五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用.pdf

本发明公开了五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。通过给予过量石胆酸造成小鼠肝内胆汁淤积模型，或胆管结扎造成小鼠肝外胆汁淤积模型，分别协同给予五味子醇乙后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量也显著降低，以及尿液排出总胆汁酸及总胆红素含量上升。结果表明，五味子醇乙能够预防治疗石胆酸和胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤。证实了上述作用的机制可能涉及调控CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排。

1.  五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。

2.  一种用于预防和治疗胆汁淤积性肝病的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含有五味子醇乙。

3.  权利要求2所述药物组合物在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。

4.  根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述的胆汁淤积性肝病是指肝内胆汁淤积性肝损伤或肝外胆汁淤积性肝损伤。

5.  根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述的胆汁淤积性肝病是指石胆酸或胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤。

6.  根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述的预防和治疗胆汁淤积性肝病是指降低肝外胆汁淤积肝病模型血清中ALT、AST和ALP的活性，减轻肝组织坏死程度，降低血清中的总胆汁酸与总胆红素含量；或是指降低肝外胆汁淤积模型血清中ALT、AST的活性，减轻肝组织坏死程度，降低血清中的总胆汁酸与总胆红素含量，以及增加尿液排出总胆汁酸及总胆红素含量。

7.  五味子醇乙在制备CYP3A11基因表达促进剂中的应用。

8.  五味子醇乙在制备UGT1A1基因表达促进剂中的应用。

9.  五味子醇乙在制备OATP1A4基因表达促进剂中的应用。

五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域。更具体地，涉及五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
背景技术
胆汁淤积（cholestasis），是由胆汁生成障碍或/和胆汁排泌障碍使肝细胞排泌的胆汁成分反流入血中产生潴留所致的一组疾病共同的临床症状，并最终可能发展成为致命性的肝疾病，例如原发性胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎等。若血液中仅胆汁酸增高而胆红素正常，称为胆汁淤积或淤胆，若血中胆汁酸和胆红素均增高则称为胆汁淤积性黄疸。根据胆汁淤积发生部位不同，通常以肝门为界限分为肝内胆汁淤积（Intrahepatic cholestasis）和肝外胆汁淤积（Extrahepatic cholestasis）两大类。
肝内胆汁淤积是肝细胞排泌胆汁障碍，然而并无胆道阻塞以致肝细胞内胆汁淤滞和血中胆汁成分增多。石胆酸（LCA）是一种毒性较强的疏水性次级胆汁酸，是由胆固醇转化而来。在慢性胆汁淤积性疾病患者的血中可检测到LCA水平的显著增加，并且研究发现在患者体循环中累积的LCA被认为能导致肝损害。如果在小鼠体内加入外源性石胆酸，就会反馈性抑制胆汁酸的释放，从而造成肝内胆汁淤积、胆管部分梗阻以及胆管炎。因此，LCA作为一种肝内胆汁淤积的造模药物广泛用于胆汁淤积治疗药物的研发中。目前对于此类疾病的治疗并没有特别有效的方法。
肝外胆汁淤积是指肝细胞排泄胆汁功能障碍、胆汁分泌的抑制或胆汁流障碍（如胆管通道梗阻），致使胆汁到达十二指肠的量减少。胆管结扎术（Bile duct ligation，BDL）是目前最为广泛应用的肝外胆汁淤积的造模方法。手术将总胆管双侧结扎并在中间剪断，阻断胆汁往十二指肠方向的流出，淤积在胆管和胆囊中，从而导致肝细胞外的胆汁淤积。该造模方法长期作用后亦可造成胆汁淤积性肝纤维化。目前亦无针此类疾病的有效治疗方法。
另外，世界上唯一上市的能够缓解胆汁淤积症状的药物是熊去氧胆酸（UDCA），但该药物并不能最终提高胆汁淤积性肝病患者的生存率，因此临床上亟需寻找其它能够预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物。
五味子醇乙是中药五味子中的有效成分之一。五味子提取物被报道具有显著的肝保护作用，能够用于多种肝毒性药物如四氯化碳、对乙酰氨基酚等化学毒物所致肝损伤的保护与治疗。目前对于五味子醇乙的研究显示，其具有以下作用和用途：（1）抗肝毒，减少过量的SGPT；（2）防止CCl4 或硫代乙酰胺所致的中毒；（3）促进饥饿小鼠肝脏糖原的生物合成。然而五味子醇乙能否预防和治疗胆汁淤积尚未有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有胆汁淤积预防和治疗药物的局限，旨在通过动物实验揭示五味子醇乙能否预防和治疗LCA和BDL所诱导的小鼠胆汁淤积性肝病，探讨其内在机制，并提供五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
本发明的目的是提供五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明公开了五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。  
还提供了一种用于预防和治疗胆汁淤积性肝病的药物组合物，该药物组合物包含有五味子醇乙，以五味子醇乙为主要活性成分。
上述药物组合物在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，上述的胆汁淤积性肝病是指肝内胆汁淤积性肝损伤或肝外胆汁淤积性肝损伤。 
更优选地，上述胆汁淤积性肝病是指石胆酸或胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤。
同时，上述的预防和治疗胆汁淤积性肝病是指降低肝外胆汁淤积肝病模型血清中ALT、AST和ALP的活性，减轻肝组织坏死程度，降低血清中的总胆汁酸与总胆红素含量；或是指降低肝外胆汁淤积模型血清中ALT、AST的活性，减轻肝组织坏死程度，降低血清中的总胆汁酸与总胆红素含量，以及增加尿液排出总胆汁酸及总胆红素含量。
另外，本发明还提供五味子醇乙在制备CYP3A11基因表达促进剂中的应用，五味子醇乙在制备UGT1A1基因表达促进剂中的应用，以及五味子醇乙在制备OATP1A4基因表达促进剂中的应用。以五味子醇乙为主要活性物质的基因表达促进剂能够显著上调CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4基因的表达，从而调控CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排，达到预防和治疗胆汁淤积性肝病的目的。
本发明首先通过给予过量石胆酸造成小鼠肝内胆汁淤积模型，协同给予五味子醇乙（12.5～200 mg/kg）后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠血清中ALT、AST和ALP的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量也显著降低。结果表明五味子醇乙能够预防治疗石胆酸所诱导的胆汁淤积性肝损伤。
另外，本发明还通过胆管结扎造成小鼠肝外胆汁淤积模型，协同给予五味子醇乙（200 mg/kg）后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠血清中ALT、AST的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量降低，以及尿液排出总胆汁酸及总胆红素含量上升。结果提示五味子醇乙能够预防治疗石胆酸及胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝病。
综上所述，五味子醇乙能够预防治疗石胆酸和胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤。同时，办本发明还对该作用的机制进行了研究，通过肝脏基因与蛋白表达分析证实了五味子醇乙能够显著上调CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4基因的表达，表明了五味子醇乙预防治疗石胆酸和胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤的机制可能涉及调控CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排。
因此，根据本研究的结果，可以将五味子醇乙用于制备临床上预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物。
另外，五味子醇乙还可以应用于CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4基因介导调控的其他疾病的预防和治疗，如胆固醇结石、高脂蛋白血症等。五味子醇乙可以促进CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4基因的表达，参与调控胆汁酸代谢及外排，而胆汁酸代谢与胆固醇结石、或高脂蛋白血症的形成有密切关系。胆汁酸代谢可从下述几方面影响体内胆固醇的平衡：（1）胆汁酸的生物合成是内源性胆固醇的主要代谢去路，胆汁酸的生物合成又主要是通过其本身的反馈作用进行调控的；（2）肝细胞通过胆汁排泄胆固醇，主要依靠胆汁酸的乳化及形成混合微团的作用，因而胆汁酸合成、分泌的质和量都对胆固醇的排泄有影响；（3）胆汁酸在食物胆固醇的吸收过程中起协助作用，吸收的胆固醇直接调控肠壁细胞及肝细胞内胆固醇的合成；因此，高脂蛋白血症时的代谢紊乱必然涉及胆汁酸的代谢异常。
本发明具有以下有益效果：
本发明克服了现有胆汁淤积预防和治疗药物的局限，提供五味子醇乙及以其为主要活性成分的药物在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。发现了五味子醇乙能够预防治疗石胆酸或胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤。
首先通过给予过量石胆酸造成小鼠肝内胆汁淤积模型，协同给予五味子醇乙（12.5～200 mg/kg）后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠血清中ALT、AST和ALP的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量也显著降低。结果表明五味子醇乙能够预防治疗石胆酸所诱导的胆汁淤积性肝损伤。另外，本发明还通过胆管结扎造成小鼠肝外胆汁淤积模型，协同给予五味子醇乙（200 mg/kg）后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠血清中ALT、AST的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量降低，以及尿液排出总胆汁酸及总胆红素含量上升。结果提示五味子醇乙能够预防治疗石胆酸及胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝病。
同时，办本发明还对该作用的机制进行了研究，通过肝脏基因与蛋白表达分析证实了五味子醇乙能够显著上调CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4基因的表达，表明了五味子醇乙预防治疗石胆酸和胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤的机制可能涉及调控CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排。
因此，根据本研究的结果，可以将五味子醇乙用于临床上胆汁淤积性肝病的预防或治疗，且疗效好、无毒副作用，同时五味子醇乙成本低，易获得，具有很好的推广应用价值。
附图说明
图1为五味子醇乙减轻石胆酸所致肝坏死程度结果图。
图2为五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血清ALT指标的升高结果图。
图3为五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血清AST指标的升高结果图。
图4为五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血清ALP指标的升高结果图。
图5为五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血中总胆汁酸升高结果图。
图6为五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血中总胆红素升高结果图。
图7为五味子醇乙在石胆酸模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Cyp3a11表达影响结果图。
图8为五味子醇乙在石胆酸模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Ugt1a1表达影响结果图。
图9为五味子醇乙在石胆酸模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Oatp1a4表达影响结果图。
图10为五味子醇乙在石胆酸模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关蛋白表达影响结果图。
图11为五味子醇乙在石胆酸模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关蛋白表达定量统计结果。
图12为五味子醇乙减轻胆管结扎所致肝坏死程度结果图。
图13为五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清ALT指标的升高结果图。
图14为五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清AST指标的升高结果图。
图15为五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清ALP指标的升高结果图。
图16为五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清中总胆汁酸升高结果图。
图17为五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清中总胆红素升高结果图。
图18为五味子醇乙增加胆管结扎所致小鼠尿液中总胆汁酸排出量结果图。
图19为五味子醇乙增加胆管结扎所致小鼠尿液中总胆红素排出量结果图。
图20为五味子醇乙在胆管结扎模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Cyp3a11的表达影响结果图。
图21为五味子醇乙在胆管结扎模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Ugt1a1的表达影响结果图。
图22为五味子醇乙在胆管结扎模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关基因Oatp1a4的表达影响结果图。
图23为五味子醇乙在胆管结扎模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关蛋白表达影响结果。
图24为五味子醇乙在胆管结扎模型中对小鼠胆汁酸稳态调控相关蛋白表达定量统计结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 过量石胆酸造成的小鼠肝内胆汁淤积模型的治疗
1、材料与方法
（1）主要仪器：
5417-R 低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；全波长酶标仪（美国Thermo公司）；Mini-protein3电泳系统（美国Bio-Rad公司）；Mini Trans-Blot转移系统（美国Bio-Rad公司）；ImageQuant LAS 4000曝光成像仪（美国General Electric公司）；梯度PCR仪（德国Eppendorf公司）；7500 Real Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）。
（2）药品和试剂 
五味子醇乙（纯度≥98%，上海融禾医药科技发展有限公司）；石胆酸（纯度≥98%，上海阿拉丁试剂有限公司），羧甲基纤维素钠（CMC，纯度≥98%，美国Sigma公司）；玉米油（药用级，上海阿拉丁试剂有限公司）；孕烷烯酮 16-腈（PCN，纯度≥98%，美国Sigma公司）；熊去氧胆酸（UDCA，药用级，上海阿拉丁试剂有限公司）；ALT、AST、ALP、总胆汁酸、总胆红素检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）； Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、RT-qPCR试剂盒（大连Takara公司）；引物（上海Invitrogen公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，美国Millipore公司）；CYP3A11一抗（美国Santa cruz公司）；UGT1A1一抗（美国Abcam公司）；GAPDH一抗（上海生工生物工程有限公司）；RIPA裂解液（上海博彩生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司）；ECL发光液（北京英格恩生物科技公司）；其它试剂均为分析纯级别。
2、实验动物及给药方案 
C57BL/6小鼠，雄性，周龄8～9周，由中山大学（广州市大学城）实验动物中心提供，许可证号为SCXK（粤） 2011-0029，正常小鼠用维持饲料喂养。
五味子醇乙（12.5，25，100 mg/kg）超声分散于预高压灭菌的0.5%(w/w) CMC；石胆酸（125 mg/kg）与PCN（50 mg/kg）溶于玉米油。
小鼠随机分成7组，每组6～12只，组别为空白对照组、高剂量五味子醇乙组、石胆酸造模组、石胆酸+低剂量五味子醇乙组、石胆酸+中剂量五味子醇乙组、石胆酸+高剂量五味子醇乙组以及石胆酸+PCN组。
五味子醇乙给药方式为灌胃，连续给药7天，第天两次。石胆酸和PCN的给药方式均为腹腔注射，其中PCN连续给药7天，每天一次，而石胆酸在第四天开始协同给药，共给药4天，每天两次。
最后一次给药后24h处理解剖小鼠，解剖后对在体（在体是指在腹腔内未分离出来的）的肝脏及胆囊的形态进行拍照，然后收集血清以及肝脏，每组取三只小鼠部分肝脏置于10%(v/v)甲醛中固定，其它样本在-80℃冷冻保存备用。
3、肝组织与血清化学检测
肝组织切片与H&E染色由中山大学实验动物中心病理切片室完成，血清中的ALT、AST、 ALP、总胆汁酸、总胆红素检测方法按照试剂盒的说明书来完成。
4、数据统计
各组实验数据均以mean±S.E.M. 表示，采用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，采用unpaired Student’s t test进行两组间比较，P < 0.05被认为有显著性差异。其中^*表示与非造模空白对照组比较P<0.05，^**表示与空白对照组比较P<0.01，^***表示与空白对照组比较P<0.001，^#表示与造模空白对照组比较P<0.05，^##表示与造模空白对照组比较P<0.01，^###表示与造模空白对照组比较P<0.001。
5、实验结果
（1）五味子醇乙减轻石胆酸所致肝坏死程度
如附图1A所示，与空白对照组相比，石胆酸造模组小鼠的肝脏解剖可见明显的肝坏死病理改变，表现为肝包膜下出现无数明显的白色的坏死病灶点，同时胆囊呈现异常的扩张。协同给予200 mg/kg五味子醇乙或者50 mg/kg PCN组小鼠肝包膜下的坏死病灶点数目明显减少，肝脏形态趋于正常，而且胆囊恢复至正常形态。
如附图1B的H&E染色结果所示，与空白对照组相比，石胆酸造模组小鼠出现大面积的肝细胞坏死，协同给予200 mg/kg五味子醇乙或者50 mg/kg PCN组小鼠无显著的肝细胞坏死。附图1A和1B表明了五味子醇乙能显著减轻石胆酸所致肝坏死的程度。
（2）五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血清ALT、AST和ALP的升高
如附图2、附图3和附图4所示，与空白对照组相比，石胆酸造模组小鼠的ALT、AST和ALP水平分别上升至5572 U/L、6548 U/L 和666 U/L，表明了石胆酸能够造成严重的肝损伤以及胆管损伤。
分别协同给予12.5、50、200 mg/kg的五味子醇乙能剂量依赖性的逆转石胆酸诱导的ALT、AST和ALP水平上调，其中ALT水平分别降至石胆酸造模组的40%、18% 和1%；AST水平降至石胆酸造模组的39%、22% 和3%；ALP水平降至石胆酸造模组的44%，31% 和16%。该结果表明了五味子醇乙能剂量依赖性的保护石胆酸所致小鼠的肝损伤和胆管损伤。
（3）五味子醇乙剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血中总胆汁酸和总胆红素水平的升高
如附图5和附图6所示，与空白对照组相比，石胆酸造模组的小鼠血中总胆汁酸和总胆红素水平上升至18.3倍和15.4倍，表明了石胆酸能导致严重的胆汁淤积。分别协同给予12.5、50、200 mg/kg的五味子醇乙能剂量依赖性的逆转石胆酸诱导的血中总胆汁酸和总胆红素水平上调，其中，血中总胆汁酸水平降至石胆酸造模组的61%、11% 和 4%；血中总胆红素水平降至石胆酸造模组的38%、21% 和 8%，表明了五味子醇乙能剂量依赖性的减轻石胆酸所致小鼠的胆汁淤积。
6、五味子醇乙对胆汁酸代谢或转运相关基因的影响
（1）RT-qPCR
按照Trizol试剂的说明书提取得到小鼠肝细胞总RNA，按照RT试剂盒说明书逆转录得到cDNA， 按照qPCR试剂盒说明书检测特定基因Cyp3a11（NM_007818，小鼠）、Ugt1a1（NM_201645，小鼠）和Oatp1a4（NM_030687，小鼠）的mRNA表达量，以基因Gapdh（NM_008084，小鼠）作为内参基因。
所使用的引物序列如下所述：
内参基因Gapdh使用引物Gapdh-F和Gapdh-R；
Gapdh-F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG（SEQ ID NO：1所示）；
Gapdh-R：GGGGTCGTTGATGGCAACA（SEQ ID NO：2 所示）。
基因Cyp3a11使用引物Cyp3a11-F和Cyp3a11-R；
Cyp3a11-F：GGATGAGATCGATGAGGCTCTG（SEQ ID NO：3所示）；
Cyp3a11-R：CAGGTATTCCATCTCCATCACAGT（SEQ ID NO：4 所示）。
基因Ugt1a1使用引物Ugt1a1-F和Ugt1a1-R；
Ugt1a1-F：GCTTCTTCCGTACCTTCTGTTG（SEQ ID NO：5所示）；
Ugt1a1-R：GCTGCTGAATAACTCCAAGCAT（SEQ ID NO：6所示）。
基因Oatp1a4使用引物Oatp1a4-F和Oatp1a4-R。
Oatp1a4-F：CCCTGGGGACATCGACTCTT（SEQ ID NO：7所示）；
Oatp1a4-R：CCATCATTCTGCATCGTAGGAC（SEQ ID NO：8所示）。
（2）Western blot
按照RIPA裂解液或者核蛋白提取试剂盒的说明书得到相应的组织总蛋白或者核蛋白产物，蛋白浓度测定采用BCA法，蛋白分离过程中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8%（w/v），分离后的蛋白转移到PVDF膜中，然后用含5%(w/w)脱脂奶粉的TBST溶液常温下封闭1h，再分别用不同的一抗（GAPDH，CYP3A11，UGT1A1）在4℃孵育过夜，之后用TBST洗膜两次，每次5min，然后在常温下分别孵育相应来源的二抗1h，再接着用TBST洗膜三次，每次5min，最后按照ECL发光液的说明书曝光得到蛋白条带。
（3）如附图7、附图8和附图9所示，共检测了与胆汁酸代谢或转运相关的3个基因的表达：Cyp3a11、Ugt1a1、Oatp1a4。检测结果显示五味子醇乙能显著上调Cyp3a11、Ugt1a1、Oatp1a4的mRNA水平。如附图10所示，五味子醇乙能显著上调CYP3A11和UGT1A1的蛋白水平。附图11为附图10中蛋白条带的定量统计结果，蛋白水平的结果与基因水平结果一致。该结果显示了五味子醇乙预防与治疗胆汁淤积性肝病作用的机制可能涉及对CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排的调控作用。
实施例2 胆管结扎造成的小鼠肝外胆汁淤积模型的治疗
1、材料与方法
（1）主要仪器同实施例1。
（2）药品和试剂：熊去氧胆酸（UDCA，上海阿拉丁试剂有限公司）；其余同实施例1。
2、实验动物及给药方案 
C57BL/6小鼠，雄性，周龄8～9周，由中山大学（广州市大学城）实验动物中心提供，许可证号为SCXK（粤）2011-0029，正常小鼠用维持饲料喂养。
五味子醇乙（200 mg/kg）超声分散于预高压灭菌的0.5%(w/w)CMC；熊去氧胆酸（25 mg/kg）溶于生理盐水。
小鼠随机分成5组，每组6～8只，组别为假手术空白对照组、假手术+五味子醇乙组、胆管结扎空白对照组、胆管结扎+五味子醇乙组以及胆管结扎+熊去氧胆酸组。
五味子醇乙给药方式为灌胃，连续给药7天，每天两次（单次剂量为100 mg/kg）。UDCA的给药方式为腹腔注射，连续给药7天，每天一次。
而胆管结扎术在第四天给药前进行。用乙醚将小鼠麻醉后沿腹中线左侧肋骨下方处剪开约2 cm的切口，用手术镊轻轻牵引出十二指肠，在十二指肠与肝连接处可见一条白色的韧性细管，即为胆管。小心将胆管周围覆盖的脂肪样组织分离，分别将靠近十二指肠方向和靠近肝脏方向结扎，然后将两段结扎之间的胆管剪断。沿腹部切口进行缝合。假手术组除不结扎及剪断胆管外，其余操作均与胆管结扎术相同。
第6天上午给药后立即转入代谢笼中，连续收集24h尿液。尿液采集完毕立即置于冰浴，并于当日进行相应指标检测。第7天给药后4h处理解剖小鼠，解剖后对在体的肝脏及胆囊的形态进行拍照，然后收集血清以及肝脏，每组取三只小鼠部分肝脏置于10%(v/v)甲醛中固定，其它样本在-80℃冷冻保存备用。
3、肝组织与血清化学检测方法同实施例1。 
4、数据统计方法同实施例1。
5、实验结果
（1）五味子醇乙减轻胆管结扎所致肝坏死程度
如附图12A所示，与假手术空白对照组相比，胆管结扎空白对照组小鼠的肝脏解剖可见明显的肝坏死病理改变，表现为肝包膜下出现众多明显的红色星状病灶点。协同给予200 mg/kg五味子醇乙或者25 mg/kg UDCA组小鼠肝包膜下的坏死病灶点数目明显减少，肝脏形态趋于正常。如附图12B所示，H&E染色结果显示与假手术空白对照组相比，胆管结扎空白对照组小鼠出现较大面积的肝细胞坏死。协同给予200 mg/kg五味子醇乙或者25 mg/kg UDCA组小鼠肝坏死程度明显减少。附图12A和12B的结果表明了五味子醇乙能显著减轻胆管结扎所致肝坏死的程度。
（2）五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血清ALT、AST的升高
如附图13、附图14和附图15所示，与假手术空白对照组相比，胆管结扎空白对照组小鼠的ALT、AST和ALP水平分别上升至904 U/L、1548 U/L和1072 U/L，提示石胆酸能够造成严重的肝损伤以及胆管损伤。分别协同给予200 mg/kg的五味子醇乙能逆转胆管结扎诱导的ALT、AST水平上调，其中ALT水平降至石胆酸造模组的39%，AST水平降至石胆酸造模组的65%。但五味子醇乙对胆管结扎诱导的ALP水平上调无明显逆转作用。该结果表明了五味子醇乙能保护胆管结扎所致小鼠的肝损伤。
（3）五味子醇乙逆转胆管结扎所致小鼠血中总胆汁酸和总胆红素的升高，以及增加尿中总胆汁酸和总胆红素排出量
如附图16～19所示，与假手术空白对照组相比，胆管结扎空白对照组的小鼠血中总胆汁酸和总胆红素水平上升至34.9倍和24.0倍，同时肝中总胆汁酸水平上升至1.63倍，提示石胆酸能导致严重的胆汁淤积。协同给予200 mg/kg的五味子醇乙能逆转胆管结扎诱导的血中总胆汁酸和总胆红素。其中，血中总胆汁酸水平降至胆管结扎空白对照组的67%；血中总胆红素水平降至胆管结扎空白对照组的66%。另外，五味子醇乙能显著增加尿液当中总胆汁酸和总胆红素的排出量，分别上升至胆管结扎空白对照组的113%、154%。表明了五味子醇乙能在一定程度上减轻胆管结扎所致小鼠的胆汁淤积。
6、五味子醇乙对对胆汁酸代谢或转运相关基因的影响
（1）RT-qPCR同实施例1。
（2）Western blot同实施例1。
（3）如附图20～22所示，共检测了与胆汁酸代谢或转运相关的3个基因的表达：Cyp3a11，Ugt1a1，Oatp1a4。检测结果显示五味子醇乙能显著上调Cyp3a11，Ugt1a1，Oatp1a4的mRNA水平。如附图23所示，五味子醇乙能显著上调CYP3A11和UGT1A1的蛋白水平。附图24为附图23中蛋白条带的定量统计结果，蛋白水平的结果与基因水平结果一致。该结果显示了五味子醇乙预防与治疗胆汁淤积性肝病作用的机制可能涉及对CYP3A11、UGT1A1、OATP1A4介导的胆汁酸代谢及外排的调控作用。
实施例3 五味子醇乙对胆固醇结石、高脂蛋白血症等的治疗
本发明还初步研究了五味子醇乙对胆固醇结石、高脂蛋白血症的影响和治疗作用，结果显示，五味子醇乙能够显著降低血清胆固醇含量，降低血脂含量，对胆固醇结石和高脂蛋白血症的预防和治疗效果明显。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中山大学
 
<120>  五味子醇乙在制备预防和治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用
 
<130> 
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
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<400>  8
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