位的凝块中。关于CNS损伤，这一结果意味着提供用于局部、靶向药物递送的平台以提供神经保护。
有许多因子可并入纳米粒子中。使用类似于制造纳米粒子芯的技术，制备递送睫状神经营养因子(CNTF)的基于PLGA的纳米粒子，其直径与合成血小板芯类似，其他人已显示其在许多CNS损伤和疾病中具有神经保护作用。这些纳米粒子递送纳克量的CNTF持续14天且所述生长因子具有生物活性。载有CNTF的纳米粒子显示在20天内递送。
其他人的结果还证明在许多损伤模型中由PLGA粒子递送胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)，以及递送曲安西龙(triamcinolone)(一种类固醇)，其涉及减少炎症、帮助减少血管泄露和提供CNS损伤后保护。
实施例6
将由聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚-L-赖氨酸(PLGA-PLL)嵌段共聚物芯组成的纳米粒子与末端是RGD官能团的聚乙二醇(PEG)臂结合。使用1-NMR证实PEG与PLGA-PLL的结合。使用单一乳液溶剂蒸发 技术制造纳米粒子，且通过扫描电子显微术(SEM)来确认大小。使用氨基酸(AA)分析量化随后GRGDS与PLGA-PLL-PEG纳米粒子的结合。使用动态光散射来确定球体的流体动力学体积。
实施例7
通过将纳米粒子芯装载到香豆素6(C6)上来追踪纳米粒子，香豆素6可通过HPLC使用444/538nm的激发和发射波长对来检测。这允许量化纳米粒子的生物分布。C6不会改变粒子的大小或者行为，并且因为C6如此具有疏水性，99％保留在PLGA芯中7天。
实施例8
本公开提供将纳米粒子应用于CNS创伤。基于初步证据，纳米粒子积累于凝块。在CNS创伤情况下，这意味着粒子将位于CNS中血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)已经受损的区域中。
曲安西龙具有帮助控制发炎和封闭血管以及保护神经组织的能力。此外，其递送PLGA粒子。因此使用单一乳液法来囊封乙酸曲安西龙且使用HPLC量化释放。
实施例9
在初步工作中，使用股动脉损伤模型。其为极干净模型，允许简单的评估疗法对出血的影响。为确定纳米粒子在钝器创伤模型中的功效以及获得关于纳米粒子对凝血的机制和影响的关键数据，将肝损伤模型联合用于随时间凝结的评估。
用异氟烷麻醉雄性斯普拉-道来大鼠(Sprague-Dawley rat)。使用加热垫维持动物温度且在整个实验中使用温度探针进行监测。使用动脉导管来测量血压并抽血，且使用静脉导管来施用所测试的药剂。打开腹腔，且随后从距离上腔静脉1.3em处锋利地切下肝的中叶。立即闭合腹腔，且递送实验药剂。
在即将损伤之前、损伤后5分钟和损伤后30分钟抽取血液样品。将动物维持60分钟或者直到死亡。在60分钟结束时，使用预先称重的海绵收集腹腔中的血液以确定失血量。收集所有主要器官用于纳米粒子的组织学和生物分析。
来自这项工作的数据提供关于纳米粒子的功效、安全性和机制的关键信息。如果纳米粒子不显示显著增强止血，那么改变最终肽来增强与活化血小板的结合。
实施例10
在雄性斯普拉-道来大鼠中将控制皮质影响(controlled cortical impact，CCI)模型用于TBI工作。所述CCI模型将生理学上相关的病理性和行为性结果与高度可量化系统组合。随后将严格模型用于冲击深度为2mm的Pittsburg精密冲击器装置。
这一损伤导致显著运动和认知缺陷，其用旋转滚轮(rotorod)测试和莫里斯水迷宫测试(Morris Water Maze test，MWM)量化病并且与组织学结果有关，包括病灶大小、神经胶质增生和阳性神经组织的量。
这项研究确定了纳米粒子如何有效地阻止TBI后的出血，和诱发止血如何影响恢复。
这种方法还提供用于局部递送类固醇的简单施用途径，即静脉内施用。目前递送这些因子的方法集中于植入式泵和导管，因为因子无法穿过血脑屏障，具有短半衰期，并且会引起副作用。然而，CNS中的植入式导管带来危险，尤其是因创伤而受害的患者。
简单施用但有效靶向的系统缓和了与神经营养施用相关的许多递送问题。
实施例11
纳米粒子是由与聚乙二醇(PEG)臂结合的聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚_-L-赖氨酸(PLGA-PLL)嵌段共聚物合成[1]。使用如本文中所述的纳米沉淀法来制造球形纳米粒子。将地塞米松溶解于溶剂中，且还溶解适量聚合物并与药物混合。将药物/聚合物溶液用移液管滴到旋转的1×PBS中。在室温下使所得溶液敞开搅拌约20分钟。在纳米球搅拌硬化后，将pH值调整到3.0-2.7以诱发絮凝作用。发现这一pH值范围适用于发生絮凝作用。通过离心(500g，3分钟，3次)来纯化纳米球，再悬浮于去离子水中，冷冻，并且在冻干机上冻干。通过将10mg纳米球溶解于1mL1×PBS中来进行释放研究，重复一式三份。
通过动态光散射(DLS)确定纳米球的大小。通过扫描电子显微镜(SEM)来确定大小和形态的构象。通过将球体溶解于DMSO中并且在UV-Vis上操作来确定药物量。集合不同时间点的释放研究数据且在UV-Vis上操作以确定地塞米松如何随时间将纳米粒子洗提出来。
实施例12
制备产物的产量和时间已通过确定中间治疗步骤所需的最短时间而显著减小。在沉淀后使用离心收集PLGA-PLL-PEG使得产量显著增加。还可用纳米沉淀纳米粒子形成方法来显著增加产量且如果将聚(丙烯酸)凝聚层沉淀技术用于纳米粒子收集，那么产量甚至会进一步增加。
一旦合成PLGA-PLL-PEG，例如GRGDS的活性肽需要与聚合物偶联。
当使用四嵌段聚合物(PLGA-PLL-PEG-肽)时，球体的产量极低。因为肽是聚合物中最贵的部分，所以采用方法由三嵌段(PLGA-PLL-PEG)形成球体，接着将肽连接于球体本身。
肽与三嵌段纳米粒子结合可产生约50％结合效率(以精氨酸与赖氨酸的比率计算)。
然而，发现在氨基酸分析之前纳米球的额外冲洗步骤导致肽大量丢失，其中结合效率是11％。在为1g批量的纳米球将反应按比例扩大时，结合效率基本上降低到0％。因此，追求一种方法，其将允许制备完整四嵌段聚合物并且以至少类似的产量产生具有紧密大小分布的纳米粒子。
这种方法使得在形成纳米粒子之前制造四嵌段聚合物。四嵌段结合效率为约80％，但在使用利用和不利用聚(丙烯酸)的纳米沉淀技术形成纳米球后降低到13％。最后，通过在即将添加肽之前使聚合物与CDI在DMSO中反应来制备四嵌段。这一步骤使肽结合增加到50％以上(n＝3)。
乳液法
乳液法成功地制备直径介于326-361nm之间的球体。
乳液法在50ml含5％PVA的去离子水中将纳米球搅拌硬化。使用这种方法将纳米球的产生按比例扩大需要大量溶液用于搅拌硬化。这一观察结果结合先前方法在形成离子后添加肽用于结合步骤的事实意味着大量溶液将需要极大量的肽来实现合理的偶联效率。
关于缩减版本的纳米沉淀法，在肽结合的同时在10ml PBS中进行搅拌硬化。这一步骤添加足量肽。纳米沉淀法还借用自身用四嵌段聚合物来形成纳米粒子，从而消除了后制造偶联反应的需求。
关于纳米粒子还存在许多确定的基本问题，包括粒子的均一性、粒子的聚集、再悬浮纳米粒子的难题和冻干后再悬浮的难题。
多个小组已提出许多方法来解决这些难题。举例来说，可在冻干后使用冻干保护剂来再悬浮小纳米粒子。(Sauaia等人，J Trauma38，185(1995))，Champion等人，J Trauma54，S13(2003))。其它小组发现通过纳米沉淀技术结合使用聚(丙烯酸)来絮凝粒子，避免了向溶液添加冻干保护剂的需求。
纳米沉淀
纳米沉淀法使用逐滴添加溶解于水混溶性溶剂(例如乙腈)中的聚合物来制备一致大小的球体(Regel等人，Acta Anaesthesiol Scand Suppl110，71(1997)；Lee等人，Expert Opin Investig Drugs9，457(2000)；Blajchman，Nat Med5，17(1999)；Lee等人，Br J Haematol114，496(2001))。
聚(丙烯酸)凝聚层沉淀
采用这种由(Regel等人(1997)；Kim等人，Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol34，537(2006))改良的方法来增加纳米粒子的产量并且减少如先前所观察到的球体在离心和冻干步骤期间的聚集。沉淀允许＜500g的轻柔离心。
大小再现性迄今为止已显示是优于单独的乳液和纳米沉淀法的优点，其高度依赖于声波处理条件以产生均匀大小分布。SEM图像展示纳米粒子的形态和大小的均匀性。由纳米粒子直径的100次测量结果制作直方图镶嵌并且展示大小分布的中心大约是236.1nm+/-56.6nm。
制备涂有PAA的纳米沉淀的合成血小板的方法
从Evonik Industries购得PLGA(Resomer503H)。从Sigma Aldrich购得聚-1-赖氨酸和PEG(～4600Da MW)。所有试剂都是ACS等级的并且是从Fisher Scientific购得。使用如先前所述(Lavik等人)的标准生物结合技术来制备PLGA-PLL-PEG共嵌段聚合物。
四嵌段结合
将PLGA-PLL-PEG溶解于无水DMSO中达100mg/ml的浓度。添加两摩尔当量的CDI以再活化PEG基团并且搅拌1小时。将25mg寡肽(GRGDS或者GRADSP)溶解于1ml DMSO中并添加到搅拌中的 聚合物溶液中。使这一混合物反应3小时，接着转移到透析管(SpectraPor2kDa MWCO)中。每半小时用I型去离子水更换透析水持续4小时。接着在液氮中将产物急冻并且冻干2天。
纳米沉淀
接着将所得四嵌段共聚物PLGA-PLL-PEG-GRGDS在乙腈中溶解到20mg/ml的浓度。将这一溶液逐滴添加到一定体积的搅拌中的PBS中。一般规则是使用乙腈两倍体积的PBS。当水混溶性溶剂消散时，形成沉淀的纳米粒子。然而，为按比例扩大到量化300mg以上的起始四嵌段，发现用乙腈启动沉淀体积可减少聚集体的自发形成。在整个沉淀过程中调整溶剂∶水比率以使得沉淀体积中最终浓度是2∶1PBS∶乙腈。接着将粒子搅拌硬化持续3小时。接着使用在15000g下离心来收集粒子并且用PBS冲洗3次。可选地，使用凝聚层沉淀法收集粒子。
凝聚层沉淀
将一质量当量的无水聚(丙烯酸)添加到搅拌中的粒子悬浮液中。接着将1％w/v pAA添加到搅拌中的悬浮液中直到发生絮凝作用。在每次添加pAA后停止搅拌片刻以观察絮凝作用。5分钟后，在500g下离心来收集絮凝的粒子并且用1％pAA冲洗3次(在冲洗之间在500g下离心，2m，4C)。在最后冲洗时，用去离子水再悬浮粒子，急冻并冻干2-5天，这取决于水的最终体积。
再悬浮
粒子集结且在1×PBS中再悬浮到20mg/ml的浓度。将粒子涡旋到再悬浮，或者可选地涡旋并且使用探针声波仪(VCX-130，Sonics&Materials，Inc.)在4W下短暂地声波处理到50J的总能量。
实施例13
目前冲突中大部分受伤的爆炸原因占搏斗相关受伤的79％。不受控制的出血是战场创伤中死亡的主要原因。受伤后，通过一系列凝结事件(包括血小板活化)来形成止血。然而，在严重受伤时，这些过程不足并且导致不受控制的出血。立即干预是将与严重创伤相关的死亡率降到最低的最有效方法之一，且在野外的唯一可使用的治疗仍是加压敷裹和可有效用于暴露伤口的吸收性材料，但无法用于内部损伤。需要一种疗法，可在野外由医生施用以对加压敷裹进行补充并阻止出血。
在如上文所述的股动脉损伤模型中本文中所述的纳米粒子使出血时间减半。这些纳米粒子基本上用作合成血小板并且在室温下稳定，且可静脉内施用。因为其可阻止出血，所以在冲击波创伤模型中可用于确定其是否可改善爆炸后的存活率以及保护组织，从而产生较好的功能性结果。
纳米粒子的制备
制造靶向活化血小板的具有聚(乙二醇)(PEG)臂和RGD肽的基于聚(乳酸-共-乙醇酸)的纳米粒子。使用先前所述的方案合成用于合成血小板的PLGA-PLL-PEG-GRGDS或者PLGA-PLL-PEG-GRADSP。将聚合物以20mg/ml的浓度溶解于含有香豆素-6(C6)(一种用于在注射后追踪粒子的荧光染料)(以1％w/w装载)的乙腈中。将这一溶液逐滴添加到两倍于乙腈的体积的搅拌中的PBS中。当替换水混溶性溶剂时形成沉淀的纳米粒子。接着将粒子搅拌硬化3小时。将一质量当量的无水聚(丙烯酸)(pAA)(Sigma，MW＝1,800)添加到搅拌中的粒子悬浮液中。接着将1％w/v pAA添加到搅拌中的悬浮液中直到发生絮凝作用，约10ml。5分钟后，在500g下离心来收集絮凝的粒子并且用1％pAA冲洗3次(在冲洗之间在250g下离心，2分钟，4℃)。在最后冲洗时，用去离子水将粒子再悬浮到约10mg/ml，在液氮中急冻并冻干3天。使用下文所述的凝聚层沉淀法收集粒子。
在20psi下体外使用ROTEM分析和体内在小鼠全身冲击波创伤模型中表征粒子。使用ROTEM′s NATEM测试在生理盐水、结合GRGDS的合成血小板或者纳米粒子对照物结合GRADSP的纳米粒子存在下进行使用斯普拉道来大鼠血液的凝结分析。严格遵循血液收集方法(心脏穿刺)以在高敏感度NATEM测试中将可变性降到最低。根据由凯斯西储大学(Case Western Reserve University)的机构动物管理和使用委员会(institutional animal care and use committee)设定的指导来批准和承担所有动物程序。
在制备纳米粒子的第二种方法中，首先制备聚合物(PLGA-PLL-PEG-GRGDS)，接着成形为纳米球。
动物模型
如下产生一种冲击波创伤损伤模型。使用安置好的定制冲机管(custom-built shock tube)来诱发冲击波超压。将麦拉片(Mylar sheet)放在压力室和管之间以达到峰值压力。在爆震后，将使用与冲击波压力来源轴向放置的的压电传感器(型号137A22自由场ICP冲击波压力传感器，PCB Piezotronics)测量压力相对于时间特征曲线。将一个传感器(型号1022A06ICP动态压力传感器，PCB Piezotronics)安装在垂直于诱发的压力波安置的螺纹式管内沟渠中，还将测量诱发的压力时间特征曲线。与数字数据获取系统类似的便携式类似物(型号DASH8HF，Astro-Med Inc.)在每个频道250kHz下从所有压力转换器收集数据。
在爆震之前，用氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(xylazine)溶液麻醉两只小鼠。当在麻醉时对小鼠称重，接着使用电动剃须刀、随后用直边式剃须刀给右后肢剃毛，以收集对冲击波的生理学反应。将麻醉的动物放在加热垫上。将大腿夹传感器放在剃过毛的后肢上，将所述大腿夹传感器连接于MouseOx生理学监测系统。在注射麻醉剂后20分钟内监测小鼠，接着放在定制约束带中(图1)并且暴露于全身冲击波。
在爆震之后，移出动物，返回温热垫，且再施加大腿夹以在一小时评估期期间进行监测。使用MouseOx系统收集若干种生理学参数，例如心率、呼吸频率、氧饱和度、脉冲扩张幅度和呼吸扩张幅度。在10分钟冲击波内，通过尾静脉静脉内施用处理物(合成血小板，50ul20mg/ml乳酸林格氏(Lactated Ringers)溶液；纳米粒子对照物，GRADSP-粒子，50ul20mg/ml乳酸林格氏溶液；NovoSeven，50ul；乳酸林格氏溶液，50ul；或者不处理)。
如果动物在一小时评估前死亡，那么迅速收集组织用于组织学分析。如果动物在一小时评估后存活，那么过量给予其氯胺酮/甲苯噻嗪且如下文所述用4％多聚甲醛灌注，接着收集组织用于组织学评估。使一小组动物存活至多损伤后3周以确定急性期存活率是否与长期存活率有关并且查看是否存在与施用合成血小板或者纳米粒子对照物相关的并发症。
进行冲击波创伤的人员和施用处理物的人员对处理不知情，且死亡独立地由对处理也不知情的人员记录。包括无注射组(n＝3)作为参照，但不包括在统计学中。在优势比之间用二项逻辑回归以卡方检验(chi-squared test)(SAS)分析存活率。
在可施用合成血小板或者对照物之前，必须验证小鼠冲击波模型。通过使动物暴露于15PSI爆震来开始致死率研究。来自这一组的所有小鼠都在一小时评估后存活。因此，增加超压且使第二组小鼠暴露于20PSI压力。在这水平上，确定出40％致死率。使第三组动物暴露于25PSI超压且我们发现90％的动物在爆震后第一小时内死亡。
生理学参数显示暴露于较高压力的动物的一致性展现健康状况的下降。发现暴露于25PSI超压的小鼠与所有其它组相比具有最低氧饱和度水平。
通过使用肺的仅伊红(eosin)染色切片来量化肺损伤程度。对每个 肺组织切片中的三个关注区域(ROI)采集图像。伊红是对带正电组织染色的带负电分子。具体来说，它将红细胞染成独特的亮红色，使其容易地与周围组织区分开并且提供表征肺内出血程度的简单方法。
将这三个伊红图像转变成黑色和白色且收集光学密度读数以确定肺组织中的出血程度。在计算受损区域百分比后，确定显著性并且以平均值±SEM报导。具体来说，在20psi下肺损伤显著增加。这一观察结果与生理学发现以及冲击波模型的致死率良好相关，且基于这一情况，我们确定20psi超压将适合用于测试合成血小板对冲击波损伤后的存活率的影响。
分析
暴露于20psi后一小时，通过用生理盐水(0.9％氯化钠)、随后用含有4％甲醛的固定剂溶液经贲门灌注来处死存活动物。收集所有主要器官(肺、脑、肾、肝、GI)且贮存于含有15％蔗糖的固定剂溶液中。48小时后，将肺放在OCT包埋介质中且使其在干冰上冷冻。随后切割样品且用苏木素(hematoxylin)和伊红(H&E)以及‘仅伊红’染色。使用仅伊红切片量化肺损伤。对每个肺组织切片的三个关注区域(ROI)采集图像。使用Image J软件(NIH)将图像转变成灰色标度且收集光学密度读数以确定肺组织内的出血水平。图1说明如何分析每个切片的一个实施例。在计算受损区域百分比后，确定显著性并且以平均值±SD报导。用双因子ANOVA、随后用事后LSD测试来计算组织学统计分析，其中以p＜0.05实现显著性。
收货肝、肾、脾、肺和脑并且冻干用于生物分布分析。记录整个器官的干重且使100-200mg干组织均质化(Precellys24)并且在37C下在乙腈中培育过夜。这一溶液溶解组织中存在的任何合成血小板并且将C6留在有机溶剂溶液中。接着在15,000g下将试管离心10分钟以除去固体物质且在HPLC上测试上清液。移动相是80％乙腈和20％水溶液(8％乙酸)。固定相是Waters Symmetry C18管住，，5μm， 3.9mm×150mm。稀释在荧光检测器(450/490nm ex/em)上过饱和的样品并且再次过柱。基于已知C6负载和粒子注射体积，以注射粒子％表示数据。
使用ROTEM′s NATEM测试在生理盐水、结合GRGDS的合成血小板或者纳米粒子对照物结合GRADSP的纳米粒子存在下进行使用斯普拉道来大鼠血液的凝结分析。严格遵循血液收集方法(心脏穿刺)以在高敏感度NATEM测试中将可变性降到最低。根据由凯斯西储大学的机构动物管理和使用委员会设定的指导来批准和承担所有动物程序所有动物。
给5ml注射器装载在1×PBS中制备的0.5ml3.8％柠檬酸二钠。用氯胺酮∶甲苯噻嗪啮齿动物混合物(90∶10mg/kg，i.p.)麻醉大鼠且触诊心跳。接着慢慢推进针头，同时抽吸直到发生寒颤。收集4.5ml血液以与抗凝血剂溶液以1∶9比率(溶液∶血液)混合。对于既定操作，一杯血液由300μl含柠檬酸血液、20μl starTEM试剂(0.2mM氯化钙)、20μl合成血小板(1.25或者2.5mg/ml)组成，总共340μl样品。为说明对凝结测试的时间依赖性，创建实验设计以使得同时对单一～1.2cc血液试样进行一批4个NATEM测试，其中总是包括生理盐水作为四个测试之一以允许进行直接比较。主要分析结果是如由ROTEM定义的凝血时间、凝块形成时间和最大凝块硬度。使用一般化线性模型分析原始数据，其中操作时间呈区组形式且组间进行杜凯氏比较(Tukey comparison)。主要考虑结果包括标准ROTEM参数凝血时间(CT)、凝块形成时间(CFT)、两者之和(CT+CFT)和最大凝块硬度(MCF)。CT是定义为开始分析直到检测到最初凝血(厚度＝2mm)的时间。CFT是定义为初始凝块(厚度＝2mm)直到检测到20mm凝块厚度之间的时间。MCF是定义为凝块在测试持续时间期间达到的最大厚度(以mm计)。
结果
在暴露于20psi冲击波和施用的合成血小板的21只动物的这些结果中，仅一只动物在一小时时间点之前死亡。这一结果显著好于无注射对照组。在优势比之间用二项逻辑回归以卡方检验(SAS)分析存活率。合成血小板相对于无注射的优势比是13.3，其中95％置信区间是1.24到143。
在使用合成血小板的早期工作中，使用非存活模型。在这项工作中，在纳米粒子对照物和合成血小板组(每组n＝7)中维持动物至多冲击后3周。在合成血小板3周组中仅一只动物在1小时后死亡，且死亡显示无来自粒子施用的并发症征兆，例如喘气、中风之征兆或者被阻塞血管的其它征兆。更确切地说，动物变弱并且在损伤后一天时施以安乐死。纳米粒子对照组中的两只动物无法存活到3周时间点。
对照组和处理组的初步组织学分析说明活性合成血小板处理组具有较低肺损伤程度。20μg/ml浓度导致与混杂血小板和NovoSeven(其为目前用于出血的临床治疗方法)相比损伤程度降低。肺损伤数据中的趋势与存活率数据良好相关，其中损伤减少(红细胞)与在合成血小板组中所见的存活率增加有关。
在冲击波后1小时时合成血小板和纳米粒子对照物的生物分布(n＝3)说明粒子遍及各组织，其中最大百分比在肺、脾和肝中。在纳米粒子对照组中，约10％是在每一片肺中。在合成血小板组中百分比较低，但用于这项工作的n仍较低且当研究继续时，将会感有趣的是观察是否继续是少量或者数字与对照物一致。在假装(未受冲击波)小鼠中合成血小板或者纳米粒子对照物的生物分布互相类似。
与单独血液或者生理盐水相比，使用合成血小板缩短了凝血时间加凝块形成时间(n＝2)。用于这项研究的剂量是1.25mg/ml，其与用于冲击波模型的20mg/ml良好相关。与仅血液对照物相比，添加生理盐水似乎实际上减少凝血时间，表明这一添加可活化凝结级联反应，然而，n较低且研究必须进一步进行证实。(对于这一数据来说p＝0.4， 其中n＝2)。
剪切模数强度似乎概括了仅血液凝块的剪切模数强度(p＝0.76)。纳米粒子对照物似乎降低剪切模数强度，表明无活性肽纳米粒子可能会破坏凝块形成，其可说明在纳米粒子对照物的情况下致死率略微增加的原因。
基于与这项工作有关的发现，开始大型动物(猪)肝损伤研究。初步数据表明在大型动物模型中合成血小板减少血液损失且用于猪的剂量远低于(低至每只猪3mg)预期剂量。对于大鼠来说，三嵌段的最佳剂量是20mg/ml(注射0.5ml合成血小板。)对于四嵌段形式，其为2.5mg/ml(施用0.5ml。)
实施例14
许多小组已在一些承诺和一系列挑战下研究了静脉内施用靶向活化血小板的止血纳米粒子。称作血栓红细胞的结合RGD的红细胞(RBC)显示了体外承诺，但在血小板减少的灵长类中并不显著缩短延长的出血时间。其他人所用的带有纤维蛋白原γ链十二肽(HHLGGAKQAGDV)的涂有纤维蛋白原的白蛋白、“合成细胞(Synthocyte)”和脂质体在出血模型中的血小板减少的兔子中显示成功。然而，合成细胞可有效治疗正常兔子的出血，且脂质体似乎尚未研究用于这一目的。
从这项工作可看出，若干事情水落石出。首先，如果粒子太大或者带有免疫原性材料，那么其可能会触发非特异性血栓形成。因为凝结系统如此复杂，所以使用具有功能导向结果的多个出血模型(和类别)配合体外研究来全面评估潜在疗法，如在一组用于血小板代替物21的公开指导中被FDA认可。血栓前可能性、免疫原性和由添加剂引起的毒性是安全标准，且功效标准是基于一系列体内和体外测试。
纳米粒子制备
使用逐步结合反应，以PLGA(Resomer50311)和具有经苄氧羰基保护的侧胺侧基的聚(E-cbz-L-赖氨酸)(PLL-cbz)PLL(Sigma P4510)作为起始物质来合成PLGA-PLL-PEG三嵌段聚合物。使用UV-Vis证实这一结合反应以检查对应于cbz基团的明显三峰。用HBr脱除PLGA-PLL-cbz的保护基后，使PLL-NH3上的游离胺与CDI活化PEG以5∶1摩尔过量反应。将结合的三嵌段共聚物PLGA-PLL-PEG(具有CDI活化PEG端基)在含有香豆素-6(C6)(一种用于在注射后追踪粒子的荧光染料)(以1％w/w装载)的乙腈中溶解到20mg/ml的浓度。将这一溶液逐滴添加到两倍于乙腈的体积的搅拌中的PBS中。当替换水混溶性溶剂时形成沉淀的纳米粒子。接着将纳米粒子与GRGDS或者经保守取代的GRADSP肽结合并且在单一步骤中搅拌硬化3小时。接着使用下文所述的凝聚层沉淀方法收集纳米粒子。
将一质量当量的无水聚(丙烯酸)(pAA)(Sigma，MW＝1,800)添加到搅拌中的粒子悬浮液中。接着将pAA的1％w/v溶液添加到搅拌中的悬浮液中直到发生絮凝作用，约10ml。5分钟后，通过离心来收集絮凝的纳米粒子并且冲洗3次。用去离子水将粒子再悬浮到约10mg/ml，在液氮中急冻并冻干3天。在1×PBS中将纳米粒子再悬浮到20mg/ml的浓度并且简单地进行声波处理(VCX-130，Sonics&Materials，Inc.)。
使用动态光散射(90Plus，Brookhaven Instruments Comoration)和扫描电子显微术(Hitachi S4500)来表征纳米粒子的大小分布和多分散性。以如通过90Plus软件计算的有效直径表示DLS数据。在ImageJ软件中分析SEM图像。使用UV-光谱学、1H-NMR和氨基酸分析HPLC(分别是BioRad、Varian和Shimadzu)来证实PLL、PEG和肽配体的成功结合。用氯仿来进行1H-NMR以用于分析三嵌段结构且用氘化的水证实PEG冠状壳27。由凯克基础生物技术资源实验室(W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory)(New Haven，CT)进行氨基酸分析。
凝结分析
如上文所述使用斯普拉道来大鼠血液进行凝结分析。
体内肝损伤模型
为了评估纳米粒子在致命损伤模型中增强存活的功效，肝损伤模型是从Ryan等人28和Holcomb等人29修改而来并且如下文所述。根据由凯斯西储大学的机构动物管理和使用委员会设定的指导来批准和承担损伤模型。关于这项研究所记录的主要结果包括1小时存活率和如用预称重纱布测量的血液损失。
用腹腔内氯胺酮∶甲苯噻嗪(分别是90∶10mg/kg)麻醉用手术程序斯普拉道来大鼠(225-275g，Charles River)。10分钟后，帮其剃毛并且以仰卧姿势放在加热垫上。使用腹部且使用手持式烧灼器以距离肝上下腔静脉拱半径1.3cm标出肝的内侧叶。一旦标出后，暴露尾静脉，且插入用生理盐水冲洗的24G×3/4″Excel Safelet导管。接着沿标出的线肝内侧叶切除，用缝合夹闭合腹部，且立即施用0.5cc快速处理溶液，随后进行0.2cc生理盐水冲洗以清洁导管死角。
使大鼠出血1小时或者直到死亡，如通过缺乏呼吸和可触知的心跳所确定。在测量血液损失之前，给所有大鼠注射致死量的戊巴比妥钠(i.V.)。接着再打开腹部且用预称重的纱布收集血液。最后收集附着于肝的凝块，因为这经常引起额外出血。对切除的肝称重并且用10％缓冲福尔马林(formalin)溶液固定。收货剩下的肝、肾、脾、肺和粘着凝块并且类似地保存于10％缓冲福尔马林中。
程序和统计学
处理包括无注射(n＝3)、生理盐水(n＝17)、混杂NP(n＝15)和止血GRGDS-NP(n＝20)。将粒子处理物在PBS中再悬浮到20mg/ml。外科医生对处理不知情且所有血液损失测量和死亡都独立地由对处理也不知情的第二个人记录。包括无注射组(n＝3)作为参照，但不包括在 统计学中。使用利用杜凯氏比较的ANOVA来分析血液损失数据(Minitab)。在优势比之间用二项逻辑回归以卡方检验(SAS)分析存活率。基于初步研究的功效分析建议对于存活率数据的显著性来说每组n＝15(α＝0.05，β＝0.2，优势比＝3)。
生物分布
收货肝、肾、脾、肺和粘着凝块并且冻干用于生物分布分析。记录整个器官的干重并且使100-200mg干组织均质化(Precellys24)并且在37C下在乙腈中培育过夜。这一溶液溶解组织中存在的任何纳米粒子并且将C6留在有机溶剂溶液中。接着在15,000g下将试管离心10分钟以除去固体物质且在HPLC上测试上清液。移动相是80％乙腈和20％水溶液(8％乙酸)。固定相是Waters Symmetry C18管柱，100A，5gm，3.9mm×150mm，荧光检测(450/490nm ex/em)。基于已知C6负载和粒子注射体积，以注射粒子百分数(％)表示数据。冲洗成像损伤表面和肝的粘着凝块切除部分并且直接放在高分辨率(1200dpi)平板扫描仪(Cannon CanoScan LiDE700F)中以使损伤表面成像。10％福尔马林固定仍连接于肝的粘着凝块，在蔗糖中浸泡过夜，冷冻并且低温切片成20微米的厚度。接着用VectaShield DAPI将切片染色以使肝细胞核染色并且用倒立式荧光显微镜(Zeiss Axio Observer.Z1)成像。将每组数个凝块固定在10％福尔马林中，并且在连续步骤中用乙醇脱水以使其准备用扫描ACS Paragon加环境电子显微镜(Environment electron microscope，SEM)进行成像。接着在无水六甲基二硅烷胺中将这些凝块干燥过夜并且进行溅射涂布。准备样品且用Hitachi S4500场致发射SEM在5kx放大倍数下成像。
结果
粒子合成和表征，按照Bertram等人22′23′313，使用逐步结合反应，以PLGA(Resomer503H)和具有经苄氧羰基保护的侧胺侧基的聚(E-cbz-L-赖氨酸)PLL作为起始物质来合成PLGA-PLL-PEG三嵌段 聚合物。这一步骤的结合效率为约30-40％摩尔比PLL∶PLGA，如通过UV-vis所确定。脱除侧基的保护基后，使PLL上的游离胺与CDI活化PEG反应。这种PEG在纳米粒子周围形成亲水性外壳，使其在血液循环中具有较长停留时间。在氘化氯仿和氘化水中进行11-1-NMR以验证预期的表面聚乙二醇化结构。从光谱可见，聚乙二醇化百分比计算为1∶10(PEG∶PLGA)摩尔比。在氘化水中，PEG峰值与其它峰值相比大得多且证实纳米粒子在水性环境中的PEG冠状结构。纳米粒子芯的大小和分布(通过SEM)和在水性环境中的大小和分布(通过DLS)分布均匀地分布在400nm和420nm附近。从SEM到DLS的大小增加可通过由PEG臂形成的水合壳来说明原因。似乎由于装载C6(约5-10％)而大小略微增加，其中大小无显著变化取决于结合的GRGDS或者GRADSP肽。
体内损伤模型研发，在内侧叶损伤后，施用大鼠生理盐水、混杂(GRADSP)或者止血(结合GRGDS)纳米粒子。使用生理盐水作为基线对照物，因为施用流体会影响出血。基于我们的初步结果，我们发现切除的肝质量和体重与出血结果良好相关，且类似于Holcomb等人29，我们选择严格遵守大鼠体重(225-275g)和肝切除(体重的0.8-1.2％)的入选标准。在研究结束时，发现这一入选标准降低大鼠间基于体重的可变性。然而，肝切除质量仍与出血结果显著相关(p＝0.0004)。当在ANOVA模型中包括切除的肝质量和处理时，处理仍与出血结果不显著相关(p＝0.113)。
这项工作的最关键之一在于确定施用纳米粒子是否使得钝器创伤损伤后的存活率得到改善。施用止血GRGDS纳米粒子显著改善致命肝损伤后的存活率。具体来说，GRGDS-NP使存活几率增加到80％。将这与生理盐水组中的47％(p＝0.040，优势比(OR)＝4.5，95％CI1.1-19.2)和混杂-NP组中的40％(p＝0.019，OR＝6，95％CI1.3-27.0)相比较。施用GRGDS-NP几乎是来自这一致命损伤的存活机会的两倍。血液损失，我们从我们先前工作22已知GRGDS-NP减少出血。在这项工作中，我们通过用于在实验结束时吸收体腔中的血液的纱布重量 变化来测量血液损失。这种方法给出血液损失数据，但缺乏先前研究中允许的好的解决方法。在这一模型中测量总血液损失因存活时间的影响而变复杂。血液损失率可能是这一模型的存活率的较好指标，但因为损伤模型是维持在大鼠的小封闭空腔中，所以血液损失无法动态地测量。尽管如此，我们却发现血液损失的趋势，其与使用展现最少血液损失的GRGDS-NP的存活率相关。这一血液损失减少趋势在统计学上并不显著(13＝0.0552)，但却表明了GRGDS-NP正通过减轻出血来改善存活率。还似乎在35％血液量损失附近存在关键临界阈值，该值以上死亡率的比例快速增加。
使损伤表面成像
为帮助验证我们的GRGDS-NP正靶向损伤部位，并且在凝块中积累，我们使用若干种方法使损伤表面成像，包括荧光显微术和SEM。在损伤表面中发现载有荧光化合物香豆素-6(C6)的纳米粒子，其与凝块成为一体。也使用平板扫描仪帮助描绘损伤性质来表征损伤表面。从在模型研发中损伤的目视观察结果可见，显然大部分出血是因在内侧叶损伤中横切的2-4个主血管而发生的。
生物分布
对于GRGDS-NP，31.1％的注射剂量见于凝块中，相对于混杂-NP组仅为6.8％。凝块和测试器官之间的纳米粒子的总回收率对于GRGDS-NP和混杂-NP组分别是53.7％和29.6％；未回收的比例最可能位于流出的血液中，未主动参与凝块，或者残余在血浆循环中。在每组的肺中发现相对大百分比的纳米粒子，20.8％和20.6％(分别是GRGDS和混杂)，且在其它测试器官中发现小百分比(＜2％)。
体外凝结模型
使用旋转式血栓弹力测定法(rotational thromboelastometry，ROTEM)对柠檬酸化大鼠进行给药研究。在这一分析中，在即将开始 分析之前将20ill体积的含有不同浓度的纳米粒子的PBS添加到300ill体积的血液中。除生理盐水以外，对于GRGDS和混杂纳米粒子组，所测试的纳米粒子的浓度包括0.625、1.25、2.5、5.0和20mg/ml。在混杂组中所测试的所有浓度中，与生理盐水相比，CT+CFT增加且MCF降低。在GRGDS-NP1.25和2.5mg/ml浓度中，MCF增加。类似地，在1.25mg/ml和5.0mg/ml组中凝血时间减少，但在其它情况下却增加。这表明当用纳米粒子以最佳剂量(在血液中约73.5-294gg/ml或者对于250g雄性大鼠为5.2-20mg/kg剂量，假设68.6ml/kg血液体积32)处理时，凝块形成更快和更厚。
进一步研究1.25和2.5mg/ml浓度，因为这些浓度对凝血参数具有最有利影响。使用随机化区组实验方法，其中生理盐水作为每个测试区组的对照物。2.5mg/ml GRGDS-NP剂量与生理盐水对照物相比显著缩短凝血时间(p＝0.0437)并且倾向于增加MCF，但差异并不显著(n＝3只大鼠，其中每个处理剂量水平测量一式三份)。2.5mg/mlGRGDS-NP剂量与生理盐水对照物相比显著缩短凝血时间(p＝0.0437)并且倾向于增加MCF，但统计学上并不显著。有趣的是，混杂-NP组也似乎会缩短凝血时间并且增加MCF，，但差异并不显著不同于生理盐水或者GRGDS处理。
施用止血纳米粒子增加1小时存活率，早期干预对改善创伤后存活机会至关重要，且我们在这项工作中观察到早期干预的作用。对于所有测试组，存在20分钟的窗，随后改善存活几率，以及约35％血液量的临界血液体积损失，在这以下存活95％的大鼠。
与对照物相比，在施用止血纳米粒子情况下，接近两倍多的大鼠存活一小时。这一结果在统计学上显著并且在临床上极好。我们先前已观察到这些止血纳米粒子在室温下稳定并且在控制损伤模型中减少出血，但主要问题之一是在致命出血创伤模型中血液损失的这一减少是否将影响存活率。肝损伤模型是领域中再现性和可比性最好的模型28′29′33。在GRGDS-NP情况下观察到存活率几乎增加两倍证实 了其不仅减少出血，而且在临界院前窗内影响存活率的水平下也如此。
与混杂-NP组相比，在粘着肝凝块中发现高4.5倍量的GRGDS-NP，其中在肾、脾和未损伤肝中发现极少量的纳米粒子，从而证实其损伤靶向能力。不管处理组，在肺中发现接近20％的注射纳米粒子。虽然由于在收集时肺灌注仍存在于器官中而预期肺中一定基础水平的纳米粒子，但先前对天然大鼠的研究估计这种情况仅占注射剂量22的5-10％。这些发现可表明纳米粒子会积累在肺中的血栓性栓塞中，与这种损伤模型34的大规模出血性质相伴发生。然而，特别有趣的是注意到存活率似乎未收到伤害性影响，而是恰恰相反。因此，有理由认为这些血栓也存在于生理盐水对照物中，并且可能以可能无任何临床呈现的微血栓形式存在34′35。将来的研究可能目标在于评估肺中粒子聚集的危险和确定其具有何功能性影响，例如通过监测肺灌注、组织氧化或者血液气体水平。易于静脉内施用这些纳米粒子结合其有效损伤靶向而无有害功能性结果良好地实现用于将这种疗法转移到急诊室。
在功能化处理相对于对照物的情况下观察到血液损失减少趋势。然而，用于在大鼠创伤模型中收集血液的方法有限，且敏感度充其量只能说是中等。因此，不足为奇的是可以解决在这统计显著性方面组间无差异。虽然这一模型对血液损失差异并不极度敏感，血液损失趋势与存活率结果良好相关，这是这项研究的关键所在。
纳米粒子对凝血时间的作用具有剂量依赖性且所测试的有效剂量是2.5mg/ml组，对应于147μg/ml的血液浓度(粒子质量/血液体积)。基于纳米粒子缩短凝血时间并且倾向于增加凝块硬度的体外发现，假设为增加存活率，更快速凝块形成和凝块强度增加使得血液损失减少和存活。