具有人工内共生生物的宿主细胞
相关申请案的交叉参考
本发明主张2012年1月13日申请的标题为“具有人工内共生生物的宿主细胞(HOST CELLS WITH ARTIFICIAL ENDOSYMBIONTS)”的美国专利申请案第13/374,799号的优先权益，其全部揭示内容出于所有目的全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及内共生、人工内共生生物和趋磁细菌领域。具体来说，本发明提供单细胞生物体(例如包括趋磁细菌的人工内共生生物)、用作那些单细胞生物体的宿主的真核细胞以及将所述单细胞生物体引入所述真核细胞中的方法。
背景技术
线粒体、叶绿体和其它膜结合细胞器增加真核细胞的可遗传功能性，例如光合作用。相信所述细胞器(通过其退化环状DNA所鉴别)可以内共生方式取得。
细菌与众多种各种真核细胞中不存在的功能性共存。例如，在1975年，布莱克莫尔(Blakemore)鉴别沿地磁场定向并浮动的趋磁细菌(MTB)。(布莱克莫尔,R.趋磁细菌(Magnetotactic bacteria.)科学(Science)24:377-379(1975)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。这些趋磁细菌产生称为磁小体的磁性结构，其由脂质膜包封的磁铁矿(Fe3O4)或硫复铁矿(Fe3S4)组成。(同一文献)。自从首次发现MTB物种起，已鉴别大量MTB物种。(同一文献)。
趋磁细菌已用于选择性结合到并分离物质。(美国专利第4,677,067号(其出于所有目的全文以引用方式并入))。另外，已尝试通过外部标签为细胞增加磁性功能性。(斯维斯顿,A.J.(Swiston,A.J.)、程,C(Cheng,C)、宋,H.U.(Soong,H.U.)、欧文,D.J.(Irvine,D.J.)、科恩,R.J.(Cohen,R.J.)、鲁布纳,M.F.(Rubner,M.F.)用多层贴片对活细胞进行表面功能化(Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches).纳米快报(Nano Lett.)8(12):4446-53(2008)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。细菌磁铁矿也已通过细胞融合引入红血细胞中(松永,T.(Matsunaga,T.)、神谷,S.(Kamiya,S.)(1988)，渥美,K. (Atsumi,K.)、小谷,M.(Kotani,M.)、上野,S.(Ueno,S.)、卡蒂拉T.(Katila T.)、威廉姆森,S.J.(Williamsen,S.J.)(编辑)第6届国际生物磁学会议(6th International Conference on Biomagnetisms)(1987).东京电机大学出版社(Tokyo Denki University Press)，东京，第50-51页(其出于所有目的全文以引用方式并入))，且MTB已通过吞噬作用引入粒细胞和单核细胞中。(松永,T.、桥本,K.(Hashimoto,K.)、中村,N.(Nakamura,N.)、中村,K.、桥本,S.白血球对细菌磁铁矿的吞噬作用(Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes).应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)31(4):401-405(1989)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。然而，这些改变都不可遗传给子代细胞。
本发明的目标是提供含有单细胞生物体的真核细胞，所述单细胞生物体是通过人类干预引入真核细胞中，其经过至少五次细胞分裂转移到真核细胞的子代细胞中且其在子代细胞中维持足够拷贝数，从而使得在子代细胞中维持通过单细胞生物体引入的所需功能性。本发明的另一目标是提供含有可遗传给子代细胞的人工内共生生物的真核宿主细胞。本发明的另一目标是提供将人工内共生生物引入真核宿主细胞的胞质溶胶中的方法。本发明的另一目标是提供具有可遗传磁性表型的真核细胞。
发明内容
本发明涉及包含单细胞生物体(例如人工内共生生物)的真核细胞和将所述单细胞生物体引入真核细胞中的方法。在一个实施例中，单细胞生物体为真核细胞提供所需功能性。在一个实施例中，单细胞生物体是可遗传给子代细胞的人工内共生生物。在另一实施例中，人工内共生生物是趋磁细菌。在一个实施例中，趋磁细菌为真核细胞提供磁性功能性。本发明人工内共生生物可通过使至少一个基因发生缺失、添加和/或突变来修饰，人工内共生生物藉此获得可用于内共生或向生体性的性状。人工内共生生物中要发生突变、添加和/或缺失的基因可为编码鞭毛组合件的组份的基因和编码用于合成必需高分子(例如氨基酸、核苷酸、维生素和辅因子)的酶的基因。在某些实施例中，MTB可经进一步修饰以表达抗生素抗性基因或其它可选择标记。
在一些实施例中，本发明真核细胞是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、人类、猪、牛或犬。在另一实施例中，将人工内共生生物从宿主细胞传递到子代宿主细胞中。在另一实施例中，所述方法进一步包含使真核细胞中的至少一个基因发生缺失、插入和/或突变。
可通过所属领域技术人员已知的多种方法将本发明单细胞生物体引入真核细胞中，所述方法包括(但不限于)微注射、天然吞噬作用、诱导吞噬作用、巨胞饮作用、其它细胞内化过程、脂质体融合、红细胞血影融合或电穿孔。
附图说明
图1显示在gfp+AMB的最高约108MTB/mL的对数级浓度中用T1脉冲序列生成的正反差，所述gfp+AMB使用1.5T仪器悬浮于琼脂塞中以优化并表征成像性质。
图2显示在2细胞胚胎期其两个细胞中的一个已经gfp+AMB微注射的囊胚期小鼠胚胎。胚胎是用Leica SP2 AOBS光谱型共焦倒置显微镜来成像，周围是用于活细胞成像的环境控制室，且使用20×的0.7NA物镜和3×光学变焦。图A显示微分干涉差(DIC)图像且图B显示同一图像的灰度荧光捕获。
图3显示如通过共焦显微术所测量，4个小鼠胚胎的总胚胎GFP荧光随时间的变化。来自2细胞期的每一胚胎的两个细胞中的一个已经gfp+AMB微注射，且每一胚胎的总GFP荧光是在8细胞期在微注射后24小时开始测量。
具体实施方式
本发明是以实例性方式而不是限制性方式来阐释。应注意，在本揭示内容中提到“一(an)”或“一(one)”或“一些”实施例时，不一定是指同一实施例，且所有所述说法意指至少一。
本发明涉及含有单细胞生物体的真核细胞(例如在宿主细胞的胞质溶胶中含有人工内共生生物的宿主细胞)和将单细胞生物体引入真核细胞中的方法。在一个实施例中，单细胞生物体是经遗传改变的人工内共生生物。在一些实施例中，单细胞生物体是趋磁细菌(MTB)。
定义
如本文所用术语“AMB”是指趋磁螺菌(Magnetospirillum magneticum)菌株AMB-1。
如本文所用术语“人工内共生生物”是指通过人类干预引入或已引入真核细胞的胞质溶胶中的单细胞生物体，其经过至少五次细胞分裂已转移到或可转移到真核细胞的子代细胞中，且其在子代细胞中维持足够拷贝数以使得在子代细胞中维持通过人工内共生生物引入的表型。
如本文所用术语“细胞生命周期”是指涉及真核细胞的生长、复制和分裂的系列事 件。将其分为5个时期，称为G0(其中细胞休眠)、G1和G2(其中细胞大小增加)、S(其中细胞使其DNA加倍)和M(其中细胞经历有丝分裂和分裂)。
如本文所用术语“胞质溶胶”是指细胞质中不在细胞的膜结合子结构内的部分。
如本文所用术语“子代细胞”是指通过细胞分裂形成的细胞。
如本文所用术语“必需分子”是指宿主细胞生长或存活所需的分子。
如本文所用术语“遗传修饰”是指改变细胞的DNA以使得改变细胞的所需性质或特征。
如本文所用术语“宿主细胞”是指其中可留存人工内共生生物的真核细胞。
如本文所用术语“脂质体介导的”是指由包封在一或多个脂质层中的水性核组成的人工微型囊泡，其用于将人工内共生生物输送到宿主细胞。
如本文所用术语“磁小体”是指由鞘或膜包封的呈个别颗粒或呈颗粒链形式的磁铁矿(即，Fe3O4)或硫复铁矿(Fe3S4)颗粒。
如本文所用术语“趋磁细菌”或“MTB”是指具有编码磁小体的基因的细菌。
如本文所用术语“哺乳动物”是指温血脊椎动物，其都具有毛发且给其幼体哺乳。
如本文所用术语“微注射”是指将人工内共生生物注射到宿主细胞中。
如本文所用术语“加标签的人工内共生生物”是指在内共生生物表面上具有配体的人工内共生生物。
如本文所用术语“亲代细胞”是指分裂形成两个或更多个子代细胞的细胞。
如本文所用术语“受体介导的”是指宿主细胞表面上与人工内共生生物或加标签的人工内共生生物结合，之后内化所述人工内共生生物的分子结构或位点。
人工内共生生物
本发明单细胞生物体包括能在真核细胞中存活并维持拷贝数，以使得在子代细胞中维持通过单细胞生物体引入的表型的细菌。在一些实施例中，单细胞生物体在没有进一步人类干预的情况下不杀灭真核宿主细胞。在一些实施例中，单细胞生物体具有真核细胞在引入所述单细胞生物体后获得的功能性。在一些实施例中，单细胞生物体的功能性是磁性、产生养分、脱盐、光合作用或对严苛环境挑战的耐受性。磁性包括抗磁性和顺磁性。在一些实施例中，真核细胞将功能性维持至少48小时。在一些实施例中，单细胞生物体可在真核子代细胞中经过至少3次细胞分裂、或至少4次分裂、或至少5次分裂、或至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次细胞分裂稳定维持表型。在另一实施例中，单细胞生物体可在真核子代细胞中经过3-5次分裂、或5-10次分裂、或10-15次分裂、或15-20次分裂稳定维持表型。
在本发明实施例中，本发明单细胞生物体经遗传修饰。用于对细菌进行遗传修饰的方法为业内所熟知。通常，将对细菌进行遗传修饰以改良其在真核宿主细胞中的存活，和/或降低单细胞生物体对真核细胞的毒性，和/或为真核细胞提供有用表型。在一个实施例中，单细胞生物体的鞭毛蛋白质经修饰以使得单细胞生物体不再于真核宿主细胞中表达鞭毛蛋白质。在另一实施例中，单细胞生物体经修饰以使得其可不再合成必需分子，而优选地由真核宿主细胞提供。在实施例中，单细胞生物体经遗传修饰以使得其细胞周期与真核宿主细胞的细胞周期协调，从而使得单细胞生物体可将拷贝数维持在足够水平以将表型传递到子代细胞。
本发明实施例包括单细胞生物体，其为蛋白菌(Proteobacteria)。本发明实施例包括单细胞生物体，其为α-蛋白菌。在当前基于16S rRNA的分类方案中，α-蛋白菌公认为蛋白菌门内的一纲，且被细分为7个主要亚群或目(柄杆菌目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红细菌目(Rhodobacterales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、立克次体目(Rickettsiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)和短小盒菌目(Parvularculales))。(古普塔,R.S.(Gupta,R.S.)α蛋白菌和其主群的系统发育基因组学和标志蛋白质(Phylogenomics and signature proteins for the alpha Proteobacteria and its main groups)生物医学中心微生物学(BMC Microbiology),7:106(2007)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。
已对包括α-蛋白菌内的所有主群的大量α-蛋白菌基因组进行测序，从而提供可用于鉴别α-蛋白菌内作为不同高级分类群(例如科、目等)的特色性特征的独特基因或蛋白质集合的信息(同一文献(其出于所有目的全文以引用方式并入))。
本发明实施例包括单细胞生物体，其为趋磁细菌(“MTB”)。自从在1975年布莱克莫尔首次发现MTB物种(布莱克莫尔,R.趋磁细菌(Magnetotactic bacteria).科学24:377-379(1975)(其出于所有目的全文以引用方式并入))起，大量MTB物种为所属领域一般技术人员已知，且其代表一群微生物(费夫雷,D.(Faivre,D.)和斯科勒,D.(Schüler,D.)趋磁细菌和磁小体(Magnetotactic bacteria and magnetosome).化学评论(Chemistry Reviews)108:4875-4898(2008)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。已在蛋白菌和硝化螺旋菌(Nitrospira)门的不同亚群中鉴别出MTB，且大部分种系型集合在α-蛋白菌中。目前，依照16S rRNA序列相似性指定为α-蛋白菌的可培养MTB菌株包括最初由布莱克莫尔在1975年分离的菌株，即向磁磁螺菌(Magnetospirillum magnetotactium，曾为向磁水生螺菌(Aquasprillium magnetotactium))、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(M.gryphiswaldense)、趋磁螺菌菌株AMB-1(“AMB”)、多形磁螺菌(M.polymorphum)、磁 螺菌MSM-4和MSM-6、海洋趋磁球菌(Magnetococcus marinus)、海洋弧菌(vibrio)菌株MV-1及MV-2、海洋螺旋菌(spirillum)菌株MMS-1和趋磁球菌(Magnetococcus)菌株MC-1以及其它菌株。多种MTB可以纯培养物获得，包括AMB。AMB在纯培养物中的加倍时间为约8小时，且接近典型哺乳动物细胞。
标准MTB生长培养基使用琥珀酸作为主要碳源，但MTB可以延胡索酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、草乙酸盐、丙二酸盐、P-羟基丁酸盐和马来酸盐作为唯一碳源来生长。这些代谢物存在于真核细胞内部。已鉴别微量需氧、兼性厌氧和专性厌氧MTB菌株。由于诸如肌红蛋白等蛋白质的隔离和在特定细胞位置(例如线粒体)中的集中，真核细胞的胞质溶胶中的氧浓度低，因此在真核细胞中已存在MTB生长所需的微量需氧或兼性厌氧环境。
MTB还可依照其合成的磁性颗粒(磁铁矿(Fe3O4)或硫复铁矿(Fe3S4))来归类。磁铁矿产生者是微量需氧或兼性厌氧的，需要一定氧源用于磁小体合成，且最适生长温度接近生理温度。
在一些实施例中，本发明单细胞生物体经遗传修饰。已研发出分子生物学工具用于MTB的基因操作，最广泛地用于AMB和格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌菌株MSR-1(综述于朱格勒,C.(Jogler,C.)和斯蒂勒,D.(Schtiler,D.)，细菌中的磁感受和磁小体(Magnetoreception and Magnetosomes in Bacteria)，纽约，施普林格(Springer)，2007，第134-138页(其出于所有目的全文以引用方式并入)中)。由于AMB的基因组是任何MTB中首先测序的，所以除非另外指定，否则本文中的所有MTB基因参照是指这个基因组。两种其它磁螺菌(Magnetospirillum)菌株和趋磁球菌菌株MC-1的基因组最近也已测序。不管这些菌株或其它MTB菌株的基因当前可培养或不可培养，经测序或未经测序，已知或未知，都可用于本发明中。
MTB中负责形成磁小体的基因簇集于基因组岛中，称为磁小体岛(MAI)。在格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌中，130kb MAI一般结构化为4个多顺反子操纵子：mamAB操纵子具有17个经鉴别ORF，其遍布16.4kb；mamGFDC操纵子具有4个经鉴别ORF，其在ofinamAB上游2.1kb和15kb；mms6操纵子具有6个经鉴别ORF，其在mamGFDC上游3.6kb和368bp；mamXY操纵子具有4个经鉴别ORF，其位于mamAB下游约30kb；以及单顺反子mamW基因。在MAI中已鉴别以下蛋白质：Mam W、Mgl457、Mgl458、Mgl459、Mms6、Mgl462、MamG、MamF、MamD、MamC、MamH、Maml、MamE、MamJ、MamK、MamL、MamM、MamN、MamO、MamP、MamA、MamQ、MamR、MamB、MamS、MamT、MamU和Mgl505，其中多者在磁小体形成中具有特定功能。 在MAI外的4个基因与磁小体形成有关：mamY、mtxA、mmsF和mamX。已在其它MTB中发现保守MAI，且基因组组织和大小有一些差异。
在一些实施例中，对单细胞生物体进行遗传修饰。所述修饰可为定向修饰、随机诱变或其组合。天然内共生生物是新颖代谢能力的供体且从宿主取得营养需求。
共生生物对宿主的天然定殖发生于7个时期中：1)传播，2)进入，3)反击宿主防御，4)定位，5)为宿主提供优点，6)在宿主环境中存活，和7)调节。
在一些实施例中，可在单细胞生物体与真核细胞之间建立相互营养依赖性(向生体性)。在一个实施例中，单细胞生物体包含编码用于合成必需分子的酶的基因的至少一个缺失，其中所述必需分子是由真核宿主细胞产生。必需分子可包括(但不限于)氨基酸、维生素、辅因子和核苷酸。例如，向生体性可通过敲除单细胞生物体制备氨基酸的能力来达成，所述氨基酸随后将从宿主取得。甘氨酸是合理选择，因为其在哺乳动物细胞中非常丰富且为细菌氨基酸生源的最终产物；存在至少22种其它可能性。丝氨酸羟甲基转移酶在用于产生氨基酸的3-磷酸甘油酸生物合成路径的末端将丝氨酸转化为甘氨酸。在一个实施例中，单细胞生物体是AMB，其中基因amb2339(其编码丝氨酸羟甲基转移酶)经遗传修饰。所属领域一般技术人员已知多种用于使基因突变或敲除基因的方法，包括体外诱变、通过基因(或操纵子，因为细菌中的大多数基因簇集于操纵子中)的同源重组或缺失将DNA靶向插入到所关注基因中、或使用内切核酸酶(前提是基因组中存在仅在靶附近的适宜位点)。
在另一实施例中，单细胞生物体对宿主细胞的营养依赖性还可通过消除单细胞生物体合成各种代谢物、辅因子、维生素、核苷酸或其它必需分子的能力来建立。
在本发明的一些实施例中，MTB在与运动性和/或分泌相关的基因中具有突变和/或缺失。MTB有鞭毛，且在本发明的一些实施例中，MTB在至少一个编码与鞭毛相关的分子机构的基因中具有缺失和/或突变，从而使得磁性细菌不产生功能性鞭毛。另外，多种MTB分泌对宿主有害或引发宿主的免疫反应的各种化合物，例如氧肟酸盐和儿茶酚铁载体。在AMB、4559 ORF的已测序基因组中，83个基因与细胞运动性和分泌有关。已知鞭毛组合件可由以下的基因产物组成：amb0498、amb0500、amb050l、amb0502、amb0503、amb0504、amb0505、amb0610、amb0614、amb0615、amb0616、amb0617、amb0618、amb0619、amb0628、ambl289、ambl389、amb2558、amb2559、amb2578、amb2579、amb2856、amb3493、amb3494 amb3495、amb3496、amb3498、amb3824和amb3827。鞭毛受趋化机构控制，所述机构由至少以下的基因产物组成：amb0322、amb0323、amb0324、amb0325、amb0326、ambl806、ambl963、ambI966、amb2333、amb2635、amb2640、 amb2648、amb2652、amb2826、amb2932、amb3002、amb3003、amb3004、amb3007、amb3102、amb3329、amb3501、amb3502、amb3654、amb3879和amh3880。
在一个实施例中，将编码抗生素抗性的基因插入单细胞生物体的基因组中。在含有抗生素的培养基中培养的真核细胞的存活将需要所述单细胞生物体。新霉素(neomycin)抗性是由两种氨基葡糖苷磷酸转移酶基因中的任一种来赋予，所述基因还提供针对遗传霉素(G418，用于真核生物的常用抗生素)的抗性。潮霉素B(Hygromycin B)抗性是由通过磷酸化使潮霉素B失活的激酶来赋予。嘌呤霉素(puromycin)是用于哺乳动物细胞培养的常用抗生素且其抗性是由编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶的pac基因来赋予。抗生素浓度的外部控制使得可在细胞内调节单细胞生物体的拷贝数。还可采用其中通过对外部因素的化学修饰来实现对此因素的抗性或耐受性的任何其它系统。对真核细胞的间接营养优点可通过使用MTB和磁性培养方法来建立。在此实施例中，建立磁场以赋予含有MTB的真核细胞优点。这可通过提供附着到培养基质的方式或到达所需生长或培养基因子的通路来实现。
在另一实施例中，在MTB基因组中进行遗传修饰以增强抵抗具体宿主细胞类型的宿主防御机制的细胞内稳定性。多种真核生物内共生生物和内寄生物(例如昆虫的蛋白菌内共生生物，例如巴克纳氏菌属(Buchnera)、威格尔斯沃斯氏菌属(Wigglesworthia)和沃尔巴克体属(Wolbachia)；厌氧纤毛虫的产甲烷内共生生物；硅藻棒杆藻属(Rhopalodia)的固氮共生生物；无肠管虫(奥莱沃斯蠕虫(Olavius)或英纳氏虫(Inanidrillus))的化能合成内共生生物聚生体、海绵的蓝藻内共生生物、棘皮动物门(Echinodermata)的所有5个现存纲的内共生生物、植物的根瘤菌(Rhizobia)内共生生物、各种内共生藻类、阿米巴原虫(Ameoba proteus)的军团病杆菌(Legionella)样X细菌内共生生物、多种沙门菌(Salmonella sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)等)留存于通常称作共生体的膜结合液泡中，同时一些物种(例如布洛克曼尼亚菌(Blochmannia)、立克次体属(rickettsia)、志贺氏菌属(Shigella)、肠侵袭性大肠杆菌(Escherichia coli)和利斯特菌属(Listeria))具有栖息在胞质溶胶中的能力。通过吞噬作用获得的多种细胞内细菌采用Dot-Icm IV型分泌系统来躲避内吞路径并存留于宿主细胞中。此系统已在嗜肺军团病杆菌中充分研究且由以下蛋白质组成：DotA到DotP、DotU、DotV、IcmF、IcmQ到IcmT、IcmV、IcmW和IcmX。在线虫的发光内共生生物发冷光杆菌(Photorhabdus luminescens)中，显示编码RTX样毒素、蛋白酶、III型分泌系统和铁摄取系统的基因支持细胞内稳定性和复制。基因bacA和调节系统BvrRS是维持根瘤菌与植物之间的共生以及牛型布鲁杆菌(Brucella ahortus)在哺乳动物细胞中的存活所必需 的。PrfA调节子使得一些利斯特菌能逃脱吞噬体并栖息在胞质溶胶中。细胞内MTB的所需细胞位置(例如，共生体或胞质溶胶)将指示在宿主环境中存活和增殖需要在MTB中表达(直接来自基因组或通过稳定载体)哪种基因。内源性质粒pMGT在MTB中非常稳定且多种其它广泛载体(那些oflncQ、IncP、pBBRl等)能在MTB中稳定复制。
在另一实施例中，单细胞生物体通过基因(例如抑菌基因、铁载体基因、代谢需求基因、自杀基因、生命周期调节基因、转运蛋白基因)中的敲击进行遗传修饰，并逃脱吞噬体基因。在另一实施例中，对单细胞生物体进行随机突变，随后进行筛选以促进在宿主细胞内的整合。随机突变可通过用诱变化合物处理、暴露于UV光或所属领域技术人员已知的其它方法来达成。
在另一实施例中，使用来自各种寄生物或内共生生物的基因进行转基因修饰以反击真核细胞防御。在另一实施例中，通过平衡宿主机制(养分可用性、繁殖控制等)的内在使用与抗生素浓度来调节真核宿主细胞中的单细胞生物体群体。
在另一实施例中，天然内共生生物或细胞内寄生物经遗传修饰以产生磁小体。昆虫的内共生生物(例如巴克纳氏菌、威格尔斯沃斯氏菌和沃尔巴克体属)；厌氧纤毛虫的产甲烷内共生生物；硅藻棒杆藻属中的固氮共生生物；无肠管虫(奥莱沃斯蠕虫或英纳氏虫)的化能合成内共生生物聚生体、海绵的蓝藻内共生生物、棘皮动物门的所有5个现存纲的内共生生物、植物的根瘤菌内共生生物、各种内共生藻类、阿米巴原虫的军团病杆菌样X细菌内共生生物、多种沙门菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团病杆菌属于α-蛋白菌且可经遗传改造以产生磁小体。在另一实施例中，已存在的细胞器可经遗传修饰以表达一或多个磁小体基因以产生人工内共生生物。例如，线粒体、质体、氢化酶体、顶质体(apicoplast)或其它具有其自身遗传物质的细胞器可经遗传改变。
在优选实施例中，单细胞生物体是MTB，其可经或不经遗传改变，从而在培养真核细胞时产生磁性颗粒。
真核细胞
本发明提供在真核细胞中包含可遗传单细胞生物体的真核细胞以及将所述单细胞生物体引入宿主细胞中的方法。
在一些实施例中，真核细胞是植物细胞。在一些实施例中，真核细胞是单子叶植物或双子叶植物的细胞，所述植物包括(但不限于)玉米、小麦、大麦、裸麦、燕麦、水稻、大豆、花生、豌豆、扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、芸苔、胡椒、向日葵、土豆、烟草、番茄、茄子、桉树、树、观赏植物、多年生草或饲料作物。在其它实施例中，真核细胞是藻类细胞，包括(但不限于)以下属的藻类：小球藻属(Chlorella)、衣藻属 (Chlamydomonas)、栅藻属(Scenedesmus)、等鞭金藻属(Isochrysis)、杜氏藻属(Dunaliella)、扁藻属(Tetraselmis)、微拟球藻属(Nannochloropsis)或原囊藻属(Prototheca)。在一些实施例中，真核细胞是真菌细胞，包括(但不限于)以下属的真菌：酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Klyuveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
在一些实施例中，本发明真核细胞是动物细胞。在一些实施例中，真核细胞是哺乳动物细胞，例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、人类、猪、牛或犬。小鼠常规用作其它哺乳动物、最特别是人类的模型。(例如，参见汉纳,J.(Hanna,J.)、韦尼希,M.(Wernig,M.)、麻库拉基,S.(Markoulaki,S.)、孙,C(Sun,C)、梅斯内,A.(Meissner,A.)、卡萨迪,J.P.(Cassady,J.P.)、比尔德,C(Beard,C)、布兰布林克,T.(Brambrink,T.)、吴,L.(Wu,L.)、汤斯,T.M.(Townes,T.M.)、耶尼施,R.(Jaenisch,R.)用从自体皮肤生成的iPS细胞治疗镰状细胞贫血小鼠模型(Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin).科学318:1920-1923(2007)；霍尔茨曼,D.M.(Holtzman,D.M.)、贝尔斯,K.R.(Bales,K.R.)、吴,S.、巴特,P.(Bhat,P.)、帕萨达尼安,M.(Parsadanian,M.)、费根,A.(Fagan,A.)、常,L.K.(Chang,L.K.)、孙,Y.、保罗,S.M.(Paul,S.M.)在小鼠阿尔茨海默氏病模型中人类载脂蛋白E的表达减少淀粉样蛋白-β沉积(Expression of human apolipoprotein E reduces amyloid-βdeposition in a mouse model of Alzheimer's disease).临床研究杂志(J.Clin.Invest.)103(6):R15-R21(1999)；沃伦,R.S.(Warren,R.S.)、袁,H.(Yuan,H.)、毛特利,MR.(Matli,MR.)、吉勒特,N.A.(Gillett,N.A.)、法拉拉,N.(Ferrara,N.)在小鼠实验性肝转移模型中通过血管内皮生长因子调节人类结肠癌肿瘤发生(Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis).临床研究杂志95:1789-1797(1995)(这三个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
在一些实施例中，真核细胞是人类癌细胞。多种人类癌细胞系为所属领域一般技术人员所熟知，包括常见的上皮肿瘤细胞系，例如Coco-2、MDA-MB231和MCF7；非上皮肿瘤细胞系，例如HT-1080和HL60、NCI60细胞系谱(例如，参见休梅克,R.(Shoemaker,R.)，NCI60人类肿瘤细胞系抗癌药物筛选(The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen).自然综述.癌症(Nature Reviews Cancer)6,813-823(2006)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。另外，所属领域一般技术人员可熟练从原发性人类肿瘤获得癌细胞。
在其它实施例中，真核细胞是干细胞。所属领域一般技术人员熟悉多种干细胞类型，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、表皮神经嵴干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、间质干细胞、嗅觉成体干细胞和睾丸细胞。
在实施例中，真核细胞是在人类宿主的循环系统中发现的细胞。例如，红血细胞、血小板、浆细胞、T细胞、天然杀伤细胞或诸如此类和其前体细胞。作为一组，这些细胞定义为本发明的循环宿主细胞。本发明可与这些循环细胞中的任一者一起使用。在实施例中，真核宿主细胞是T细胞。在另一实施例中，真核细胞是B细胞。在实施例中，真核细胞是嗜中性粒细胞。在实施例中，真核细胞是巨核细胞。
在另一实施例中，至少一个来自真核细胞的基因经遗传改变。在一些实施例中，可使用所属领域一般技术人员已知的专用于目标宿主细胞类型的适宜分子生物学技术通过真核细胞的遗传修饰在人工内共生生物与真核细胞之间建立相互营养依赖性(向生体性)，从而产生真核细胞针对某一必需高分子对单细胞生物体的依赖性，由此建立针对向生体性的环境压力。在另一实施例中，可通过遗传改变真核细胞以消除单细胞生物体合成各种代谢物、辅因子、维生素、核苷酸或其它必需分子的能力来建立单细胞生物体对真核细胞的营养依赖性。在所述实施例中，可由单细胞生物体提供必需分子。在另一实施例中，编码丝氨酸羟甲基转移酶(其在用于氨基酸产生的3-磷酸甘油酸生物合成路径末端将丝氨酸转化为甘氨酸)的真核细胞基因可经修饰。
将单细胞生物体引入真核细胞中的方法
可通过多种所属领域技术人员已知的方法将本发明单细胞生物体引入真核细胞中，所述方法包括(但不限于)微注射、天然吞噬作用、诱导吞噬作用、巨胞饮作用、其它细胞摄取过程、脂质体融合、红细胞血影融合、电穿孔、受体介导方法和诸如此类。(参见微注射和细胞器移植技术(Microinjection and Organelle Transplantation Techniques)，塞利斯(Celis)等人编辑；学术出版社(Academic Press)：纽约,1986和其中的参考文献，(出于所有目的全文以引用方式并入))。
在一个实施例中，通过微注射到宿主细胞细胞质中将单细胞生物体引入宿主细胞中。多种微注射技术为所属领域技术人员已知。微注射是最有效的可用转移技术(基本上100％)且没有细胞类型限制(同一文献；习,Z.(Xi,Z.)和多布森,S.(Dobson,S.)通过使用胚胎细胞质和胚胎匀浆的微注射表征沃尔巴克体属转染效率(Characterization of Wolbachia transfection efficiency by using microinjection of embryonic cytoplasm and embryo homogenate).应用与环境微生物学(Appl Environ.Microbiol.)71(6):3199-3204(2005)；戈茨,M.(Goetz,M.)、布博特,A.(Bubert,A.)、王,G.(Wang,G.)、奇科-卡莱罗, I.(Chico-Calero,I.)、巴斯克斯-博兰,J.A.(Vazquez-Boland,J.A.)、贝克,M.(Beck,M.)、斯莱惠斯,J.(Slaghuis,J.)、绍洛伊,A.A.(Szalay,A.A.)、格贝尔,W.(Goebel,W.)细菌在哺乳动物宿主细胞的胞质溶胶中的微注射和生长(Microinjection and growth of bacteria in the cytosol of mammalian host cells).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad Set USA)98:12221-12226(2001)(这三个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
已显示天然吞噬细胞可吸收细菌，包括MTB(伯德特,D.L.(Burdette,D.L.)、希曼,J.(Seemann,J.)、奥思,K.(Orth,K.)弧菌VopQ诱导非PI3激酶依赖性自体吞噬并拮抗吞噬作用(Vibrio VopQ induces PI3-kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis).分子微生物学(Molecular microbiology)73:639(2009)；威德曼,A.(Wiedemann,A.)、安德尔,S.(Linder,S.)、格拉西,G.(Grassi,G.)、艾伯特,M.(Albert,M.)、奥滕里特,L(Autenrieth,L)、爱普费贝彻,M.(Aepfelbacher,M.)小肠结肠炎耶尔森菌玻璃酸酶在巨噬细胞中通过β1整联蛋白、CDC42H和WASp触发吞噬作用(Yersinia enterocolitica invasin triggers phagocytosis viaβ1 integrins,CDC42Hs and WASp in macrophages).细胞微生物学(Cellular Microbiology)3:693(2001)；哈克姆,D.J.(Hackam,D.J.)、罗特施泰因,O.D.(Rotstein,O.D.)、施赖伯,A.(Schreiber,A.)、张,W.(Zhang,W.)、格林斯坦,S.(Grinstein,S.)巨噬细胞中的Fcγ受体起始钙信号传导和吞噬作用需要Rho (Rho is required for the initiation of calcium signaling and phagocytosis by Fcγreceptors in macrophages).实验医学杂志(J.of Exp.Med)186(6):955-966(1997)；松永,T.、桥本,K.、中村,N.、中村,K.、桥本,S.白血球对细菌磁铁矿的吞噬作用(Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes).应用微生物学和生物技术31(4):401-405(1989)(这四个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
这种方法可放大，但可能受限于特定细胞类型(例如，巨噬细胞)。然而，最新研究已显示，可诱导非吞噬细胞类型在与以下多种因子共培养时内吞细菌：培养基和化学因子、生物因子(例如，杆状病毒、蛋白质因子、遗传敲入等)。(例如，参见萨尔米宁,M.(Salminen,M.)、艾润妮,K.J.(Airenne,K.J.)、瑞南科斯基,R.(Rinnankoski,R.)、瑞玛丽,J.(Reimari,J.)、瓦利乐托,O.(Valilehto,O.)、瑞尼,J.(Rinne,J.)、苏伊卡宁,S.(Suikkanen,S.)、库科宁,S.(Kukkonen,S.)、伊拉-赫图亚拉,S.(Yla-Herttuala,S.)、库鲁马,M.S.(Kulomaa,M.S.)、维希宁-兰塔,M.(Vihinen-Ranta,M.)在人类肝细胞中通过微管崩解来改良杆状病毒的入核和转基因表达(Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disintegration of microtubules in human hepatocytes).病毒学杂志(J.Virol)79(5):2720-2728(2005)；莫达斯立,K.R.(Modalsli,K.R.)、米卡尔森,S.(Mikalsen, S.)、布克霍姆,G.(Bukholm,G.)、德格尔,M.(Degre,M.)用柯萨奇B1病毒RNA对HEp-2细胞进行微注射仅在用UV灭活病毒预刺激后增强弗氏志贺菌的侵袭力(Microinjection of HEp-2 cells with coxsackie B1 virus RNA enhances invasiveness of Shigella flexneri only after prestimulation with UV-inactivated virus).APMIS 101:602-606(1993)；海沃德,R.D.(Hayward,R.D.)和科洛纳基斯,V.(Koronakis,V.)通过侵袭性沙门菌的SipC蛋白质使肌动蛋白直接成核和束结(Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella).欧洲分子生物学学会杂志(The EMBO Journal)18:4926-4934(1999)；吉田,S.(Yoshida,S.)、片山,E.(Katayama,E.)、桑江,A.(Kuwae,A.)、三室,H.(Mimuro,H.)、铃木,T.(Suzuki,T.)、笹川,C.(Sasakawa,C.)志贺菌递送效应子蛋白以触发宿主微管去稳定，此促进Racl活性和有效细菌内化(Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization,which promotes Racl activity and efficient bacterial internalization).欧洲分子生物学学会杂志21:2923-2935(2002)；比吉尔迪夫(Bigildeev)等人，实验血液学杂志(J.Exp Hematol.),39:187(2011)；芬利,B.B.(Finlay,B.B.)和法寇,S.(Falkow,S.)重新审视微生物致病性的共同主题(Common themes in microbial pathogenicity revisited).微生物学与分子生物学评论(Microbiol,and Mol.Biol.Rev.)61:136-169(1997)(这六个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入)。
相关过程巨胞饮作用或“胞饮”是多种细菌和病毒用于细胞内进入的方法(张(2004)，分子成像和对比剂数据库(Molecular Imaging and Contrast Agent Database，MICAD)[在线数据库]；贝塞斯达(Bethesda)(MD)：国家医学图书馆(National Library of Medicine，美国),NCBI；2004-2011(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。有多种方案可用于诱导细胞吸收细菌。已将若干种试剂(例如核酸、蛋白质、药物和细胞器)囊封于脂质体中并递送到细胞(本哈伊姆,N.(Ben-Haim,N.)、布罗,P.(Broz,P.)、马希,S.(Marsch,S.)、迈耶,W.(Meier,W.)、亨齐克,P.(Hunziker,P.)人工细胞器基于功能化聚合物囊泡的细胞特异性整合(Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles).纳米快报8(5):1368-1373(2008)；李安,W.(Lian,W.)、常,C、陈,Y.(Chen,Y.)、达奥,R.(Dao,R.)、罗,Y.(Luo,Y.)、钱,J.(Chien,J.)、谢,S.(Hsieh,S.)、林,C.(Lin,C.)细胞内递送可无需载剂颗粒通过用加速分子或细菌轰击细胞或组织来实现(Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles).实验细胞研究(Experimental Cell Research)313(1):53-64(2007)；邢,B.C.(Heng,B.C.)和曹,T.(Cao,T.)免疫脂质体介导递送新霉素磷酸转移酶用于分化/定型干细胞后代的谱系特异性选择：相 对于用标记基因转染、荧光活化和磁性亲和性细胞分选的潜在优点(Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies:Potential advantages over transfection with marker genes,fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting).医学假说(Med.Hypotheses)65(2):334-336(2005)；波特里库斯(Potrykus)(1990)Ciba基金会专题论文集(Ciba Found Symp)，第154卷:198(这四个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。这种方法便宜、相对简单且可放大。另外，脂质体摄取可通过操作培育条件、改变脂质体电荷、受体介导和增强磁性来促进。(参见例如潘(Pan)等人，国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)358:263(2008)；萨博路基,M.N.(Sarbolouki,M.N.)和托利亚特,T.(Toliat,T.)含有甲氨蝶呤钠的稳定化MLV和REV脂质体(水性和冻干)的储存稳定性(Storage stability of stabilized MLV and REV liposomes containing sodium methotrexate(acqueous & lyophilized)).医药科学技术杂志(J.Pharm.Sci.Techno.),52(10):23-27(1998)；埃洛萨,B.(Elorza,B.)、埃洛萨,M.A.、赛恩斯,M.C.(Sainz,M.C.)、昌特雷斯,J.R.(Chantres,J.R.)比较三种脂质体制剂的粒径和囊封参数(Comparison of particle size and encapsulation parameters of three liposomal preparations).微囊法杂志(J.Microencapsul.)10(2):237-248(1993)；迈哈利,O.(Mykhaylyk,O.)、桑切斯-安特克拉,Y.(Sánchez-Antequera,Y.)、弗拉司寇,D.(Vlaskou,D.)、哈默施密德,E.(Hammerschmid,E.)、安东,M.(Anton,M.)、赛尔菲替,O.(Zelphati,O.)和普兰克,C.(Plank,C.)脂质体磁性转染(Liposomal Magnetofection).分子生物学方法(Methods Mol Bio.),605:487-525(2010)(这四个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
红细胞介导的转移类似于脂质体融合且已显示在所测试的所有细胞类型中具有高效率和功效(微注射和细胞器移植技术；塞利斯等人编辑；学术出版社:纽约,1986(其出于所有目的全文以引用方式并入))。通常，红细胞是通过渗透冲击方法或电穿孔方法来加载(舍恩,P.(Schoen,P.)、寇恩,A.(Chonn,A.)、卡利斯,P.R.(Cullis,P.R.)、威斯卡特,J.(Wilschut,J.)和斯楚惹,P.(Schuerrer,P.)在阳离子脂质囊泡中复原的融合蛋白血凝素介导的基因转移(Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles).基因疗法(Gene Therapy)6:823-832(1999)；李,L.H.(Li,L.H.)、亨森,M.L.(Hensen,M.L.)、赵,Y.L.(Zhao,Y.L.)、惠,S.W.(Hui,S.W.)团粒中不均匀大小的哺乳动物细胞之间的电融合：在药物递送和杂交瘤形成中的潜在应用(Electrofusion between heterogeneous-sized mammalian cells in a pellet:potential applications in drug delivery and hybridoma formation).生物物理学杂志(Biophysical Journal)71:479-486 (1996)；卡拉瑟斯,A.(Carruthers,A.)和梅尔基奥尔,D.L.(Melchior,D.L.)复原人类红细胞糖转运蛋白的快速方法(A rapid method of reconstituting human erythrocyte sugar transport proteins).生物化学(Biochem.)23:2712-2718(1984)(这三个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入)。或者，红细胞可通过用单细胞生物体加载造血祖细胞且诱导其分化并扩增为含有单细胞生物体的红细胞间接加载。
电穿孔是将因子递送到细胞中的常用便宜方法。(波特里库斯,I.用于植物和细胞培养的基因转移方法(Gene transfer methods for plants and cell cultures).Ciba基金会专题论文集154,198-208；讨论208-112(1990)；沃班克,S.(Wolbank,S.)等人，标记人类脂肪源干细胞用于非侵入性体内细胞追踪(Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking).细胞组织库(Cell Tissue Bank)8,163-177(2007)(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
在另一实施例中，使用天然内吞细菌的真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))。在一个实施例中，将经修饰单细胞细菌直接添加到CHO培养物中。通过标准程序在含有10％胎牛血清培养基的汉姆氏(Ham's)F-12培养基中培养CHO细胞，之后用MTB感染。在感染后，用呈苹果酸铁或FeCl3的额外铁(40到80μM)增加培养基。多种其它细胞类型通过胞吞作用或或更特定来说吞噬作用内化细菌；内共生生物或寄生物具有其自身的细胞进入方法且这些天然过程可用于内化人工内共生生物，从而生成所谓的共生体。在另一实施例中，可使用微注射、细胞器移植和嵌合体技术将来自一种细胞的共生体移植到另一细胞类型中(即，不能胞吞人工内共生生物的细胞类型)。在典型培养基中以用于特定细胞类型的典型技术培养这些宿主细胞。
在一个实施例中，通过脂质体介导过程将单细胞生物体引入宿主细胞中。已将大于MTB的线粒体和叶绿体在囊封到脂质体中的时候有效引入真核细胞中。(博尼特,H.T.(Bonnett,H.T.)植物(Planta)131,229(1976)；翟理斯,K.(Giles,K.)；沃恩,V.(Vaughan,V.)；兰彻,J.(Ranch,J.)；埃默里,J.(Emery,J.)脂质体介导的植物原生质体摄取叶绿体(Liposome-mediated uptake of chloroplasts by plant protoplasts).体外细胞和发育生物学——植物(In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant)16(7)581-584(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。可使用多种脂质体融合方案和试剂且所属领域技术人员不经过多实验即可使用。(例如，参见本哈伊姆,N.、布罗,P.、马希,S.、迈耶,W.、亨齐克,P.人工细胞器基于功能化聚合物囊泡的细胞特异性整合.纳米快报8(5):1368-1373(2008)；李安,W.、常,C、陈,Y.、达奥,R.、罗,Y.、钱,J.、谢,S.、林,C.细胞内递送可无需载剂颗粒通过用加速分子或细菌轰击细胞或组织来实现.实验 细胞研究313(1):53-64(2007)；邢,B.C.和曹,T.免疫脂质体介导递送新霉素磷酸转移酶用于分化/定型干细胞后代的谱系特异性选择：相对于用标记基因转染、荧光活化和磁性亲和性细胞分选的潜在优点.医学假说65(2):334-336(2005)；波特里库斯(1990)Ciba基金会专题论文集第154卷:198(这四个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
根本根据下文的实验详情可更好地理解本文揭示的发明。然而，所属领域技术人员将容易地了解到，所讨论的特定方法和结果只是阐释本发明，其在下文权利要求书中有更详细的描述。
实例
实例1.将gfp+AMB微注射到鼠类细胞中
A.gfp+AMB的构筑.
将eGFP(一个包括gfp基因上游的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列且一个不含夏因-达尔加诺)序列的表达载体克隆到隐藏广泛宿主载体pBBR1MCS-2中(科瓦奇,M.E.(Kovach,M.E.)等人广泛宿主克隆载体pBBR1MCS的四种新衍生物，其携载不同抗生素抗性盒(Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes).基因(Gene)166,175-176,(1995)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。用此构筑体转化AMB(ATCC 700264)(松永,T.等人兼性厌氧趋磁细菌磁螺菌菌株AMB-1的完整基因组序列(Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotactic bacterium Magnetospirillum sp.strain AMB-1).DNA研究(DNA Res.)12,157-166(2005)；布格斯J.G.(Burgess J.G.)等人，从16S rDNA序列的种系发生分析推断出的磁螺菌菌株之间的进化关系(Evolutionary relationships among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences).细菌学杂志(J.Bacteriol)175:6689-6694(1993)；松永T,等人，磁性细菌中的基因转移：转座子诱变和磁小体合成所需的基因组DNA片段的克隆(Gene transfer in magnetic bacteria:transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis).细菌学杂志174:2748-2753(1992)；川口R(Kawaguchi R)等人，好氧磁性细菌磁螺菌AMB-1的种系发生和16s rRNA序列(Phylogeny and 16s rRNA sequence of Magnetospirillum sp.AMB-1,an aerobic magnetic bacterium).核酸研究(Nucleic Acids Res.)20:1140,(1992)(这四个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。
转化是通过使用供体大肠杆菌菌株接合来实现，如以下文献中所述：古利安,M.(Goulian,M.)、范德沃德,M.A.(van der Woude,M.A.)用于在不同细菌中将lacZ转化为 gfp报道基因融合物的简单系统(A simple system for converting lacZ to gfp reporter fusions in diverse bacteria).基因372,219-226(2006)；舍费尔,A.(Scheffel,A.)、舍乌尔,D.(Schüier,D.)格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌MamJ蛋白质的酸性重复区显示超变异性但并非磁小体链装配所需要(The Acidic Repetitive Domain of the Magnetospirillum gryphiswaldense MamJ Protein Displays Hypervariability but Is Not Required for Magnetosome Chain Assembly).细菌学杂志9月刊；189(17):6437-6446(2007)(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入)。在确定微量需氧条件下在DAP不存在下将交配反应培养10天以选择阳性转化体。
在接合后，含有和不含夏因-达尔加诺序列的gfp+AMB转化体顺利显示GFP荧光。含有夏因-达尔加诺序列的转化体所显示GFP荧光水平高于不含此序列的转化体。在以100×放大在488nm激发下观看时，所得荧光不离开gfp+AMB细胞。
通过MRI分析gfp+AMB的磁性性质。使用1.5T仪器将gfp+AMB悬浮于琼脂塞中以优化并表征成像性质。图1显示用T1脉冲序列在最高约108MTB/mL的对数级浓度中生成的正反差。信号强度与浓度相关。
B.微注射到鼠类胚胎细胞中.
将gfp+AMB在2细胞期微注射到170个小鼠胚胎中每一胚胎的一个细胞中。每个细胞注射6个最高约105gfp+AMB的对数级浓度，所述浓度是在565nm下依据光学密度来估计。在不同注射浓度之间，细胞在微注射后的死亡率恒定。比较以最高浓度(105MTB/细胞)注射的细胞的叠加荧光和微分干涉差(DIC)图像的图像。微注射对照展现低自发荧光水平。在给定时间点比较8细胞胚胎中不同水平面的切片。在每一胚胎中，从经注射细胞取得的所有四个细胞都显示明显荧光，而从未注射内部对照取得的四个细胞都不显示明显荧光。
使胚胎在注射后发育3天。在每一浓度水平中，胚胎存活最长全部3天，发育到256细胞囊胚期，且表现得足够健康以供植入。每一囊胚内的多个细胞显示明显荧光，表明随着包含真核宿主细胞的胚胎发育到囊胚期，人工内共生生物跨越多次细胞分裂转移到子代细胞中。一个所述囊胚显示于图2中，其中图A显示囊胚的微分干涉差(DIC)图像，且图B)显示同一图像的灰度荧光捕获，从而显示遍布囊胚的多个细胞中的荧光。
通过在胚胎的8细胞期开始随时间在不同点测量整个胚胎中的总GFP荧光，使用共焦显微术对所有四个个别胚胎中的GFP的总表达进行定量。图3显示胚胎荧光随时间的变化。此指示，人工内共生生物的拷贝数在子代细胞中维持至少7代，从而使得随着胚胎从2细胞期进展到256细胞囊胚期，维持宿主细胞的荧光表型。
这些结果表明，在通过微注射递送时，gfp+AMB并非立即被清除或降解，且在3天的实验过程期间对发育中的胚胎无毒性。微注射的胚胎正常分裂，表明gfp+AMB不显示致病标记或分泌毒性化合物。其跨越多次细胞分裂转移到子代细胞中，含于细胞质中，有小斑点且均匀分布，并在子代宿主细胞内维持拷贝数，从而使得在子代细胞中经过至少7代维持真核生物宿主细胞的荧光表型。这些结果表明，AMB可稳定维持在细胞内并经至少7次细胞分裂转移到子代细胞中。
实例2.AMB的吞噬性进入
受体介导的：从单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)基因组DNA(ATCC 19114)扩增inlAB基因且插入pBBR1MCS-5,107(pBBR1MCS-2的庆大霉素同源物)中(科瓦奇,M.E.,等人，广泛宿主克隆载体pBBR1MCS的四种新衍生物，其携载不同抗生素抗性盒.Gem 166,175-176,(1995))，且生成gfp+inlAB+AMB。将gfp+inlAB+AMB与真核宿主细胞共培养，所述真核宿主细胞包括常见上皮肿瘤细胞系Coco-2、MDA-MB231和MCF7、非上皮肿瘤细胞系(例如HT-1080和HL60)以及鼠类干细胞。使用荧光显微术和FACS来检测并定量内化和细胞内位置。
成孔溶血素(hlyA)在AMB中的表达是通过从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA(ATCC 19114)扩增hlyA来实现。将扩增hlyA插入pBBR1MCS-3(pBBR1MCS-2的四环素同源物)中，然后使用其来转化gfp+AMB。将所得AMB菌株暴露于能进行自发吞噬作用的鼠类巨噬细胞系J774中。使用庆大霉素处理来消除未内化细菌并使用hlyA-AMB作为阴性对照。使用荧光显微术来监测AMB的细胞内结局和定位。
如果细菌保持局限于吞噬体中，那么引入单核细胞增生李斯特菌逃脱到胞质溶胶中所涉及的两个基因plcA和plcB。(史密斯,G.A.(Smith,G.A.)、马奎斯,H.(Marquis,H.)、琼斯,S.(Jones,S.)、约翰斯顿,N.C(Johnston,N.C)、波特努瓦,D.A.(Portnoy,D.A.)、戈德法因,H.(Goldfine,H.)感染和免疫(Infection and immunity)63:4231(1995)；卡米利,A.(Camilli,A.)；戈德法因,H.；波特努瓦,D.A.，实验医学杂志(The Journal of Experimental Medicine)173:751(1991)(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。如果细菌顺利逃脱，但未能增殖，那么引入hpt。(戈茨,M.、布博特,A.、王,G.、奇科-卡莱罗,I.、巴斯克斯-博兰,J.A.、贝克,M.、斯莱惠斯,J.、绍洛伊,A.A.、格贝尔,W.美国国家科学院院刊98:12221(2001)；奇科-卡莱罗,I.、苏亚雷斯,M.(Suarez,M.)、冈萨雷斯-佐恩,B.(Gonzalez-Zorn,B.)、斯考替,M.(Scortti,M.)、斯莱惠斯,J.、格贝尔,W.、巴斯克斯-博兰,J.A.美国国家科学院院刊99:431(2002)(这两个出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入))。在单核细胞增生李斯特菌中，hpt 编码负责从胞质溶胶摄取葡萄糖-6-磷酸盐的转运蛋白。其它来自单核细胞增生李斯特菌的基因参与维持在宿主内的生长(glnA和gltAB和argD)，且视需要系统性引入这些基因。(约瑟夫,B.(Joseph,B.)、普尔兹比拉,K.(Przybilla,K.)、斯图勒,C(Stuhler,C)、肖尔,K.(Schauer,K.)、斯莱惠斯,J.、富克斯,T.M.(Fuchs,T.M.)、格贝尔,W.，细菌学杂志188:556(2006)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。
实例3.AMB生长的调节
AMB在胚胎干细胞中生长的调节可如下调节。从米象(Sitophilus oryzae)总cDNA扩增鞘翅肽-A(Coleoptericin-A，ColA)。ColA在米象(Sitophilus)属甲虫中的表达调节已自然发育出与所述甲虫的密切共生关系的γ-原细菌的效价，且留存在称为含菌细胞的特定细胞中。(洛金,F.H.(Login,F.H.)、巴尔曼,S.(Balmain,S.)、瓦利耶,A.(Vallier,A.)、文森特-蒙尼盖特,C(Vincent-Monegat,C)、维涅龙,A.(Vigneron,A.)、韦斯-加耶,M.(Weiss-Gayet,M.)、罗沙,D.(Rochat,D.)、埃迪,A.(Heddi,A.)抗微生物肽将昆虫内共生生物保持在控制下(Antimicrobial peptides keep insect endosymbionts under control).科学334(6054):362-365(2011)(其出于所有目的全文以引用方式并入))。
使用神经分化方案处理包含gfp+AMB的鼠类胚胎干细胞。使用qPCR和荧光显微术对MTB表达水平进行定量。然后使经扩增colA在gfp+AMB胚胎干细胞中表达。选择启动子来提供最佳ColA表达水平。
实例4.含有gfp+AMB的鼠类细胞的磁性表型
将来自从鼠类腹水和实体肿瘤取得的引入gfp+AMB的巨噬细胞系J774.2的细胞施加到磁选柱上并通过所述柱来保持。这些结果表明，在引入gfp+AMB后，在J774.2鼠类细胞发生磁性浓缩和磁性收集时，对其进行磁性检测和磁性操作。
实例5.人类乳癌细胞系MDA-MB-231中的Gfp+AMB
将Gfp+AMB、Gfp+InlA/B+AMB和Gfp+Pla1+AMB各自引入来自细胞系MDA-MB-231的人类乳癌细胞中。在引入Gfp+AMB、Gfp+InlA/B+AMB和Gfp+Pla1+AMB中的每一者后48小时，在90％以上的MDA-MB-231细胞中检测到GFP荧光。在引入gfp+AMB后至少13天，在MDA-MB-231细胞在引入后的第四次传代中，在这些MDA-MB-231细胞中观察到Gfp+AMB中的GFP荧光，其中MDA-MB-231细胞群在每次传代之间加倍3到4次。在MDA-MB-231细胞的在细胞分裂过程中引入gfp+AMB的两种所形成的子代细胞中都观察到GFP荧光
在引入gfp+AMB后，用购自生命技术(Life Technologies)的![]()
红色DND-99染料和Hoechst 33342染色剂对MDA-MB-231细胞进行染色。在定位于个别 MDA-MB-231细胞内时观察到绿色GFP荧光
在引入后24小时和72小时，在用PBS洗涤后在福尔马林(formalin)和戊二醛中固定平铺的MDA-MB-231细胞和平铺的对照MDA-MB-231细胞。然后用普鲁士蓝(Prussian Blue)对细胞进行染色，且通过显微术在40×放大下观察。在一些引入gfp+AMB的MDA-MB-231细胞中观察到铁染色，但在未引入gfp+AMB的对照MDA-MB-231细胞中未观察到所述染色。在引入gfp+AMB后72小时的MDA-MB-231细胞与在引入gfp+AMB后24小时的MDA-MB-231细胞之间，显示铁染色的细胞的比例类似。
在引入gfp+AMB后48小时，将MDA-MB231细胞胰蛋白酶化并再悬浮于PBS中。将这些细胞的一个样品置入载玻片室中。将磁体与室侧面对准且在显微镜下在20×放大下观察细胞移动。引入gfp+AMB的MDA-MB231细胞展现朝向磁体的移动，但未引入gfp+AMB的对照MDA-MB231细胞不展现所述移动。将这些细胞的另一样品置入小管中，将其捆扎到磁体并保持1小时。未引入gfp+AMB的对照MDA-MB231细胞沉降在管底部。然而，引入gfp+AMB的MDA-MB231细胞与管的磁体侧对准。
这些结果指示，gfp+AMB并非立即从人类乳癌MDA-MB-231细胞中清除。其跨越至少12次细胞分裂转移到子代细胞中且定位在MDA-MB-231细胞内，在溶酶体和细胞核二者外部。这些结果还表明，在引入gfp+AMB后至少48小时，在所显示含有gfp+AMB的MDA-MB-231细胞发生磁性移动、磁性靶向位置、磁性浓缩和磁性收集时，对其进行磁性检测和磁性操作。另外，在引入gfp+AMB后至少72小时，MDA-MB-231细胞含有可观察量的铁。
实例6.人类诱导多能干细胞中的Gfp+AMB
在将gfp+AMB引入人类诱导多能干(“IPS”)细胞中之后至少8天时，在IPS细胞的第二次传代中，在IPS细胞中观察到GFP荧光。这些结果指示，gfp+AMB并非立即从人类IPS细胞中清除，且转移到子代细胞中。
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