本发明一般来说涉及透明带蛋白的生产和应用，更具体地说涉及编码透明带蛋白的新的DNA顺序，用于生产这些蛋白的重组材料和方法，以及用于通过使用天然存在的和重组的透明带蛋白而选择性地实现哺乳动物的暂时性不育或永久性不育的材料和方法。 本发明涉及一种诱导哺乳动物可重复的暂时性不育的方法，该方法是在该哺乳动物体内诱导针对存在于该哺乳动物卵母细胞透明带中的蛋白的抗体。本发明还涉及一些经纯化和分离的DNA顺序，这些顺序编码来自各种不同哺乳动物种属的、本文称为“ZPA”、“ZPB”和“ZPC”的透明带蛋白。本发明还涉及能够在主体哺乳动物体内诱导抗体生成的药物组合物。
透明带（ZP）是一种围绕哺乳动物卵母细胞的复合基质，由卵巢细胞所分泌的糖蛋白组成。透明带糖蛋白行使多种功能。例如，以前称为ZP2和ZP3的小鼠ZP蛋白，经复合而形成长丝，这些长丝由ZP基质中称为ZP1的蛋白交联起来而使基质在结构上具有完整性（Wassarman，P.M.，Annu.Rev.Biochem.57∶415-442，1988）。除了在结构上的作用外，还证明了小鼠ZP3是ZP基质中的精子受体（Bleil，J.P.和Wassarman，P.M.，Cell 20∶873-882,1980）。在精子与ZP3结合并随后在ZP表面诱导出精子顶体反应后，ZP2起次级精子受体的作用，这对维持精子与卵子地结合是必需的（Bleil等，Dev.Biol.128∶376-385，1988）。由于它在卵母细胞的维持及精子-卵母细胞相互作用中的作用，ZP在逻辑上成为干扰受精过程的避孕药的设计靶标。
许多不同的研究小组都进行了免疫学研究工作，试图干扰ZP的功能，从而降低受免疫动物的可育性（见Dunbar等，《国际生殖免疫学会议》，T.Wegman和T.Gills编，London:Oxford Press，第505-528页，1983；Dunbar等：《动物受精机理及控制》，J.Hartman编，Academic Press，New York，第139-166页，1983）。这些研究表明，用卵巢匀浆液对动物进行主动免疫使可育性降低。但是，由于这种匀浆液中组分很多，几乎不可能鉴定出与可育性下降有关的抗原。另外，使用这样一种复杂的混合物，可能会造成不良的、可能有害的副作用。
不同的研究人员利用包括SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和高压液相色谱（HPLC）在内的色谱法所作的研究，最终鉴定出了不同哺乳动物种属的许多透明带蛋白。如下所述，由Timmons和Dunbar（《免疫生殖展望：概念和避孕》，第242-260页，Mathur，S.和Fredericks，C.M.编，New York，Hemisphere Pullishing Co.，1988）汇编的数据，列举了已经过定性鉴定的一些透明带蛋白的例子。
从猪体内分离出的透明带蛋白包括：PZⅠ，一种由Dunbar等人分离出的40-110kD蛋白（Biol.Reprod.24∶111，1981）;PZⅡ（一种70-110kD蛋白）、PZⅢ（一种95-118kD蛋白）、PZⅣ（一种18-25kD蛋白），均由Dunbar等人分离（Biol.Reprod.32∶619，1985）;90K（一种89-119kD蛋白）、65K（一种61-83kD蛋白）、55K（一种47-66kD蛋白）、25K（一种18-26kD蛋白），均由Hedrick，J.L.和Wardrip，N.J.分离（Biochem.157∶63,1986）；ZP1（一种82-118kD蛋白）、ZP2（一种58-96kD蛋白）、ZP3（PPZA，一种40-74kD蛋白）、ZP4（一种21kD蛋白），均由Subramanian等人分离（Biol.Reprod.24∶933，1981）;87K（ZP1/ZP2，一种77-97kD蛋白）、58K（一种40-70kD蛋白），均由Yurewicz等人分离（Biol.Reprod.29∶511，1983）；脱糖基化PZⅠ（一种35kD蛋白）、PZⅡ（一种55kD蛋白）、PZⅢ（一种80kD蛋白），均由Skinner和Dunbar分离（《避孕和促进可育性的免疫途径》，G.P.Talwar编，New York:Plenum，第251-268页，1986）；分子量为45kD的脱糖基化ZP3，由Sacco等人分离（J.Reprod.Fertil.76∶575，1986）。
分离出的兔透明带蛋白包括：分子量分别为68-125kD、80-100.5kD和100-132kD的RZⅠ、RZⅡ和RZⅢ，均由Dunbar等人分离（Biol.Reprod.24∶1111，1986）；分子量分别为100-118kD、83-110kD和80-92kD的ZP1、ZP2和ZP3，均由Sacco等人分离（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981）；分子量分别为65kD和80kD的脱糖基化RZⅠ和RZⅡ，均由Skinner和Dunbar分离（《避孕和促进可育性的免疫途径》，G.P.Talwar编，New York∶Plenum，第251-268页，1986）；脱糖基化RZⅢ，一种由Timmons和Dunbar分离的90kD蛋白（Biol.Reprod.36∶1275，1987）。
已分离出了许多小鼠透明带蛋白，其中包括：分子量分别为200kD、120kD和83kD的ZP1、ZP2和ZP3，均由Bleil和Wassarman分离（Dev.Biol.76∶185，1980）；分子量分别为166-122kD和90-92kD的ZP1和ZP2，由Sacco等人分离（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981）。Bleil等人和Sacco等人所报道的小鼠ZP1和ZP2分子量的差异，可能是由于使用的是非还原条件下的双向PAGE，而Sacco使用的则是还原条件下的双向PAGE。
猫透明带蛋白CZⅠ和CZⅡ由Maresh和Dunbar分离（J.Exp.Zool.244∶299，1987），其分子量分别为50-110kD和90-110kD。
Maresh和Dunbar（J.Exp.Zool.244∶299，1987）还分离出了狗透明带蛋白DZⅠ、DZⅡ和DZⅢ，其分子量分别为50-110kD、70-95kD和90-100kD。
Sacco等人（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981）描述了分子量分别为63-78kD、63-70kD、47-51kD和43-47kD的鼠猴ZP1、ZP2、ZP3、和ZP4。在同一出版物中，Sacco等人描述了分子量分别为80-120kD、73kD和59-65kD的人ZP1、ZP2和ZP3。
迄今为止，很少有哺乳动物透明带基因或蛋白得到分离和顺序测定。没有一种基因或蛋白曾成功用来生产有效的免疫避孕药。关于各种哺乳动物的透明带中所存在的蛋白数目和特性（如分子量），本领域技术人员没有达成一致看法，而且，纯化这些高度糖基化的蛋白也有一些困难，这都阻碍了为利用透明带蛋白生产具有可预测功能的有效免疫避孕药所作的尝试。
许多研究小组已成功地克隆出了编码各种哺乳动物透明带蛋白的cDNA或基因。
Ringuette等人（Dev.Biol.，127∶287-295，1988）和Liang等人（Mol.Cell Biol.，10∶1507-1515，1990）报道了分别编码透明带蛋白ZP3和ZP2的小鼠DNA的克隆。这些克隆是通过用抗ZP3和抗ZP2抗体筛选小鼠cDNA文库而得到的。在小鼠ZP3和ZP2之间未发现有顺序同源性。
Ringuette等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶4341-4345，1986）报道了小鼠ZP3部分cDNA克隆的分离，该克隆与小鼠、大鼠、狗、牛和人的完整基因组DNA杂交，但不与猪或兔的基因组DNA杂交，除非杂交在很不严格的条件下进行。由Ringuette（Dev.Biol.127∶287-295，1988）定性鉴定的全长ZP3 cDNA，相当于一个具有相对较短的5′和3′非翻译区和一个约1317个核苷酸的开放读码的种系特异性mRNA，该mRNA有一个200-300个核苷酸的额外多聚A尾部。Ringuette还发现，大鼠、兔、狗和牛的卵巢能转录与小鼠ZP3cDNA杂交的mRNA，而ZP3转录本具有相似的分子量。Liang等人（Mol.Cell Biol.10∶1507-1515，1990）证明，ZP2的核酸顺序和推测出的氨基酸顺序与ZP3的顺序明显不同，但它的5′和3′非翻译区具有同样的短基序。据报道，ZP2mRNA只有一个2，139个核苷酸的开放读码，编码相当于713个氨基酸的80，217道尔顿的多肽。
Chamberlin和Dean（Dev.Biol.131∶207-214，1989）及Kinloch，R.A.等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶6409-6413，1988）报道了小鼠ZP3基因的克隆。据报道，小鼠ZP3基因在8.6kbp的转录单元中有8个外显子和7个内含子。
Kinloch等人（Dev.Biol.142∶414-421，1990）报道了由仓鼠基因组DNA文库克隆仓鼠基因组ZP3DNA，所述文库是用小鼠ZP3DNA作探针筛选出来的。仓鼠ZP3基因有一个7900个核苷酸的转录单元，据发现，该基因含有7个内含子和8个外显子。仓鼠ZP3蛋白约有81%与小鼠ZP3蛋白同源。仓鼠转录本含有1266个核苷酸，比小鼠ZP3mRNA少6个核苷酸。
Chamberlain和Dean（Proc.Natl.Acad.Sci.USA87∶6014-6018，1990）报道了用小鼠ZP3 cDNA作探针，由人基因组DNA文库克隆人ZP3。人ZP3基因由18.3kbp的转录单元中的8个外显子组成。这些外显子的大小与小鼠ZP3的大小几乎相同，编码区的核苷酸顺序有74%同源。人ZP3转录本与小鼠ZP3mRNA很相似，都具有短的5′和3′非翻译区，都只有一个1272个核苷酸的开放读码，编码424个氨基酸的蛋白。
授予Dunbar的美国专利4，996，297报道了用抗ZP1和抗ZP2抗体作筛选探针，分离三个编码兔ZP1和ZP2蛋白的免透明带克隆。Dunbar专利的图4中称为P2和P3的顺序，分别代表812和1705个核苷酸的兔ZP cDNA。
Schwoebel等人（J.Biol.Chem.266∶7214-7219，1991）利用种间交叉亲和纯化的抗血清分离并鉴定了编码55kD免透明带蛋白的全长cDNA（称为rc55）。该cDNA所编码的蛋白与Liang所描述的小鼠ZP2蛋白有某种相似性。然而把rc55与小鼠ZP3蛋白比较却没有发现任何同源性。
克隆的ZP DNA及其编码蛋白的功能活性尚未得到充分鉴定，它们作为免疫避孕药的潜在用途也尚未得到阐明。
为了开发用于可育性控制的有用透明带产品，特别是疫苗形式的产品，迫切需要能够从感兴趣的某种动物中纯化、分离和鉴定透明带蛋白。由于有疫苗生产所需的这些蛋白的纯度等因素，以及与这些蛋白的纯化有关的高成本和许多问题，迫切需要确认感兴趣的特定物种透明带蛋白的DNA顺序和氨基酸顺序。有了这些已知的、经过分离和鉴定的透明带蛋白，就可以了解每种透明带蛋白的功能，就可以根据特定透明带蛋白的特定功能特性，对特定的哺乳动物物种设计出可育性控制产品。
因此，非常有用而又迫切需要的是，提供经过分离纯化的、经过顺序测定和特性鉴定的重组透明带蛋白，这样就有可能开发出具有可重复的诱导暂时性和/或永久性不育的特定效果的可育性控制产品。这些产品在用于诱导暂时性不育时，将有利地具有长期持续的效果，从而尽可能减少了为维持不育而必须给予免疫避孕药的次数。
本发明提供用于在雌性哺乳动物（包括人）体内诱导可重复的暂时性或永久性不育的新方法和材料，该方法是选择性给予同源和/或异源哺乳动物ZP蛋白或其具有免疫避孕活性的片段，这些片段在下文中称为ZPA、ZPB和ZPC。“可重复”的含义是，与先有技术通过给予ZP蛋白（其形式为这些蛋白的混合物）诱导暂时性不育的做法不同，本发明达到其暂时性不育效果的方法是给予ZPA和/或ZPB，而其形式能够使暂时性不育的持续时间可控，并能以可控和/或可预测的方式维持在开或关的状态。实现这一目标的方法主要是给予本发明的高度纯化的ZPA和ZPB蛋白或其具有免疫避孕活性的片段，例如重组形式，因而基本不含ZPC。具有免疫避孕活性的片段是指能够诱导不育的ZP蛋白片段。
本发明的一个方面提供在哺乳动物体内诱导可重复的暂时性不育的方法，该方法是给予主体雌性哺乳动物选自哺乳动物ZPA、ZPB及其组合的透明带蛋白（或其片段），给予的剂量能有效刺激所述哺乳动物产生识别所述哺乳动物的ZPA或ZPB蛋白的抗体。目前优选的是，用于这些方法的哺乳动物ZPA和ZPB得自与主体哺乳动物相同的哺乳动物物种，但也可考虑使用异源物种的蛋白。可以考虑使用哺乳动物ZPA或ZPB蛋白的纯化分离物，例如用色谱分离法得到的蛋白。预计使用由重组方法得到的蛋白是最优选的。
本发明的另一方面提供在雌性哺乳动物体内诱导永久性不育的方法，该方法是以基本不含ZPA和/或ZPB的形式给予主体雌性哺乳动物重组哺乳动物ZPC蛋白（或其片段），给予的剂量能有效刺激所述雌性哺乳动物产生识别所述哺乳动物的ZPC蛋白的抗体。与诱导暂时性不育的情况相同，优选使用同源物种的ZPC，但不是必须这样做，蛋白可以得自天然来源，也可以由重组方法产生。本发明还考虑使用经过修饰的ZPC蛋白，包括（但不限于）棕榈酰化的蛋白和经过脱乙酰壳多糖修饰的蛋白。
对暂时性不育诱导方法的兽医应用来说，目前优选的ZPA、ZPB和ZPC，蛋白包括猪、兔、狗、猫、牛和猕猴的ZP蛋白。
本发明的另一方面提供用于在雌性哺乳动物（包括人）体内诱导可重复的暂时性不育的药物组合物，该组合物包含有效剂量的选自哺乳动物ZPA和ZPB（基本不含ZPC）的透明带蛋白（或其片段），以及一种或更多种可药用的载体、稀释剂和佐剂。本发明还考虑使用经过修饰的ZPA和ZPB蛋白（例如棕榈酰化的蛋白或经过脱乙酰壳多糖修饰的蛋白）。
本发明的另一方面提供新的经过纯化和分离的DNA顺序，这些顺序编码猪ZPA、ZPB和ZPC，如在1、3和5号顺序中所列的DNA顺序所说明的。另外，提供了一些经过纯化和分离的DNA顺序，这些顺序编码：兔ZPC，如7号顺序中所列的DNA顺序所说明；狗ZPA和ZPC，如9号和11号顺序中所列的DNA顺序所说明；猫ZPA、ZPB和ZPC，如13、15和17号顺序中所列的DNA顺序所说明；牛ZPA、ZPB和ZPC，如19、21和23号顺序中所列的DNA顺序所说明；人ZPA和ZPB，如42号和40号顺序中所列的DNA顺序所说明，并作为人DNA插入片段包含在λ噬菌体克隆A1和A4中（ZPA），或作为人DNA插入片段包含在λ噬菌体克隆1-1和4-9中（ZPB）。
本发明的多核苷酸顺序可用于用重组法生产ZPA、ZPB和ZPC蛋白，并可作为探针用于用杂交法分离编码相应透明带蛋白的异源物种多核苷酸。
本发明还提供新的宿主细胞，尤其是单细胞真核和原核细胞，这些宿主细胞已用本发明的多核苷酸稳定转化或转染，转化或转染的方式允许ZP蛋白（或其有免疫意义的片段）在该宿主细胞内表达。表达这些ZP产物的宿主细胞在培养于合适的培养基中时，特别适用于大规模生产方法，从而用这些方法从细胞或培养细胞的培养基中分离出糖基化或非糖基化形式的所需多肽产物。
因此，本发明所提供的重组多肽包含ZPA、ZPB和ZPC，以及这些透明带蛋白的完全等价物，包括糖基化和非糖基化形式、变异体及其免疫活性片段，这些片段保留了大部分生物活性，即这里所讨论的透明带蛋白的至少一种生物活性，例如在给予哺乳动物后刺激这里所讨论的抗体产生的能力。这些免疫活性片段可以定义为：含有至少一个在按本发明给予哺乳动物后能有效刺激抗体产生的抗原决定基。
本发明的另一方面提供一种分离编码其他哺乳动物ZPA、ZPB和ZPC蛋白的核酸顺序的方法，该方法是在严格条件下，使异源物种的ZPA、ZPB和/或ZPC探针与得自感兴趣哺乳动物物种的cDNA或基因组DNA文库杂交。
更具体地说，本发明的一个方面提供分离编码人ZPA和ZPB的核酸顺序的方法，该方法是在严格条件下，使来自异源物种的编码ZPA和/或ZPB的顺序杂交。
参照附图来考虑以下对本发明目前优选的实施方案所作的详细描述，本发明的其他方面和优点将很容易理解，附图中：
图1是质粒载体pZ90的示意图；
图2是质粒载体pZ98的示意图；
图3是质粒载体pZ156的示意图；
图4是编码人ZPB的EcoRI片段的排列示意图。
图5是质粒载体pZ169的示意图；
图6是质粒载体pZ145的示意图。
本发明涉及哺乳动物透明带蛋白，这些蛋白被鉴定为三个大类：ZPA、ZPB和ZPC。之所以这样分类是因为，对各种哺乳动物卵巢cDNA文库进行反复筛选后，回收到的克隆编码具有显著同源性的三组不同的蛋白，这三组蛋白在这里命名为ZPA、ZPB和ZPC。虽然在不同的动物物种中观察到编码ZPA、ZPB或ZPC的DNA顺序之间有相似性，但在各物种的ZPA、ZPB和ZPC蛋白之间却几乎没有发现什么同源性。
编码透明带蛋白A、B和C的DNA顺序及其推测的各种哺乳动物物种ZP的氨基酸顺序，列于1-24号顺序中。应该理解，特定动物的DNA顺序可能会由于等位基因变异现象而稍有变化。预计不同动物间确切的DNA顺序会有小的差异，由于顺序测定方法不够有效也会造成微小的错误。这些变异体包括在本发明的范围内。
上述透明带DNA顺序是由特异性透明带抗体或已知的透明带DNA探针筛选出的卵巢cDNA文库得到的。将分离出的顺序与已公开的蛋白或DNA顺序作比较，并在分离出其他克隆时与其他克隆作比较，并利用这一比较对上述克隆进行分类和鉴定。
术语“透明带蛋白”的含义包括全长蛋白ZPA、ZPB和ZPC，以及包含在这些蛋白内的预期变异体、免疫活性片段或肽。术语“透明带DNA”的含义包括那些编码透明带蛋白的核酸顺序或其片段。
现已根据编码各种哺乳动物ZP的蛋白的DNA中的同源性，确定了三大类哺乳动物透明带蛋白。ZPA包括以前在文献中各不相同地称为ZP1、ZP2和ZP3的肽；ZPB包括以前各不相同地称为ZP3α和rc55的肽；ZPC包括以前各不相同地称为ZP3β和ZP3的肽。
特定一类内的各种不同透明带蛋白与每类中一致顺序的同源性示于表1。该一致顺序是利用Microgenie顺序分析程序（Beckman Instruments，Inc.Spinco Division，Palo Alto，CA）得到的。所排出的顺序在一致顺序中应该是某个残基的给定位置肯定是该残基的最小百分比是50%。相应于ZPA、ZPB和ZPC蛋白氨基酸一致顺序的DNA顺序，分别列在25、26和27号顺序中。
表1
推测ZP蛋白氨基酸的同源性
ZPA ZPB ZPC
狗 78.9% -- 77.3%
猫 78.4% 70.9% 77.5%
牛 77.2% 80.4% 77.2%
猪 73.0% 77.8% 79.0%
兔 70.1% 74.6% 71.3%
小鼠 61.6% -- 69.6%
人 -- -- 76.9%
仓鼠 -- -- 70.5%
各种透明带蛋白的推测氨基酸顺序，提示ZPA、ZPB和ZPC的近似未糖基化分子量分别为75kD、55kD和45kD。有关DNA顺序同源性和推测氨基酸顺序同源性更详细的分析，叙述于实施例13、14和15中。
出人意料地发现，给予宿主动物特定的一类透明带蛋白，产生特定的免疫避孕效果；对所给予的适当ZP蛋白进行选择，就永久性不育还是暂时性不育而言能够诱导出所要求的避孕效果。例如，用透明带蛋白C给动物接种，可在该动物体内诱导出识别内源性ZPC的抗体效价，导致该动物的卵巢丧失卵母细胞，从而造成永久性不育。相反，用透明带蛋白A、B或其组合给动物接种，可诱导出不识别ZPC但识别ZPA和ZPB的抗体效价。这使动物在抗ZPA和/或抗ZPB抗体保持高价的时间内有重量周期但不育。当这些抗体效价下降时，不育效果消失，动物重新获得可育性。
据观察，用经过分离纯化和鉴定的ZPA、ZPB和ZPC蛋白进行接种时，如果触发自身免疫反应，所产生的自身抗体特异地识别受免疫动物自身的特异透明带蛋白，则对受免疫动物产生特定的效果。按本发明诱导出的抗体的这种自我识别作用，可以用血清抗体识别同源物种透明带蛋白上的至少一种抗原决定基的能力来定义和鉴定。
在本发明的优选方法中，用重组ZPA、ZPB或ZPC或其片段来免疫动物。重组蛋白或肽可以属于同源物种，也可以得自具有共同抗原决定基的异源物种透明带，前提条件是这些共同的抗原决定基具有诱导所需的自身免疫反应的功能。
可以用化学方法使重组蛋白或肽片段与免疫增强剂如钥孔戚血蓝蛋白（KLH）和胞壁酰二肽（MDP）等结合，也可以把该片段制成融合蛋白，如与外源蛋白氨基酸在氨基末端和/或羧基末端融合。给予本发明的蛋白或片段后刺激抗体生成的完全常规的方法是公知的。同样，涉及给予针对本发明透明带蛋白或片段的抗体本身（如抗ZPA抗体、抗ZPB抗体或抗ZPC抗体）的被动免疫技术，也在本发明的范围内。详细描述见Dean的PCT申请WO90/15624，该申请的公开内容全部列入本文作参考。
因此，为诱导狗的永久性不育，可以采用以细菌融合蛋白形式表达（或与免疫增强剂结合）的重组狗ZPC，其中有活性的狗ZPC蛋白得到保留，可参与与抗原呈递细胞的相互作用。然后把表达出的蛋白给予宿主狗，诱导出自身免疫反应，该反应中生成的抗体识别狗透明带蛋白C。这种能特异识别狗ZPC蛋白或其聚集体的自身免疫作用，在经过接种的狗体内诱导出永久性不育，这种不育是由于狗卵巢内卵母细胞的丧失造成的。
另外，也可以给予狗非同源物种的ZPC，例如与狗ZPC交叉反应的重组猪ZPC或其肽，以达到类似的绝育效果。但是，如果诱导出（或者在被动免疫时给予）能识别宿主自身的固有透明带的抗体，则不能实现这种绝育效果。
在本发明的一个可替代的实施方案中，给予宿主物种自身的A和/或B类透明带蛋白，或者给予能诱导抗宿主ZPA和/或ZPB蛋白的另一物种的相关A和/或B蛋白，所产生的不育效果与由ZPC类抗原产生的不育效果不同，用ZPA和ZPB蛋白接种的生理效果是暂时性的效果。“暂时性不育”在这里定义为，在抗自身透明带蛋白的抗体在宿主动物的循环系统中维持在避孕有效浓度（例如在狗体内约为1∶250的效价）时，这种不育就得以维持，而在抗自身透明带蛋白的抗体下降到避孕有效浓度的下限以下时，这种不育则消失。抗自身透明带抗体的下降导致可育性的恢复，但在卵巢中并没有重大生理变化的迹象。一般来说，抗体效价的下降是随着哺乳动物宿主体内的自然过程而发生的，但降低抗体效价的其他方法也在本发明的范围之内。
维持不育所需的抗自身透明带蛋白A和B的避孕有效抗体效价，将随受接种动物的种属及所给予的重组ZPA或ZPB肽的种类而变化，但很容易确定，例如用以下方法：用不同剂量的特异性抗原测试一组所需的动物物种，用已知的ELISA技术测定诱导出的抗自身抗体的效价，使该效价与生殖指标（如有生理周期、激素水平等）相关。一般来说，高于1∶250的抗体效价是避孕有效的。
根据氨基酸顺序同源性，预计特定一类透明带蛋白中的所有蛋白都含有在哺乳动物物种间有交叉反应的功能性抗原决定基。但是，这些有交叉反应的功能性抗原决定基没有得到鉴定的情况下，优选的选择性避孕药是同源物种的透明带蛋白或其抗体。
考虑本发明的下列说明性实施例将会对本发明有更完整的理解。这些实施例中：实施例1阐述编码猪ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分离；实施例2涉及兔ZPC DNA的分离；实施例3涉及编码狗ZPA和ZPC的DNA的分离；实施例4阐述编码ZPA、ZPB和ZPC的猫DNA的分离；实施例5涉及编码牛ZPA、ZPB和ZPC的DNA的克隆和分离；实施例6和7叙述了用天然来源的猪透明带蛋白对狗进行免疫避孕处理；实施例8涉及对实施例6和7中所测试的动物进行的血清化学研究；实施例9和10阐述狗ZPC融合蛋白的重组生产及其在狗中的免疫避孕应用。实施例11涉及用本文所述方法分离编码人ZPA和ZPB的DNA。实施例12涉及编码猕猴ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分离和顺序测定。实施例13-15分别涉及哺乳动物ZPA、ZPB和ZPC的DNA顺序和推测氨基酸顺序的比较。实施例16涉及用HSPZ和经过分级分离的HZPC免疫猕猴。实施例17涉及哺乳动物透明带蛋白抗原决定基的图谱测定。实施例18叙述了用重组ZPC蛋白免疫狗。实施例19涉及用重组ZP蛋白接种牛和猫。
实施例1
分离编码猪透明带蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA顺序
取一个由Clone Tech公司（Palo Alto，CA）用工业方法由分离自14周龄猪的卵巢制备的λgtll cDNA文库，用得自E.C.Yurewicz并描述于文献（Keenan等，Biol.Reprod.，44∶150-156，1991）的抗ZP3β抗体对该文库进行筛选。鉴定出8个候选克隆。
如Yurewicz等人所述（J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987），构建一个简并DNA寡核苷酸探针（19bp），以代表N末端猪ZP3β一个短部分的所有可能顺序。该简并探针的顺序列于28号顺序中。
用简并DNA寡核苷酸探针进行表达筛选，分离出8个候选克隆，对这8个克隆进行Southern分析，结果8个候选克隆中有两个出现杂交。然后把这两个被简并探针识别出的克隆亚克隆到pBS KS质粒（STRATAGENE Cloning Systems，La Jolla，CA）中，以便用测序酶和SEQUENASE手册（U.S.Biochemical，Cleveland，OH）所述的程序进行顺序分析。其中插入片段大小约为1200碱基对的一个克隆B-8，含有一个与以前由Ringuette等人（Dev.Biol.，127∶287-295，1988）鉴定的小鼠ZP3N末端顺序同源的顺序。另一个克隆B-6的插入片段大小约为1000碱基时。这两个杂交克隆都缺乏与小鼠ZP3基因末端部分的同源性，表明它们都不含有基因的C末端部分。
然后用DNA杂交法筛选14周龄猪卵巢文库。将约150，000噬斑形成单位铺在含有大肠杆菌Y1090的琼脂平板上。于37℃下培养过夜后，制备噬斑的尼龙膜印迹，并用前面通过用28号顺序中列出的简并寡核苷酸探针筛选而分离得到的B6和B8克隆进行筛选。
将滤膜置于含有5X盐水、磷酸钠、EDTA缓冲剂（SSPE）、5X Denhardt氏试剂、100μg/ml鲑精DNA、30%甲酰胺和0.5%SDS的溶液中，于42℃下预杂交3小时。12片滤膜（132mm）使用约50ml预杂交溶液。预杂交后，加入10ng新放射标记的DNA探针在30%甲酰胺、5xSSPE中的溶液。在95℃下使探针热变性3-5分钟，继续用DNA探针于42℃下杂交过夜。然后在55℃下用100ml 5xSSPE将杂交后的滤膜洗涤两次，每次洗约1小时。然后在室温下用250ml 5xSSPE冲洗滤膜，并令其空气干燥。在-70℃下用增感屏使干燥的滤膜对X光胶片曝光至少8小时，然后冲洗胶片供目测分析。
在所分离出的其他克隆中，有两个含有猪ZP3β基因C末端部分的克隆。将一个克隆λ5-1亚克隆到质粒pBSKS中并测定其顺序。这个称为pZ57的质粒含有1266个碱基对的ZP DNA插入片段，与已知的小鼠ZP3相比较似乎编码猪ZP3β的全长氨基酸顺序。该克隆的推测氨基酸顺序与Yurewicz等人（J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987）所报道的ZP3β已知N末端氨基酸顺序的排列，以及相应于E. C. Yurewicz所提供的氨基酸255-274的ZP3β内部肽顺序，证实了该克隆编码猪ZP3β的本性。
这个称为猪ZPC的克隆的DNA顺序列在5号顺序中，其推测氨基酸顺序列在6号顺序中。
用兔透明带rc55cDNA作探针，对14周龄猪卵巢cDNA文库进行进一步的筛选（见Schwoebel等，J.Biol.Chem.，266∶7214-7219，1991）。
分离出一个约1700碱基对的候选克隆λ2-1，并将其转移到测序质粒pBS KS中。用SEQUENASE手册（US Biochemical Corporation，Cleveland，Ohio）所述的方法测定猪DNA插入片段的DNA顺序和推测氨基酸顺序。经过测序的克隆含有1620碱基对。通过将推测的氨基酸顺序与E.C.Yurewicz所提供的猪ZP3α氨基酸206-222、271-279和328-344的已知蛋白顺序的有关部分进行排列，证实了该克隆含有猪ZP3α基因的全长拷贝。这个称为猪ZPB的克隆的DNA顺序列在3号顺序中。其推测氨基酸顺序列在4号顺序中。
利用上述步骤，并使用编码狗ZPA的DNA探针（如下面的实施例3所述制得，9号顺序）。得到约1300碱基对的单个克隆λ3-5。将该克隆的大小与分离自小鼠（Liang等，Mol.Cell Biol.10∶1507-1515，1990）、兔（Dunbar，美国专利4，996，297）和狗（见下面的实施例3）的ZP2基因作比较，估计该克隆代表理论猪ZPA基因的N末端60%。
然后用该克隆再次筛选猪卵巢文库，又得到三个克隆，两个小克隆和一个大得足以包含全长顺序的克隆。测定约2200碱基对的大候选克隆λB的顺序，所得数据表明，如将该ZPA克隆与小鼠ZP2基因和实施例3所述的狗ZPA基因一起排列，则发现该ZPA克隆只缺少全长顺序中的约7个碱基对，包括ATG起始密码子。这个称为猪ZPA的克隆的DNA顺序列在1号顺序中，其推测氨基酸顺序列在2号顺序中。
这个分离出的猪克隆含有与三个已得到鉴定的猪透明带蛋白的公开顺序相应的顺序，这三个蛋白是：在授予Dunbar的美国专利4，996，297中公开的ZP1（80kD）、ZP2（62kD），以及由Hasegawa等人（Abst.NO.382，Meeting Soc.Study Reprod.，1991年7月）公开的ZP4（21kD）。这些结果表明，一个单一的克隆编码了一个以前曾认为是以三个独立蛋白（即ZP1、ZP2和ZP4）存在的透明带蛋白。这进一步表明，只有三个主要猪透明带基因编码本文称为ZPA、ZPB和ZPC的三个主要透明带蛋白。ZPA包括那些以前称为ZP1、ZP2和ZP4的蛋白。ZPB相应于ZP3α，ZPC相应于以前鉴定的ZP3β（Yurewicz等，J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987）。
实施例2
编码兔ZPC蛋白的DNA顺序的分离和纯化
从5周龄兔体内摘取卵巢，用Fast TrackTMmRNA分离试剂盒，按Fast TrackTM说明书（version3.1，目录号K1593-02，Invitrogen，San.Diego，CA）所述的方法来制备cDNA。利用Lambda LibrarianTM试剂盒（Invitrogen，San Diego，CA）按制造商的说明来制备cDNA，并将cDNA克隆到λgt10中。将约150，000个噬斑形成单位铺在含有大肠杆菌Y1090的琼脂平板上。于37℃下培养过夜后，制备菌落的尼龙膜印迹，并利用实施例1所述的筛选方法，用猪ZPC DNA探针进行筛选。所用的探针为列在5号顺序中的猪ZPC顺序。
两个阳性克隆λR4和λR5与猪ZPC DNA杂交。在琼脂糖凝胶上估计这两个克隆各自的大小约为1300碱基对。λR4和λR5都如实施例1所述进行顺序测定。除λR5在5′端含有4个额外的核苷酸外，这两个顺序完全相同。测得的DNA顺序与编码猪ZPC的DNA顺序约75%同源。
编码兔ZPC蛋白的DNA顺序列在7号顺序中。其推测氨基酸顺序列在8号顺序中。
兔ZPA和ZPB蛋白以前曾分别由Dunbar的美国专利4，996，297鉴定为P2和P3。
实施例3
编码狗透明带蛋白ZPA和ZPC的DNA顺序的分离
大致按照实施例1所述的方法，由Clone Tech公司（Palo Alto，CA）在λgt11中用工业方法制备16周龄狗卵巢cDNA表达文库。用针对热溶解狗透明带产生的抗体筛选狗卵巢cDNA文库。热溶解狗透明带（HSDZ）是大致按照Dunbar等人（Biochem.19∶356-365，1980）所述的方法制备的，但用成套刮刀剪碎卵巢。
用250μgHSDZ和250μg MDP免疫兔。以大约三周的间隔再进行两次加强免疫。用所得的兔血清来筛选狗卵巢cDNA表达文库。得到7个候选克隆。用Southern印迹分析法如下进行交叉杂交实验。首先用约1300碱基对的最大克隆λ26-1作为Southern印迹中所有其他克隆的探针，鉴定出3个其他克隆。然后用其余克隆中分别约为800和1000碱基对的最大克隆λ20-1和λ7-1作为Southern印迹中的探针。这些探针没有鉴定出更多的克隆。7个候选克隆彼此进行的这一交叉杂交分析表明，其中有4个克隆相关，例如，有4个克隆与λ26-1杂交，而其余三个即λ20-1、λ7-1和λ19-3则彼此独立。
将4个相关克隆中最大的λ26-1亚克隆到pBSKS质粒中，以便按实施例1所述的方法进行顺序分析。分析出的顺序证实了1278碱基对的长开放读码的存在，该开放读码编码约426个氨基酸的蛋白。把该克隆的推测氨基酸顺序与已知透明带蛋白的顺序比较表明，该克隆所编码的蛋白与下列蛋白相关：如Ringuette等人（Dev.Biol.127∶287-295，1988）所报道的小鼠ZP3（ZPC）、如Kinloch等人（Dev.Biol.，142∶414-421，1990）所报道的仓鼠ZP3、如Chamberlin等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87∶6014-6018，1990）所报道的人ZP3、猪ZPC蛋白（见实施例1）。这个称为狗ZPC的克隆的DNA顺序列在11号顺序中。其推测氨基酸顺序列在12号顺序中。
把其余3个彼此独立的候选克隆亚克隆到pBS KS质粒中，以便如上所述进行顺序分析。如上所述，用计算机分析法把所测得的800碱基对克隆λ20-1的顺序与已知的ZP顺序作比较，发现λ20-1的顺序与小鼠ZP2（ZPA）（Liang等，Mol.Cell Biol.10∶1507-1515，1990）和猪ZPA（见实施例1）相关。
然后用λ20-1的800碱基对片段作杂交探针，再次筛选狗cDNA文库。又鉴定出两个候选克隆，并把约2800碱基对的较大克隆λ7A亚克隆到pBS KS质料中以便进行顺序分析。把该顺序与编码透明带蛋白的已知顺序进行比较表明，候选克隆λ7A含有全长ZPA顺序，但N末端顺序不正确，例如，通过与实施例1中提到的已知小鼠ZP2和兔ZPA顺序一起排列，确定该克隆含有额外的600碱基对。然后把约1000碱基对的第二个候选克隆λ9-2亚克隆到质粒pBS KS中并测定其顺序。第二个克隆的顺序表明了正确N末端顺序的存在，但是，通过与小鼠ZP2和兔ZPA基因一起排列，确定第二个克隆的顺序只包含全长克隆的大约N末端40%。但是这两个cDNA克隆重叠后却得到全长顺序。
把每个克隆的适当片段如下进行亚克隆，以产生含有2028碱基对开放读码的正确全长透明带克隆，该开放读码编码约676个氨基酸的蛋白。用EcoRI消化λ7A DNA，得到两个插入片段（2000bp和800bp）。把这两个片段分别亚克隆到pBS KS中，分别得到pZ36和pZ37。质粒pZ37携有该顺序的C末端部分。从λ载体中移出λ9-2DNA插入片段，并将其亚克隆到pBS KS中，得到pZ38。用HindⅢ消化质粒pZ36，以除去λ7A基因片段约1350bp的N末端部分（约850bp的无义DNA和500bp的编码顺序）。这种消化还除去了EcoRI插入片段的一个末端，留下了一个单一的EcoRI位点。然后把pZ37 EcoRI插入片段移入经过修饰的pZ36（pZ36△1）中留下的单一EcoRI位点中，以重新建立存在于λ7A插入片段（1450/2800bp）中的DNA相对结构取向。用HindⅢ把这个组合质粒打开，并插入pZ38的携有N末端ZP DNA顺序的HindⅢ片段，产生质粒pZ39，该质粒是携有全长狗ZPA顺序的pBS KS。这个狗ZPA基因的DNA顺序列在9号顺序中。其推测氨基酸顺序列在10号顺序中。
实施例4
编码猫透明带蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA顺序的分离
从5只约3-4月龄的猫体内分离卵巢。利用Fast TrackTMmRNA，分离试剂盒（Invitrogen, San Diego, CA，目录号K1593-02），并采用该试剂盒所提供的程序，从6个卵巢中分离信使RNA。利用上述程序制备cDNA，并如实施例2所述克隆到λgt10中。
将约150，000个噬斑形成单位铺在含有大肠杆菌Y1090的琼脂平板上。于37℃下培养过夜后，用尼龙转移膜制备并筛选噬斑印迹。利用编码猪ZPA、ZPB和ZPC蛋白的DNA探针的等份混合物，并采用实施例2所述的杂交方法，对噬斑进行筛选。共鉴定出81个阳性克隆。其中有12个克隆经过噬斑纯化。分别用猪ZPA、ZPB和ZPC DNA作探针对这些克隆进行Southern分析，结果表明，其中有7个克隆编码ZPC蛋白，有1个克隆编码ZPA蛋白。有4个克隆含有不能用EcoRI消化法分离的插入片段。
有5个ZPC克隆的长度在1200-1350碱基对之间。对一个约1350碱基对的克隆λC-112进行如上所述的顺序分析，发现其推测氨基酸顺序与实施例3获得的狗ZPC蛋白约70%同源。这个猫ZPC克隆的DNA顺序列在17号顺序中。其推测氨基酸顺序列在18号顺序中。
对单个猫ZPA克隆λC-116进行顺序测定，测得其长度约为2215碱基对。推测氨基酸顺序与实施例5中鉴定的狗ZPA蛋白约75%同源。这个猫ZPA克隆的DNA顺序列在13号顺序中。其推测氨基酸顺序列在14号顺序中。
用猪ZPB DNA作探针（3号顺序），再次筛选其余的69个阳性克隆。得到10个阳性克隆。经琼脂糖凝胶电泳法测定，最大的克隆λC-1含有约1.7千碱基。测定该克隆的顺序，发现基推测氨基酸顺序与实施例1所述的猪ZPB蛋白约80%同源2。这个猫ZPB克隆的DNA顺序列在15号顺序中，其推测氨基酸顺序列在16号顺序中。
实施例5
编码牛透明带蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA顺序的分离
用实施例2所述的方法，由五月龄牛卵巢构建cDNA文库。利用编码ZPA（1号顺序）、ZPB（3号顺序）和ZPC（5号顺序）蛋白（如实施例2所述）的DNA探针的等比例混合物，采用实施例2所述的方法，用分别代表各类透明带蛋白的DNA杂交探针筛选牛卵巢文库。初步筛选得到三个候选克隆。分别用在初步筛选中所用的猪ZPA、ZPB和ZPC DNA探针对这些克隆进行Southern分析，结果表明，约650碱基对的一个克隆λB2编码ZPA。约1000碱基对的第二个克隆λB-1编码ZPB。约1200碱基对的第三个克隆λ14编码ZPC。
然后用混合猪ZP DNA探针再次筛选牛卵巢文库，又得到两个克隆。经Southern分析鉴定，这两个克隆编码ZPC。
将ZPA、ZPB和最大ZPC克隆的EcoRI插入片段亚克隆，并分析其DNA顺序。编码这些牛ZPA、ZPB和ZPC片段的顺序分别列在19、21和23号顺序中。其推测氨基酸顺序分别列在20、22和24号顺序中。
实施例6
用经过分级分离的热溶解猪透明带对狗进行免疫
大致按照Dunbar等人（Biochemistry，19∶356-365，1980）所述的方法，但用手动搅肉机代替所述的Zonamatic，制备热溶解猪透明带（HSPZ）。分离后，将透明带蛋白溶解于0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.6）中，并用6M脲强烈透析。对所得的含约12μg HSPZ的2-3ml溶液，用BIORAD Rotofor等电聚焦槽如下进行等电聚焦。用pI范围为3-10的1%两性电解质建立等电梯度。将透明带加到中间范围槽（pI7.0）中，使其在4℃下聚集约4小时，或者聚焦到电压稳定。
收集20个经过等电聚焦得到的部分，并用SDS PAGE法和Western印迹分析法分析猪透明带蛋白。合并含有猪透明带蛋白、pI范围约为3.5-5.5的酸性部分。将各部分透析到0.1M碳酸盐缓冲液（pH9.6）中，并浓缩至约3mg/ml。如下所述用该抗原制备物接种动物。用双向凝胶电泳法分析这个抗原制备物，表明存在有ZPA和ZPB蛋白。然而并未证实该制备物中存在ZPC。
将HSPZ抗原制备物加到50/50水油乳液中，该乳液中加有每剂量含250μg MDP的不完全弗氏佐剂（Sigma，St.Louis，MO）。1ml50/50水油乳液含有0.425ml石蜡油、0.075ml二缩甘露醇单油酸酯、0.5ml含250μg苏氨酰MDP（SYNTEX公司）的PBS，以及下表3所述量的HSPZ。
采用表2所述的方案，用HSPZ免疫4只10-12周龄的随机配种狗。
表2
HSPZ(mg)
首次免疫 0时 0.1
第1次增强免疫 第4周 1.0
第2次增强免疫 第8周 1.25
第3次增强免疫 第12周 0.2
第4次增强免疫 第16周 1.0
第5次增强免疫 第36周 1.0
通过ELISA法监测这些动物产生的抗血清。17周时，抗自身（例如抗狗透明带蛋白）的抗体效价达到最高点（用ELISA法测得为8-16K），然后开始下降。
36周时，切除1只动物的单侧卵巢，将摘除的卵巢切片并用高碘酸希夫氏染色法（PAS）染色以进行组织学观察。卵巢似乎是政党的，因为所有发育阶段中都有卵泡存在。52周时，观察到4只受试动物中有2只表现出动情行为。其余的2只受试动物在大约一年半时表现出动情行为，此时头2只受试动物出现第二次动情。所有受试动物都用有交配能力的雄性动物和人工授精法反复配种，但没有一只动物受孕。在同一时间内，在如实施例10所述的未得到自身效价的各种测试方案中，动物在与相同的雄性动物交配或用人工授精法配种后受孕。
配种期过后两周后，例如54周时，将2只早期出现生理周期的动物切除单侧卵巢，并将摘除的卵巢切片以进行组织学观察。尽管已证实了功能性不育，但卵巢在这一阶段的卵泡活动似乎是正常的。
实施例7
用猪ZPC蛋白进行接种
从E. Yurewicz处得到纯化的猪ZPC蛋白（ZP3β），该蛋白是如文献所述制备的（J. Biol.Chem.，262∶564-571，1987）。
将167μg纯化的猪ZPC蛋白（βZP3）加到50/50水油乳液中制得疫苗，用于首次免疫时该乳液含有完全弗氏佐剂（Sigma No.F5881，St.Louis MO），用于增强免疫时则含有如实施例6所述的含MDP的不完全弗氏佐剂（Sigma No. F5506，St.Louis，MO）。
采用表3所述的方案，给约10-12周龄的5只随机配种狗注射上述ZPC疫苗制备物。
表3
ZPC(mg)
首次免疫 0时 0.167
增强免疫 第3周 0.167
增强免疫 第6周 0.167
增强免疫 第28周 0.167
利用Dunbar所述的方法（Two Dimensional Gel Electrophoresis and Immunological Techniques，1987），用ELISA法监测每只动物的抗自身透明带蛋白（例如抗狗透明带蛋白）抗体效价。用HSDZ的抗原涂布缓冲液（0.1M碳酸钠，pH9.6）中的溶液涂有ELISA微量滴定板。用生物素化的兔抗狗IgG作为第二抗体。用ABC试剂（抗生物素蛋白-生物素化过氧化物酶复合物）和邻苯二胺二盐酸盐及过氧化物底物进行目测观察。只有2只动物产生抗自身抗体，并在第4周时达到16K的自身抗体效价峰值。另3只动物未产生自身抗体效价，但抗猪透明带蛋白抗体效价达到4K的峰值。在第20周到第36周期间，观察到所有的狗都表现出动情行为。将动物用可靠的雄性动物反复配种。只有具有抗自身透明带蛋白抗体效价的2只动物保持不育。该实验中的所有其他动物都受孕。
动情和配种两周后，将显示自身抗体效价的2只不育狗切除单侧卵巢，摘除的卵巢切片后用高碘酸希夫氏染色法染色以进行组织学观察。组织学观察显示不育狗的卵巢形态有异常。没有观察到有正在进行卵泡发生过程的迹象，而且卵巢丧失了含卵母细胞的卵泡。此外，没有观察到原卵母细胞。
实施例8
由接种动物产生的抗血清的Western分析
为了进一步了解实施例6和7所述的两项研究中所达到的免疫反应和不同生理效果，用各种抗原以Western分析法分析每个试验组中产生的抗血清。这些抗原包括天然猪ZPC、热溶解狗透明带（HSDZ）、重组狗ZPA和ZPB、重组猪ZPC。用由实施例6的受试动物（例如用经过等电聚焦分离的热溶解猪透明带免疫过的动物）得到的抗血清，以及由实施例7的2只受试动物得到的含有抗自身透明带蛋白抗体的抗血清，探测Western印迹。
所得数据表明，经过食用不含可用PAGE分析检测到的ZPC的热溶解猪透明带免疫的不育但有生理周期的狗所产生的抗血清，不识别重组猪或狗ZPC，但识别天然ZPC、HSDZ和重组狗ZPA。相反，由卵巢中已丧失卵母细胞的不育狗得到的抗血清则识别重组ZPC蛋白，即多肽骨架。
抗体对抗原的识别作用的一个关键性差异是，似乎只有从卵巢中已丧失卵母细胞的狗中得到的抗血清才识别重组狗ZPC抗原。而抗血清强烈识别天然ZPC、HSDZ和重组狗ZPA的不育狗则不识别重组狗ZPC。
假定自身免疫对避孕效果来说是必需的，那么上述数据表明，借助抗狗ZPA抗原的自身免疫反应，可以在狗体内达到不育而不出现在组织学上明显可见的卵巢机能障碍。相反，得到组织学验证的将会导致永久性不育的卵巢机能障碍，即卵母细胞的丧失，则需要产生特异识别同源泉物种ZPC蛋白的抗体。
实施例9
重组ZP蛋白的表达
Ⅰ.表达载体的构建
由质粒pUC9（Vierra和Messing，Gene 19∶259-268，1982）和pβgal2（Queen，J.Mol.App.Gen.2∶1-10，1983）的片段构建图1所示的质粒载体pZ90。利用购自New England Biolabs的SalⅠ多接头适配物，将存在于pβgal2中的单个PvuⅡ限制位点转化为SalⅠ位点。通过用SalⅠ消化，切下新的SalⅠ位点与已有的SalⅠ位点之间的DNA顺序，重新连接后筛选缩小的质粒。
将经过修饰的pβgal2质粒中携有λ CI阻遏基因、λpR启动子和lacZ基因（β-半乳糖苷酶）的CalⅠ-NdeI片段，插入pUC9的AccⅠ和NdeⅠ限制位点之间。pUC9质粒携有将质粒保持在大肠杆菌细胞内所需的氨苄青霉素抗性（AmpR）基因和col EⅠ复制起点（ori）。对该组合质粒进行进一步修饰，将ATG起始密码子3′端的BamHⅠ位点（ATG GAT CCN）转化为ATG起始密码子5′端的BglⅡ位点（AGATCTATG）。这是通过用RsaⅠ部分消化质粒而实现的。在若干消化点中有一个位于BamHⅠ限制位点5′约20bp处。当用BamHⅠ消化这个已经过部分消化的质粒时，所产生的某些质粒几乎是全长的。制备一个合成寡聚体（GTACTAAGGAAGATCTATGGATCC）（29号顺序）用于替换已除去的顺序（GTACTAAGGAGG-TTGTATGGATCC）（30号顺序）。这一替换的净效果是置换了3bp，从而产生了BglⅡ限制位点。然后通过用BglⅠ和BanⅡ限制消化，切下含约3000碱基对lacZ基因的DNA片段，然后插入含有BamHⅠ位点的合成寡聚体。用BglⅠ和BanⅡ切割该质粒，然后用核酸酶S1处理，产生平末端。在经过消化的质粒的平末端处插入一个BamHI接头（New England Biolabs）。接着，利用合成接头将λCI阻遏基因和ori顺序之间的PvuⅡ限制位点转化为HindⅢ位点。用PvuⅡ切割PvuⅡ限制位点，并使一个HindⅢ接头（New England Bibolabs）与平末端连接。由于剩下的lacZ顺序缺少天然顺序的并没有8个密码子，所以合成一个由BglⅡ位点起始并编码lacZ野生型基因产物（βgal）N末端顺序的合成寡聚体，用以替代上述8个密码子。
该合成寡聚合体的制备方法是：合成4个分别具有下列顺序的寡聚体：31号顺序（寡聚体1）、32号顺序（寡聚体2）、33号顺序（寡聚体3）、34号顺序（寡聚体4）。寡聚体2和3通过用激酶和ATP处理而在5′端加上磷酸，从而达到磷酸化。然后使寡聚体1和2分别与寡聚体3和4杂交，杂交方法是在100℃保温后在200μM NaCl中缓慢冷却。所得寡聚体的顺序列在35号顺序中。列在35号顺序中的合成寡聚体具有BglⅡ-PvuⅡ末端。对质粒进行限制消化，并使其与该寡聚体连接，从而使该合成寡聚体转换质粒的BglⅡ-PvuⅡ顺序。
所得的质粒命名为pZ90，并示于图1。质粒pZ90可用于利用热不稳定性λCI阻道基因以热诱导法表达重组蛋白。接着，用可化学诱导的启动子ptac（Amann等，Gene 25∶167-178,1983）替换pZ90的可热诱导阻基因和启动子。ptac启动子受lac阻遏物的控制，后者是lacⅠ基因的产物（Farabaugh，Nature 279∶765-769，1978）。利用Innis和Gelfand所述的PCR法（PCR Protocols∶A Guide to Methods and Applications，Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.和White.T.J.编，第1-12页，Academic Press，Inc.，San Diego，CA），由pMC9（Miller等，The EMBO Journal 3：3117-3121，1984）得到lacⅠ基因。所用的引物一端与lacⅠ启动子互补，另一端与lacⅠ基因终止密码子互补。N末端引端携有一个HindⅢ位点。C末端引物携有一个tac启动子顺序，其后是一个BglⅡ位点。N末端引物具有列在36号顺序中的顺序。C末端引物具有如37号顺序中所列的顺序，包括顺序为5′-CACAATGTG-3′的Dra位点。然后，用所得的在两末端分别具有HindⅢ和BglⅡ限制位点的lac Ⅰ-ptac DNA片段，替换pZ90的携有λCI阻遏基因和λpR启动子的HindⅢ-BglⅡ片段。这一替换产生图2所示的质粒pZ98。
Ⅱ.重组ZP DNA的插入
用上述PCR法（Innis和Gelfand），由实施例1中制备的质粒pZ57制备编码ZPC的DNA顺序。质粒pZ57含有由实施例1所述的λgtll克隆5-1得到的全长猪ZPC顺序。在PCR操作过程中，用不含前导顺序和疏水性尾部的引物修饰猪ZPC基因。所用的N末端引物具有列在38号顺序中的顺序。包括顺序为5′-GGATCC-3′的内部BamHI限制位点。所用的C末端相物具有如39号顺序中所列的顺序，包括顺序为5′-GGATCC-3′的SalⅠ限制位点和顺序为5′-CTCGAG-3′的内部XhoⅠ限制位点。经修饰的ZPC基因含有编码ZPC氨基酸1-350的第105-1154碱基对。
在经修饰的猪ZPC基因的5′端加上一个BamHI限制位点，在3′端加上一个XhoⅠ位点、一个六CAT密码子顺序（CAT）6、一个终止密码子、以及一个SalⅠ限制位点。把这个经修饰的猪的ZPC基因插入到pZ98的BamHI-SalⅠ限制位点中，得到猪ZPC表达载体，即图3所示的质粒pZ156。（CAT）6顺序在重组融合蛋白中产生一个C末端六组氨酸（His6）氨基酸顺序，因此便于用亲和色谱法用固定化的金属来纯化融合蛋白。
以如上所述的类似方式，质粒pZ156在用BamHI和XhoI消化后可用于接受任何其他重组ZP基因或基因片段，从而表达出可用金属离子亲和色谱法纯化的βgal融合蛋白。
Ⅲ.猪ZPC融合蛋白在大肠杆菌中的表达
用Chung等人的方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶2172-2175，1989）把表达载体pZ156（图3）转化到大肠杆菌Top10F′株（Invitrogen，San Diego，CA）中。转化的大肠杆菌细胞系称为ZI156株。用该细胞系来表达重组猪ZPC-βgal融合蛋白。
在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria液体培养基（LB）中，于30℃下培养ZI156的细菌培养物，直到细胞密度达到OD600约为1.5。加入异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）（每升培养基3ml 100mM溶液），以诱导由tac启动子的表达，并将细胞于30℃下再培养2-3小时。用离心法收集细胞，所得细胞沉淀于-70℃下冷冻。
将冷冻细胞沉淀悬浮于10mM EDTA中（1g/2-2.5ml），并在50%功率下超声处理两次，每次3分钟，每次超声处理之间在冰浴中冷却。然后将细胞溶解液于3300×g下离心1小时，并保留硬沉淀。用硬沉淀重复该溶解步骤。
为除去残留的EDTA，通过短暂超声处理将最终的硬细胞沉淀分散在少量水中，将该悬浮液离心并弃去上清液。沉淀经洗涤后充分再悬浮于缓冲液A中（6M盐酸胍（GuHCl）、100mM NaH2PO4、10mM TRIS pH8，每克原始细胞沉淀约0.5ml）。将该悬浮液于10，000×g离心45秒，保留上清液，弃去沉淀。
将保留的上清液加到Ni柱上（在缓冲液A中），用10倍柱体积的缓冲液A洗柱。接着分别用5倍体积的缓冲液B-D洗柱，缓冲液B-D各自含有8M脲、100mM NaH2PO4和10mM TRIS，但其pH值依次下降，分别为8、6.3、5.9。用兔抗HSDZ和抗HSPZ作探针，用Western印迹分析法进行筛选，证明重组pZPC-βgal融合蛋白被pH4.5的缓冲液E洗脱出。可以用缓冲液F（pH2.5）（8M GuHCl、200mM乙酸）进行进一步的洗脱。
在8M脲中将用上述程序得到的融合蛋白的最终体积调至0.5ml，并如上所述将其加到0.5ml佐剂中，从而制成给宿主动物注射的最终剂量。每个剂量给一个受试动物皮下注射。
实施例10
用重组ZPC-βgal融合蛋白给狗接种
从已在约2月龄时预先处理过的受试动物中随机选择11只约5-6月龄的混合配种狗。预先处理时使用了热溶解猪透明带或色谱纯化的猪ZP3β与各种作为佐剂的生物聚合物和药物释放载体混合。首次注射6周后，即三个半月龄时，用ELISA法测得所有受试动物的抗HSPZ抗体效价都达到2-16K范围。但所有受试动物都没有出现抗自身抗原（如HSDZ）的抗体效价。
在5-6月龄时，给5只受试动物注射负荷剂量的如实施例9所制备的猪ZPC-βgal融合蛋白。将实施例9中制得的重组ZPC-βgal融合蛋白在终体积为0.5ml的8M脲中调至所需的剂量，并与0.5ml佐剂混合。将250μg佐剂N-乙酰-D-葡糖氨基-β（1，4）-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（GMDP）分散于0.42ml矿物油、0.157ml L-121嵌段聚合物和0.02ml和吐温80中。每个剂量给5只受试动物皮下注射。其余的6只动物留作对照。
以2-3周的间隔总共注射4次后，在所有受试动物中都达到抗自身抗原（如HSDZ）的抗体效价，用ELISA法测得其峰值在2-8K范围内。
有些对照动物在约9月龄时开始出现生理周期，到11月龄时，6只对照动物中有4只已经过了第一个动情期。相反，已接受重组ZPC-βgal融合蛋白的5只受试动物在同一时间内都没有出现重量周期。但是，虽然这些受试动物的第一个动情期推迟了几个月，但最终还是开始有生理周期。在5只经过接种的狗中，有两只在免疫后的第二个动情期期间受孕，而第三只狗在免疫后的第三个动情期期间受孕。然而，其余的两只受试动物在接种后的三个动情周期和几乎两年内都保持不育。
实施例11
编码人透明带蛋白ZPA和ZPB的人DNA顺序的分离
利用购自Stratagene（目录号946203）的人基因组DNA文库分离编码人ZP蛋白的DNA顺序。该文库由克隆到Lambda FixTMⅡ载体（Stratagene）中的人DNA（来自男性白种人的胎盘组织）的9-23kb插入片段。如Stratagene的说明书所述，但用MgCl2代替MgSO4，将约40，000噬斑形成单位铺在大肠杆菌LE392株（Stratagene，目录号200266）上。培养过夜后，如实施例2所述制备噬斑的尼龙膜留下印迹，并用32P标记的猪ZPA cDNA（1号顺序）和32P标记的猪ZPB cDNA（3号顺序）进行筛选。
证明三个克隆1-1、2-2和4-9与猪ZPB cDNA（3号顺序）杂交。克隆1-1和4-9于1993年1月27日保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland），ATCC保藏号分别为75406和75405。从这些克隆中分离人DNA插入片段，并通过用EcoRI进行限制性核酸内切酶消化和如实施例1所述的Southern印迹分析法进行分析。表4给出了这些克隆的EcoRI消化结果。
表4
人基因组ZPB EcoRI插入片段
Southern印迹分析检测出4个EcoRI片段。根据这些片段与猪ZPB cDNA（3号顺序）的杂交来判断，这些片段携有ZPB编码顺序。克隆1-1DNA含有发生这种杂交的2.2kb、2.0kb和1.5kb EcoRI片段。克隆2-2DNA含有2.8kb EcoRI杂交片段。克隆4-9 DNA含有与猪ZPB cDNA探针杂交的2.8kb和1.5kb EcoRI片段。所有插入片段都还含有3.2kb非杂交EcoRI片段。克隆1-1和4-9的插入片段都提供0.2kb非杂交片段；克隆1-1还提供0.7kb非杂交片段。
进一步的限制分析揭示出图4所示的片段排列。如实施例1所述将6个片段（A-F）亚克隆到pBSKS中以进行顺序分析。初步的顺序分析证实了图4所示的片段排列，并表明人ZPB基因的完整编码顺序可能来自克隆1-1和4-9。这一点由这些插入片段的核苷酸顺序分析及这些顺序与猫ZPB顺序（15号顺序）和猪ZPB顺序（3号顺序）的比较得到了证实。人ZPB的DNA顺序和推测氨基酸顺序分别列在40号和41号顺序中。
还分离出了在实施例1所述的条件下与猪ZPA cDNA（1号顺序）杂交的克隆。鉴定出两个阳性克隆A1和A4。这两个克隆于1993年1月27日保藏在美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号分别为75404和75403。Southern印迹分析表明，这些克隆含有全部或部分人ZPA基因。从这些克隆中分离DNA，并通过BglⅡ、HindⅢ和NotⅠ限制性核酸内切酶消化及实施例1所述的Southern印迹分析法进行分析。A1克隆DNA插入片段的大小约为11.6kb，A4克隆DNA插入片段的大小约为13.2kb。如实施例1所述，将与猪ZPA cDNA（1号顺序）杂交的两个BglⅡ片段亚克隆到pBSKS中，以进行顺序分析。顺序分析结果表明，A1和A4共同含有人ZPA基因。与猪ZPA cDNA顺序（1号顺序）和狗ZPA cDNA（11号顺序）所作的比较支持这一结论。完整DNA顺序和推测氨基酸顺序分别列在42号和43号顺序中。
实施例12
编码猕猴ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分离和顺序测定
如下所述在λgt10中构建猕猴cDNA文库。简单地说，从两只年龄分别为1.5岁和2岁的雌性猕猴体内摘取一组卵巢，从三只年龄分别为3岁、4岁和14岁的雌性猕猴体内摘取第二组卵巢。利用Fast TrackTMmRNA分离试剂盒，按制造商的说明分离信使RNA。利用Lambda LibrarianTM（Invitrogen，如实施例2所述）试剂盒，按该试剂盒提供的程序制备cDNA。使用Protoclone（Promega，Madison，WI）λgt10 EcoRI臂及Packagene（Promega）λDNA包装体系，按制造商的说明将cDNA包装到λ噬菌体头部中。这个步骤一般得到效价高于1×106噬斑形成单位/ml的文库。然后如实施例1所述，用从猪cDNA中分离出的猪ZPA、ZPB和ZPC探针筛选猴cDNA文库。筛选方法是：用Nytran尼龙滤膜（孔径为0.2μM）制备两个平行的噬斑印迹。使滤膜于42℃下在溶液中预杂交3小时，该溶液含有5×SSPE（43.83g/1 NaCl、6.9g/1 NaH2PO4、H2O、1.85g/l EDTA，pH7.4）、5×Denhardt氏试剂（1g/1聚蔗糖[400型]、1g/1聚乙烯吡咯烷酮和1g/1牛血清清蛋白）、100μg/ml经过超声处理的变性硅精巢DNA、30%甲酰胺、0.5%SDS。用[α-32P]-d ATP和Prime-a-Gene（Promega）标记体系制备放射标记的DNA。预杂交后，使10ng新放射标记的探针在50%甲酰胺和10μg/ml经过超声处理的变性鲑精巢DNA中于95℃下热变性5分钟，再加到滤膜上。杂交于42℃下进行15-24小时。然后在55℃下把杂交后的滤膜用100ml 5×SSPE洗涤二次，每次洗涤约1小时。然后在55℃下将滤膜置于250ml 5×SSPE中漂洗，并令其空气干燥。干燥后的滤膜用两块增感屏（Kodak X-OMATICTM）于70℃下对X光胶片（Kodak XAR5，Eastman Kodak，Rochester NY）曝光至少8小时。然后冲洗胶片以进行目测分析。
用所有的猪探针对两个猕猴卵巢cDNA文库进行彻底筛选，共得到12个候选克隆。Southern杂交表明，这些克隆中只有一个（λCM4-2）与猪ZPA探针杂交。该克隆含有560bp的插入片段。利用SequenaseVersion2试剂盒（U.S.Biochemicals，Cleveland，Ohio），按制造商的说明进行该插入片段的顺序测定。顺序测定结果表明，该560bp插入片段与其他哺乳动物ZPA基团的3′端同源。顺序测定结果表明，该560bp片段刚好代表全长顺序的不足25%bp，并含有492bp的开放读码，应编码164个氨基酸的蛋白。猕猴ZPA cDNA的DNA顺序和推测氨基酸顺序分别列在44号和45号顺序中。
用猪ZPB探针对猕猴卵巢cDNA文库进行彻底筛选，得到含有866bp插入片段的单个ZPB候选克隆。顺序分析结果表明，该插入片段含有预期全长顺序的C末端50%。猴ZPB插入片段的DNA顺序和推测氨基酸顺序分别列在46号和47号顺序中。用猪ZPC DNA探针筛选猴卵巢cDNA文库，只得到一些部分ZPC克隆。其中最大的一个克隆（λCM1-1）含有约1300bp的插入片段，根据与已知ZPC克隆（特别是人ZPC克隆）所作的比较，该插入片段刚好含有全长顺序C末端部分的50%多。该克隆含有672bp的并放读码，应编码224个氨基酸的蛋白。该克隆还在所有三个读码中含有紧靠编码顺序5′端的终止密码子。猕猴ZPC克隆的DNA顺序和推测氨基酸顺序分别列在48号和49号顺序中。
实施例13
ZPA DNA和推测氨基酸顺序的比较
表5显示了哺乳动物ZPA的DNA顺序和推测氨基酸顺序的比较。
数据以ZPA蛋白和DNA顺序的交叉比较来表示。蛋白顺序的比较示于该表的右上方，即对角方向的虚线之上。DNA顺序的比较示于该表的左下方，即对角方向的虚线之下。ZPA DNA顺序和推测氨基酸顺序在各物种之间高度同源。在哺乳动物纲内同一目的各成员间同源性最高。例如，人和猕猴（灵长目）、猪和牛（有蹄目）、猫和狗（食肉目）的顺序最为相似。各种哺乳动物物种的ZPA基因之间，以及ZPB（见实施例14）和ZPC（实施例15）基因之间的高度同源性，意味着这些物种的ZP层中有高度的结构相似性。但是，翻译后修饰作用的差异，例如糖基化及其他作用，可能是变异的潜在原因。
所有这些ZPA蛋白所共同具有的一个蛋白加工位点是靠近蛋白C末端的一个福林（furin）切割位点（R-X-R/K-R，Hosaka等，J.Biol.Chem.，266∶12127，1991）。事实上，除少数几个例外，所有ZP蛋白都含有靠近C末端的福林加工位点。这个福林位点的作用可能是将推定的膜附着顺序切下，而这将使加工后的蛋白朝生长着的ZP层的外缘移动。人ZPA基因含有一个靠近3′端的外显子，该外显子存在于猕猴ZPA顺序中，但不存在于其他物种的ZPA基因中。这个额外的外显子编码存在于福林加工位点之后的氨基酸顺序，这表明，由福林切割产生的C末端片段，对ZP层的功能或卵母细胞来说可能在某种意义上仍是重要的。
在每个全长ZPA顺序中有20个保守半胱氨酸残基和1个或2个非保守半胱氨酸残基。非保守半胱氨酸残基或者存在于N末端前导顺序区，或者存在于该顺序的端部C末端区，后一区域中不同的ZPA顺序之间有大量的变异。高度的同源性和大量的保守半胱氨酸残基表明不同ZPA蛋白的三级结构是相似的。
以前曾注意到，ZPA类和ZPB类蛋白之间有一些同源区（Schwoebel等，J.Biol.Chem.，266∶7214，1991；Lee等，J.Biol.Chem.，268∶12412，1993；Yurewicz等，Biochem. Biophys.Acta 1174∶211，1993）。人ZPA基因组结构与人ZPB基因组结构的比较表明，这些同源区局限于人ZPA基因的外显子12、13和14及人ZPB基因的外显子5、6和7。这表明，这种同源性可能是由于祖先基因的部分复制造成的。ZPB蛋白含有21个保守半胱氨酸残基。其中并没有11个不与ZPA蛋白中的保守半胱氨酸残基相对应，但后10个却完全对应。这使同源性扩展到约270个氨基酸，覆盖了ZPA基因的外显子11-16和ZPB基因的外显子4-9，但扩展后区域的总同源性略低（约为43%）。ZPA和ZPB基因的其余部分彼此之间几乎没有什么同源性，ZPC基因与ZPA基因也没有广泛的同源性。此外，ZPA基因与Genbank和Swiss Prot数据库中的非ZP核酸和蛋白顺序也没有广泛的顺序相似性。
实施例14
ZPB DNA顺序和推测氨基酸顺序的比较
表6显示了6个已知ZPB DNA和蛋白顺序的比较（牛和猕猴cDNA片段只与其他全长ZPB顺序的相应区域比较）。
数据以ZPB蛋白和DNA顺序的交叉比较来表示。蛋白顺序的比较示于该表的右上方，即对角方向的虚线之上。DNA顺序的比较示于该表的左下方，即对角方向的虚线之下。
这些数据表明不同哺乳动物物种的各成员间有显著的ZPB同源性。如同ZPA的情况，这种同源性在哺乳动物纲内同一目的成员中最为显著。例如，人和猕猴顺序（灵长目）及猪和牛顺序（有蹄目）彼此间的同源性最高。除少数几个例外（后面将指出），ZPB顺序与Genbank或Swiss Prot数据库中的其他DNA或蛋白顺序没有任何同源性。杂交实验表明，ZPB转录本是卵巢特异性的。
ZPB克隆的推测氨基酸顺序的比较表明，这一遗传群体内的差异比ZPA和ZPC群体内的差异要大。兔ZPB和猪ZPB的比较表明，除了兔ZPB有一个额外的上游ATG密码子从而使兔顺序增加6个密码子外，这些顺序基本上是共线的（74%同源）。
与猪和兔顺序比较，猫ZPB顺序在基因的头四分之一中有两个额外的氨基酸插入片段，总共38个额外密码子。两个插入片段都刚好出现在半胱氨酸残基之后。这表明，如果这些半胱氨酸参与形成二硫桥，则这些区域可能会形成独特的抗原决定基。但是，猫基因仍然与猪基因73%同源，与兔基因70%同源。
人基因有一个与猫顺序中的第一个插入片段同源但不与第二个插入片段同源的顺序。但是，人顺序中有一些与这一额外区域相邻的拼接点供体和受体一致顺序，这些顺序如已用过则留下码内编码顺序。所以，代表外显子2的顺序实际上可能是由一个小内含子（84bp）分隔开的两个小外显子（122和103bp）。这将使该区域内的人顺序与猪顺序相同。猫顺序中的头一个额外区域也侧接码内拼接位点供体和受体信号。如果把这个额外区域从猫顺序中去除，则猫顺序与猪顺序只有一个氨基酸不同。然而，制备猫顺序所用的cDNA克隆是由似乎已经过充分加工的mRNA制得的。猫顺序中的第二个额外区域不含码内拼接位点受体或供体信号，所以该额外区域可能不是由于存在未经加工的内含子而造成的。
与其他ZPB顺序比较，猕猴和人顺序在C末端有7个额外密码子。在猕猴中，这是由两个碱基对的缺失造成的。这一缺失造成移码突变而使其他物种所用的终止密码子移至码外。人顺序也含有这一缺失，但除此之外还有一个碱基变化，从而去掉了这个终止密码子。
ZPB蛋白中有21个保守半胱氨酸残基，其中后10个出现在与ZPA蛋白具有同源性的区域中。以前就注意到这种同源性（Schwoebel等，同上；Lee等，同上，1993；Yurewicz等，同上，1993），但对人ZPA和ZPB基因的基因组结构所作的考察使这种同源性扩展到约270个氨基酸。这种同源性可能是由于祖先基因的部分复制造成的。除了保守半胱氨酸残基外，猪ZPB蛋白还在推定的前导顺序中含有一个额外的半胱氨酸残基，而人顺序含有4个额外的半胱氨酸残基，其中第一个位于推定的先导顺序中（在与猪不同的位置上），第二个位于含有额外插入片段的区域中，最后两个位于由于终止密码子突变引起的C末端延伸段中。这后两个额外半胱氨酸残基在猕猴顺序中是保守的。
所有ZP蛋白都在靠近C末端处含有推定的跨膜区。但是，刚好出现在所有ZPA和ZPC蛋白中的跨膜区之前的典型福林蛋白水解加工信号（R-X-R/K-R，Hosaka等，同上，1991），在人（S-R-R-R）、猕猴（S-R-R-N）和兔（S-R-R-R）ZPB顺序中发生了改变。这一现象的意义尚不清楚，但这可能表明，这些蛋白是受特异于二碱基或三碱基顺序的相关体系加工的，因为推定跨膜区的释放对ZPB蛋白随ZP层生长而移动来说应是必需的。猪ZPA和ZPB（Yurewicz等，同上）蛋白似乎有大量的蛋白水解加工过程，但没有有关猫、牛、猕猴或人ZPB蛋白翻译后修饰的数据。这种加工的生理意义尚不清楚，但加工过程的差异可能是各种高度保守的ZP蛋白内发生变异的途径。
有一个人是否确实转录ZPB基因的问题。由于回收到的人卵巢mRNA的量太小，没有足够的RNA用来构建cDNA文库和进行Northern分析。但是，既然猕猴转录ZPB基因，那么有可能高度同源的人ZPB基因也得到转录。
狗cDNA文库中明显缺乏ZPB cDNA是另一个难题。除狗之外，所筛选出的所有含有任何透明带基因的文库都含有所有三个基因。但是，由六月龄狗的卵巢中分离出的mRNA（文库是由四月龄狗的卵巢制备的），包含一个在Northern印迹上与猪和猕猴ZPB mRNA共迁移的ZPB mRNA。缺乏狗ZPB cDNA的一种可能的解释是：三个ZP基因的转录时间是间隔开的，并由于用于制备文库的卵巢很年轻，所以ZPB基因的转录晚于ZPA和ZPC基因（Andersen和Simpson，1973）。
实施例15
ZPC DNA和推测氨基酸顺序的比较
表7显示了所有ZPC cDNA和基因的DNA和推测氨基酸顺序的比较。
数据以ZPC蛋白和DNA顺序的交叉比较来表示。蛋白顺序的比较示于该表的右上方，即对角方向的虚线之上。DNA顺序的比较示于该表的左下方，即对角方向的虚线之下。
ZPC蛋白和DNA顺序显示了比ZPA和ZPB DNA和蛋白程度更高的同源性。如同ZPA和ZPB的情况，在哺乳动物纲内同一目的各成员中同源性最为显著，例如人和猕猴顺序（灵长目）、猫和狗顺序（食肉目）、猪和牛顺序（有蹄目）、小鼠和仓鼠顺序（啮齿目）。根据Northern印迹分析，ZPC转录本是卵巢特异性的，与GenBank和SwissProt数据库中的顺序所作的比较没有发现显著的非ZP同源性。已知ZPC基因的推测氨基酸顺序的比较发现了三个含有大量非一致顺序的区域。这些区域是：推定的前导顺序和成熟蛋白的头20-25个氨基酸；含有被鉴定为小鼠精子结合区的肽的区域（Millar等，Science216∶935-938，1989）；可能在福林加工位点从成熟蛋白上除去的蛋白C末端区（见下文）。
被鉴定为推定的精子结合位点的抗原决定基（Millar等，同上，1989），恰好出现在福林蛋白水解切割位点之前（Hosaka等，1991）。福林位点在所有ZPC顺序中都是高度保守的。但应该注意，狗ZPC顺序含有第二个福林位点，位于距头一个福林位点上游19个氨基酸处。还是如同ZPA和ZPB的情况，ZPC蛋白被福林切割将除去推定的膜附着顺序（Klein等，1985），从而使加工后的ZPC蛋白朝正在增大的卵母细胞的外层移动。所以，这个精子结合位点可能代表了成熟蛋白的C末端。然而，在ZPC蛋白相应于该抗原决定基的区域中，却几乎没有什么同源性（甚至在仓鼠和小鼠之间也是如此）。这可能表明该区域对精卵结合的种属特异性有贡献。
在ZPC蛋白的C末端观察到的变异出现在推定的跨膜区。这一变异可能表明，该氨基酸顺序不如该区域内氨基酸的总疏水性重要，类似于在前导顺序中观察到的缺乏同源性。但是，也可能这种变异表明该区域的某种种属特异性功能。
每个ZPC顺序含有14个保守半胱氨酸残基，但每个顺序还有只与一个或少数几个其他顺序共有的一个或二个额外半胱氨酸残基。这些额外半胱氨酸残基靠近存在最大顺序变异的蛋白N末端或C末端。然而，大量的保守半胱氨酸残基可能表明，所有这些蛋白的中心核的总结构都是非常保守的。
实施例16
用HSPZ免疫猕猴
用HSPZ免疫性成熟猕猴，以测试HSPZ诱导不育的能力。如实施例6所述制备HSPZ。将HSPZ与下列GMDP/油佐剂混合：50μg GMDP（N-乙酰-D-葡糖氨基-（β1-4）-N-乙酰胞壁酰-D-异谷氨酰胺）（CC.Biotech，Poway，CA）；42.1ml矿物油、15.8% Pluronic VC-121（嵌段聚多元醇，BASF-Wyandotte，Parsippany，NJ）。用配制在GMDP/油佐剂中的HSPZ给动物总共进行4次皮下注射，每次注射1mg HSPZ，先以首次剂量开始，4周后给予一个增强剂量，然后以5周的间隔给予两个增强剂量，然后在6周后给予一个最终剂量。这一剂量方案使猕猴因具有对抗如上所述制备的猕猴热溶解透明带的抗体效价而不排卵。抗猕猴HSPZ抗体效价峰值为1∶8000-1∶16，000。
如实施例6所述，用等电聚焦法制备基本为天然猪ZPA和ZPB的HSPZ分组分离制备物，并用该制备物来接种猕猴，接种时用配制在GMDP/油中的1mg分级分离HSPZ按下列计划进行皮下注射，给予首次剂量约6周后给予一个增强剂量，然后在这个增强剂量11周后给予一个最终增强剂量。经过免疫的猴达到1∶4，000-1∶8，000的抗猴热溶解透明带抗体效价峰值，同时保持正常的排卵周期。但尽管保持正常的排卵周期，这些猴仍然不育，直到其抗猴热溶解透明带抗体效价下降到1∶500以下之后，动物才在配种后受孕。
用重组杆状病毒产生的狗ZPC和猪ZPC（如实施例18所述制备）免疫猕猴，尽管诱导出抗猴热溶解透明带抗体的产生，但并没有诱导出不育。对此一种可能的解释是：在杆状病毒体系中产生的ZP蛋白的糖基化方式可能妨碍了对负责诱导不育的抗原决定基的识别。
上述由细菌产生的猪ZPA、ZPB和ZPC在给予猕猴后，尽管产生了针对所呈递抗原的抗体效价，但没有诱导出可检测的抗猕猴热溶解透明带抗体效价。
实施例17
哺乳动物透明带蛋白抗原决定基的图谱测定
利用购自Chiron Mimotopes U.S.公司（Emeryville，CA）目录号PT-02-20000A）的Pin TechnologyTM抗原决定基扫描试剂盒，进行透明带蛋白抗原决定基的图谱测定。采用试剂盒手册中所述的步骤，但在ELISA检测步骤中有些修改（见下述）。
简单地说，按制造商的说明将Pin Technology软件安装在联合商用机器486/33型计算机中。将蛋白顺序输入计算机程序，选择所需的肽长度和肽间重叠程序，打印出一份规程，该规程包括每日需要的活化的受护氨基酸衍生物及它们在偶联盘的各孔中的位置。使用前，先把针（pins）用二甲基甲酰胺（DMF）洗一次，再用甲醇洗三次，每次洗涤持续二分钟。将针封（pin block）空气干燥，将针置于20%哌啶在DMF中的混合物中于室温下搅拌30分钟使其脱保持。将针再如上所述进行洗涤，所不同的是每次洗5分钟，然后使针封空气干燥。制备所需的氨基酸衍生物溶液，并按本次循环的程序将溶液分装到合成盘的各孔中。将干燥的模拟型针再在DMF浴中进行一次5分钟的洗涤，然后放在合成盘中的适当孔中。然后把该组件密封在塑料袋内，于30℃下保温约22小时。第二天，从偶联盘上取下针封进行与上述相同的洗涤、脱保护和偶联步骤循环，但使用适于下一次循环的氨基酸衍生物及其在盘中的位置。重复上述的洗涤、脱保护和偶联循环，直到完成各肽顺序。
各肽的末端氨基酸偶联后，如上所述将针封洗涤、空气干燥、脱保护、洗涤和空气干燥。然后把针浸入分装在聚丙烯偶联盘的各小孔中的，含有5份DMF、2份乙酸酐和1份三乙胺（按体积计）的混合物中，并在30℃下保温90分钟，使肽的末端氨基乙酰化。取下针封，如上所述进行另一个洗涤顺序，并空气干燥。
将针封置于含95份三氟乙酸、2.5份茴香醚和2.5份乙二硫醇（体积）的混合物中，于室温下搅拌4小时，进行肽的侧链脱保护反应。然后把针封空气干燥约10分钟，在含有等份甲醇和去离子水（体积）和0.1%盐酸的水浴中超声处理15分钟，最后空气干燥。
在进行ELISA检测前，对针进行一个破碎步骤。该步骤包括：在由一种混合物组成的水浴中进行超声处理。该混合物含有39份磷酸二氢钠、25份十二烷基硫酸钠、0.1份2-巯基乙醇、2500份去离子水，并用50%氢氧化钠溶液调至PH7.2。超声处理在55-60℃下进行约45分钟。然后把针封依次浸入三个60℃去离子水浴中，并小心搅拌进行洗涤，每个水浴中洗涤3分钟。最后，把针封浸入轻度沸腾的甲醇中约4分钟，然后空气干燥。
抗血清的制备
用本领域公知并由E.Harlow和D.Lane（Antibodies，A Laboratory Manual，第5章，Cold Spring Harbor Laboratory，1988该文献并入本文作参考）描述的方法，用适当的透明带蛋白免疫适当的动物，从而制得针对透明带蛋白的抗血清。用经过修改的Harlow（同上，第314页）所述的方法制备生物素化的抗血清。简单地说，在含有1-3mg/ml选定抗体IgG部分的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，pH7.2）中，以10mg/ml的浓度加入含25-250μg生物素酰氨基已酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（Sigma，目录号B2643）的二甲亚砜溶液。将该混合物充分混合，然后在室温下保温4小时。以相当于每250微克生物素酯20微升的量加入1M氯化铵溶液，所得混合物在室温下保温10分钟。然后用Centricon-30（TM）微量浓缩器（Amicon Division，W.R. Grace & Co.，Inc.，Beverly MA）对PBS充分透滤，除去未反应的生物素酯。对适当的天然蛋白进行ELISA滴定，测定所得结合物的稀释倍数。
ELISA检测
采用经过修改的抗原决定基扫描试剂盒手册中所述的方法。破碎后，将模拟针（mimotope pins）与“超级混合液”（每升PBS 10g卵清蛋白、10g牛血清清蛋白、1ml吐温20去污剂）一起在室温下保温1小时，使模拟针封闭。然后在室温下与适当稀释的生物素化抗血清一起保温2小时。在室温下用含0.5%吐温20（PBST）的PBS将针搅拌洗涤4次，每次10分钟。
然后使针在室温下与第二抗体一起保温1小时。第二抗体是用PBST以1∶2500稀释过的辣根过氧化物酶-抗生物素蛋白链菌素结合物（Zymed Laboratories，Inc.，South San Francisco，CA）。将针再如上所述进行洗涤。
如下制备底物缓冲液：把200ml 1.0M磷酸氢二钠溶液与160ml 1.0M柠檬酸溶液混合，用1640ml去离子水稀释该混合物，并用柠檬酸或氢氧化钠溶液调至如pH4.0。如下制备底物溶液：把10mg 2，2′-连氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐溶解于20ml底物缓冲液中，并加入6μl30%过氧化氢。利用微量滴定板使模拟针在室温下与上述溶液一起保温。微量滴定板中每孔装150μl溶液。当显色看来适于用ELISA滴定板测定仪测定时，除去针封并在450nm波长下测定滴定板。然后用上述步骤破碎针封。
将数据输入Pin TechnologyTM计算机程序中，由该程序进行统计分析和评定，并打印出鉴定结合能力最强的抗原决定基的结果。简单地说，假定25%光密度读数最低的小孔代表每个实验的背景。计算这些读数的平均值和标准偏差。抗血清对肽的显著识别归因于相应于这些针所对应的各小孔的光吸收读数高于背景平均值与该平均值的三个标准偏差的总和。
检查人ZPA抗原决定基与如上所述制备的小鼠抗人ZP抗血清的反应性。以43号顺序中所示的1号氨基酸开始合成长度为15个氨基酸的肽。合成一系列接续的肽，每个肽有7个氨基酸与该系列中的前一个肽重叠。证明下列肽与小鼠抗人ZP抗血清结合：1-15，9-23，25-39，33-47，65-79，81-95，89-103，97-111，105-119，113-127，121-135，129-143，145-159，153-167，161-175，193-207，209-223，217-231，225-239，241-255，249-263，273-287，281-295，289-303，305-319，313-327，321-335，329-343，337-351，345-359，385-399，393-407，401-415，409-423，417-431，425-439，441-455，449-463，457-471，481-495，489-503，497-511，505-519，513-527，521-535，537-551，545-559，561-575，569-583，577-591，585-599，601-615，609-623，617-631，625-639，633-647，641-655，665-679，697-711，705-719，713-727，721-735，729-743.
类似地，用小鼠抗人ZP抗血清进行人ZP抗原决定基的图谱测定。在这些实验中，以如41号顺序中所示的1号氨基酸开始合成一些15个氨基酸的肽。该实验中各接续肽之间的重叠为9个氨基酸。证明下列肽与小鼠抗人ZP抗血清结合：
7-21，25-39，31-45，49-63，67-81，73-87，79-93，91-105，103-117，121-135，193-207，205-219，211-225，217-231，223-237，229-243，253-267，259-273，265-279，283-297，289-303，295-309，301-315，307-321，313-327，319-333，343-357，349-363，355-369，367-381，373-387，379-393，385-399，403-417，409-423，415-429，421-435，433-447，439-453，445-459，451-465，481-495，487-501，499-513，505-519，511-525，523-537，529-543，547-561.
用小鼠抗人ZP抗血清进行人ZPC抗原决定基的图谱测定。在这些实验中，以Chamberlin等人（Proc. Nat′l Acad.Sci.USA 87∶6014-6018，1990，该文献列入本文作参考）所列出的1号的氨基酸开始，合成一些15个氨基酸的肽。各接续肽之间的重叠为10个氨基酸。证明下列肽与小鼠抗人ZP抗血清结合：21-35，51-65，116-130，146-160，151-165，181-195，241-255，251-265，271-285，296-310，321-335，401-415，411-425.
用兔抗狗ZP抗血清进行狗ZPC抗原决定基的图谱测定。在这些实验中，以10号顺序中所示的1号氨基酸开始合成一些15个氨基酸的肽。接续肽之间的重叠为5个氨基酸。证明下列肽与兔抗狗ZP抗血清结合：51-65，61-75，81-95，131-145，181-195，301-315.
用兔抗猫ZP抗血清进行猫ZPC抗原决定基的图谱测定。在这些实验中，以18号顺序中所列的1号氨基酸开始，合成一些15个氨基酸的肽。各接续肽之间的重叠为5个氨基酸。证明下列肽与兔抗猫ZP结合：
36-50，46-60，56-70，76-90，96-110，106-120，116-130，126-140，136-150，146-160，156-170，186-200，196-210，246-260，266-280，276-290，286-300，296-310，316-330，326-340，336-350，346-360，376-390，396-410，406-420.
用兔抗牛ZP抗血清进行牛ZPC抗原决定基的图谱测定。在这些实验中，以24号顺序中所列的1号氨基酸开始，合成一些相互重叠的15个氨基酸的肽。各肽之间的重叠为10个氨基酸。证明下列肽与兔抗牛ZP抗血清反应：
1-15，31-45，51-65，56-70，61-75，76-90，106-120，111-125，116-130，121-135，131-145，136-150，141-155，146-160，151-165，161-175，181-195，186-200，191-205，196-210，201-215，206-220，216-230，226-240，241-255，246-260，261-275，266-280，271-285，276-290，291-305，296-310，301-315，316-330，321-335，326-340，331-345，336-350，341-355，356-370，361-375，376-390，381-395，386-400，396-410，401-415，406-420.
实施例18
用重组ZPC蛋白免疫狗
用各种重组狗ZPC制备物免疫狗。如下构建质粒pZ169细菌表达载体（图5）。用限制酶PvuI和BamHI消化母体载体pZ98（实施例9所述），并凝胶纯化大片段。在该载体中连入一个通过使以下寡核苷酸退火而产生的片段：
5′CGCCCTTCCCAGCAACTGCACCATCACCACCATGGG3′
（50号顺序）；
5′GATCCCCATGGTGGTGGTGATGGTGCAGTTGCTGGGAAGGGCGAT 3′
（51号顺序）。
这些寡核苷酸产生一个带有PvuI和BamHI末端的片段，并编码六肽顺序His6。用限制酶BamHI和EcoRI消化这个中间载体，并凝胶纯化大片段。在该载体中连入一个通过使下列寡核苷酸退火而产生的片段：
5′GATCCCTCGAGCCACCATCACCACCATCATG 3′
（52号顺序）；
5′AATTCATGATGGTGGTGATGGTGGCTCGAGG 3′
（53号顺序）。
这些寡核苷酸产生一个带有BamHI和EcoRI末端和一个恰好位于BamHI位点上游的XhoI位点，并编码六肽顺序His6。这个新载体称为pZ88，在两个His6顺序之间含有独特的BamHI和XhoI克隆位点。为构建pZ169，用限制酶BamHI和XhoI消化pZ88载体，并凝胶纯化大片段。在该载体中连入一个通过用下列寡核苷酸进行狗ZPC cDNA的PCR（聚合酶链反应）而产生的片段：
5′CCCGGATCCGCAGACCATCTGGCCAACTGAG 3′
（54号顺序）；
5′GCGCTCGAGGGCATATGGCTGCCAGTGTG 3′
（55号顺序）。
该PCR产生一个含有狗ZPC顺序的23-207位氨基酸的片段，该片段带有BamHI和XhoI末端。这个新载体称为pZ169（图5），它所产生的蛋白含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶顺序的1-56位氨基酸、His6、狗ZPC顺序的23-207位氨酸、His6、大肠杆菌β-半乳糖苷酶顺序的1006-1023位氨基酸。该蛋白称为N末端狗ZPC。在图5中，pTAC指上述tac启动子；AmpR指氨苄青霉素抗性标记，ori是大肠杆菌复制起点顺序，pLacI是驱动lacI基因表达的lacI启动子。
如实施例9所述制备和纯化重组狗ZPC。如下构建杆状病毒表达载体pZ145。用限制酶NheI和BamHI消化母体载体pBlueBac2（购自Invitrogen Corporation，San Diego，CA），并凝胶纯化大片段。在该载体中连入一个用下列寡核苷酸进行猪ZPC cDNA的PCR而产生的片段：
5′CGCGCTAGCAGATCTATGGCGCCGAGCTGGAGGTTC3′
（56号顺序）；
5′CGCGGATCCTATTAATGGTGGTGATGGTGGTGACTAGTGGACCCTTCCA3′
（57号顺序）。
该PCR产生一个带有NheI和BamHI末端的片段，该片段含有猪ZPC顺序的27-350位氨基酸，其后是SpeI位点和六肽His6。这个新载体称为pZ147。为构建pZ145载体，用NheI和SpeI消化pZ147，并凝胶纯化大片段（这除去了猪ZPC顺序）。在该载体中连入一个通过用下列寡核苷酸进行狗ZPC cDNA的PCR而产生的片段：
5′CCCGCTAGCAGATCTATGGGGCTGAGCTATGGAATTTTC 3′
（58号顺序）；
5′CGCACTAGTTGACCCCTCTATACCATGATCACTA 3′
（59号顺序）。
该PCR产生一个带有NheI和SpeI末端的片段，该片段含有狗顺序的1-379位氨基酸。筛选由这一连接反应得到的含有正确取向的插入NheI/SpeI片段的转化体（因为NheI和SpeI粘性末端是相同的）。这个新载体称为pZ145（图6），它所产生的蛋白Z含有DZPC顺序的1-379位氨基酸，其后是His6。该蛋白称为杆状病毒-狗ZPC。在图6中，pP代表杆状病毒多角体素（polyhedrin）启动子，AmpR代表氨苄青霉素抗性标记，lacZ代表β-半乳糖苷酶基因，pE是驱动lacZ表达的组成启动子，ori是大肠杆菌复制起点。
用以下方法制备由重组杆状病毒衍生的狗ZPC：利用购自Invitrogen公司（San Diego，CA）的MAXBACTM试剂盒中所述的本领域公知方法，用pZ145和苜蓿银纹夜蚊多被膜核型多角体病毒（AcMNPV）共转染昆虫SF9细胞。由共转染的SF9细胞如下制备在SF9细胞中产生的重组狗ZPC。收集共转染的细胞并离心沉降，按实施例9所述的从细胞沉淀中进行纯化的方法纯化重组狗ZPC。也可从培养基中分离重组狗ZPC，并如实施例9所述在Ni柱上进行纯化。
能够在各种调控顺序的控制下表达透明带编码寡核苷酸顺序的其他表达载体，也在本发明的范围内，并易于用本领域公知的方法来构建。
还可以用本领域公知的各种方法对重组透明带蛋白进行修饰，以提高其潜在抗原性。例如，如下制备经棕榈酰化修饰的重组狗ZPC。将约1mg如上所述用质粒PZ169制备的重组ZPC调至终浓度为8M脲（总体积为0.2-0.3ml）。然后把棕榈酸酐加到三乙胺中，使终浓度达到每ml三乙胺20mg棕榈酸酐，从而制得棕榈酰化溶液（Pl2O/TEA）。
将约10μl Pl2O/TEA溶液加到1mg重组狗ZPC在8M脲中的溶液中（如上所述）。将该混合物在室温下放置至少2小时，而后该制备物便可与GMDP/油佐剂混合。
脱乙酰壳多糖修饰是另一种适于实施本发明的狗ZPC修饰作用。简单地说，将1.5ml无菌矿物油加到1.5ml如上所述用质粒pZ169制备的重组狗ZPC溶液中（共3mgZPC，2mg/ml在8M脲中的溶液），并与5滴Arlacel A（二缩甘露醇单油酸酯，Sigma，St.Louis，MO）混合。然后加入0.75ml脱乙酰壳多糖（2% w/v在0.5M乙酸钠pH5.0中的溶液），并将该混合物超声处理10-20秒，接着加入0.045ml 50%NaOH，并再进行一次10-20秒的超声处理。最后加入10μl 10mg/ml GMDP/8M脲。
取3只狗作为一组，用如上所述制备的、通过加入脱乙酰壳多糖修饰的N末端狗ZPC免疫5次，每次皮下注射1mg的剂量，间隔为一个月。经用上述方法测定，经免疫的狗产生1∶8000-1∶16000的抗热溶解狗透明带抗体效价（自身效价）。显示自身效价的狗在动情周期中不排卵，且动情周期延长（4-6周，而正常狗的动情周期为10-14天）。在这3只经免疫的狗中，有两只已出现第一个动情周期，其中有1只在首次免疫6个月后出现动情周期，经配种后发现该狗不育，第2只出现动情周期且在首次免疫9个月后保持不育。第3只狗则在免疫9个多月后仍未出现动情周期。
取4只狗作为另一组，以1个月的间隔免疫3次，每次皮下给予1mg剂量的配制在GMDP/油佐剂中的棕榈酰化狗ZPC（如上所述制备）。这些动物达到1∶4000-1∶8000的自身效价（抗热溶解狗透明带）。免疫几乎7个月后，4只狗中有两只出现动情周期但保持不育。其余的两只狗则尚未出现动情周期。
另一组狗以1个月的间隔免疫3次，每次皮下注射1mg配制在GMDP/油佐剂中的、用pZ166（一种类似于pZ169但含有编码狗ZPC蛋白23-379位氨基酸的DNA顺序的质粒）制备的重组狗ZPC。这些动物没有产生自身效价，因而在配种后受孕。用杆状病毒体系产生的狗ZPC片段免疫的狗没有诱导出不育。
实施例19
用重组透明带蛋白给牛和猫接种
进行初步研究以评定重组透明带蛋白在牛和猫体内诱导不育的能力。
给牛注射3次或更多次剂量（配制在GMDP（250μg）油佐剂中）的各种用重组方法得到的狗和猪来源的ZPC蛋白，包括用图5所示的质粒pZ169产生的狗ZPC，每次注射1mg蛋白。以未修饰的及棕榈酰化和脱乙酰壳多糖修饰形式给予重组蛋白。这些ZP蛋白制备物在所接种的牛体内都没有诱导出自身效价或不育。正在用不同的重组透明带蛋白制备物和不同的剂量方案进行进一步的研究，试图在牛体内诱导出自身效价和不育。
类似地，用下列重组透明带蛋白接种猫：重组猫ZPA、ZPB和ZPC的混合物；用如上所述并如图3所示的pZ156产生的猪ZPC；用上述的图5所示的质粒pZ169产生的狗ZPC。用这些ZP蛋白制备物接种的猫产生抗疫苗蛋白的抗体，但未产生自身效价，因此是可育的。为了刺激自身效价的产生并诱导不育，正在进行研究以确定对重组透明带蛋白进行修饰的效果。
还正在进行研究以选择其他用重组方法得到的透明带蛋白片段作为可能的免疫避孕药进行测试。
预计本领域普通技术人员会对以上实施例所说明的各种发明实施方式作出很多修改。因此，这些说明性的实施例并不是要限制所附的权利要求书中所提出的发明范围。
顺序表
（1）概况
（ⅰ）申请人
Harris Ph.D.，Jeffrey D.
Hsu，Kuang T.
Podolski，Joseph S.
（ⅱ）发明名称：用于免疫避孕的材料和方法
（ⅲ）顺序数：
（ⅳ）通信地址：
（A）收信人：Marshall，O'Toole，Gerstein，Murray & Borun
（B）街道：6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive
（C）城市：芝加哥
（D）州：伊利诺斯
（E）国家：美国
（F）邮政编码：60606-6402
（V）计算机可读形式：
（A）介质类型：软盘
（B）计算机：IBM PC兼容型
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25
（ⅵ）本申请数据：
（A）申请号；
（B）申请日：
（C）分类：
（ⅶ）在先申请数据：
（A）申请号：08/012，990
（B）申请日：1993年1月29日
（ⅶ）在先申请数据：
（A）申请号：07/1973，341
（B）申请日：1992年11月9日
（ⅶ）代理人资料：
（A）姓名：Clough，David W.
（B）登记号：36，107
（C）案卷号：31745
（ⅸ）电讯资料：
（A）电话：312/474-6653
（B）传真：312/474-0448
（C）电传：25-3856
（2）1号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：2214碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：猪
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：sig-peptide
（B）位置：12..119
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：mat-peptide
（B）位置：120..2153
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：12..2153
（xi）顺序描述：1号顺序：
（2）2号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：713个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：2号顺序：
（2）3号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1699碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：猪
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：sig-peptide
（B）位置：38..445
（xi）特征：
（A）名称/关键词：mat-peptide
（B）位置：446..1648
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：38..1648
（xi）顺序描述：3号顺序：
（2）4号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：536个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：4号顺序：
（2）5号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1326碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：猪
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：Sig-peptide
（B）位置：25..105
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：mat-peptide
（B）位置：106..1290
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：25..1290
（xi）顺序描述：5号顺序：
（2）6号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：421个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：6号顺序：
（2）7号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1338碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：兔
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：17..1261
（xi）顺序描述：7号顺序：
（2）8号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：415个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：8号顺序：
（2）9号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：2381个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：家犬
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：206..2353
（xi）顺序描述：9号顺序：
（2）10号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：715个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：10号顺序：
（2）11号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1325碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：家犬
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：13..1293
（xi）顺序描述：11号顺序：
（2）12号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：426个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：12号顺序：
（2）13号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：2236碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：家猫
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：28.2175
（xi）顺序描述：13号顺序：
（2）14号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：716个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：14号顺序：
（2）15号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1840碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：家猫
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：57..1766
（xi）顺序描述：15号顺序：
（2）16号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：570个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：16号顺序：
（2）17号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1319碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：家猫
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：26..1297
（xi）顺序描述：17号顺序：
（2）18号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：424个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：18号顺序：
（2）19号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：643碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：牛
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：16..582
（xi）顺序描述：19号顺序：
（2）20号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：188个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：20号顺序：
（2）21号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1029碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：牛
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：2..976
（xi）顺序描述：21号顺序：
（2）22号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：324个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：22号顺序：
（2）23号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1457碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅲ）假设：无
（ⅳ）反义：无
（ⅵ）原始来源：
（A）生物体：牛
（D）发育阶段：幼年
（E）倍型：二倍体
（F）组织类型：卵巢
（G）细胞类型：卵母细胞
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：149..1411
（xi）顺序描述：23号顺序：
（2）24号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：421个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：24号顺序
（2）25号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：125碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：25号顺序：
（2）26号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：111碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：26号顺序：
（2）27号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：96碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：27号顺序：
（2）28号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：19碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：28号顺序：
ATGGARAGRT GYCAMGARG 19
（2）29号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：24碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：29号顺序：
GATCTAAGGA AGATCTATGG ATCC 24
（2）30号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：24碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：30号顺序:
GATCTAAGGA GGTTGTATGG ATCC 24
（2）31号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：55碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：31号顺序：
GATCTATGAC CATGATTACG GATTCGCGTA GCCGTCGTCC TGCAGCGTCG CGACT 55
（2）32号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：57碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：32号顺序：
（2）33号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：54碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：33号顺序：
（2）34号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：52碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：34号顺序：
CTGGCCAAAG GGGGATGTGG CTGCTAATCG ATTAAGTTGG GTAACGCCCG GG 52
（2）35号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：120碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：35号顺序：
（2）36号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：29碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ix）顺序描述：36号顺序：
GCGAAGCTTC CGACACCATC GAACGGCGC 29
（2）37号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：30碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：37号顺序：
GCGCACAATG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC 30
（2）38号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：28碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：38号顺序：
CGCGGATCCG GACGAAGGCC AGCGCTTG 28
（2）39号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：58碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（xi）顺序描述：39号顺序：
（2）40号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：1701碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：1..1698
（xi）顺序描述：40号顺序：
（2）41号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：566个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：41号顺序：
（2）42号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：2266碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：1..2235
（xi）顺序描述：42号顺序：
（2）43号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：745个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：43号顺序：
（2）44号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：560碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：15..506
（xi）顺序描述：44号顺序：
（2）45号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：164个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：45号顺序：
（2）46号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：866碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：12..821
（xi）顺序描述：46号顺序：
（2）47号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：270个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：47号顺序：
（2）48号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：722碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：15..683
（xi）顺序描述：48号顺序：
（2）49号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：223个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（xi）顺序描述：49号顺序：
（2）50号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：28碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：50号顺序：
CGCCCTTCCC AGCAACTGCA CCATCACCAC CATGGG 36
（2）51号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：45碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：51号顺序：
GATCCCCATG GTGGTGGTGA TGGTGCAGTT GCTGGGAAGG GCGAT 45
（2）52号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：31碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：52号顺序：
GATCCCTCGA GCCACCATCA CCACCATCAT G 31
（2）53号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：31碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：53号顺序：
AATTCATGAT GGTGGTGATG GTGGCTCGAG G 31
（2）54号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：31碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：54号顺序：
CCCGGATCCG CAGACCATCT GGCCAACTGA G 31
（2）55号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：29碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：55号顺序：
GCGCTCGAGG GCATATGGCT GCCAGTGTG 29
（2）56号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：36碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：56号顺序：
CGCGCTAGCA GATCTATGGC GCCGAGCTGG AGGTTC 36
（2）57号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：49碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：57号顺序：
CGCGGATCCT ATTAATGGTG GTGATGGTGG TGACTAGTGG ACCCTTCCA 49
（2）58号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：39碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：58号顺序：
CCCGCTAGCA GATCTATGGG GCTGAGCTAT GGAATTTTC 39
（2）59号顺序资料：
（ⅰ）顺序特性：
（A）长度：34碱基对
（B）类型：核酸
（C）链数：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA
（xi）顺序描述：59号顺序：
CGCACTAGTT GACCCCTCTA TACCATGATC ACTA 34