一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法.pdf

一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法,其是按以下步骤制备:取金银花、地锦草、白头翁、黄连、牛胆汁、板兰根、车前草、黄芪、石榴皮、甘草；将各中药超微粉碎加乙醇溶液武火煮沸，文火保温，冷却过滤，浓缩滤液，加入白糖煮沸，冷却降至常温后接种乳酸杆菌、红茶菌及酵母菌，经120~168h发酵至长出白色菌块；三、将白色菌块和菌液，按1:100~300稀释，二次发酵24~48h后,即得微生态口服液。本发明中药微生态口服剂具有增加肠道内有益菌群数量，提高免疫功能，增强鸡体抗病力,本发明的有益效果预防效果好,治愈率达到94.6%,且制备方法简单，活菌含量高，使用方便，绿色无残留。

1.  一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：它是按以下步骤制备：一、取金银花、地锦草、白头翁、黄连、牛胆汁、板兰根、车前草、黄芪、石榴皮、甘草；二、除牛胆汁外，将各中药超微粉碎加乙醇溶液武火煮沸，文火保温，冷却过滤，浓缩滤液，加入白糖煮沸，冷却降至常温后接种乳酸杆菌、红茶菌及酵母菌，经120~168h发酵至长出白色菌块；三、将白色菌块和菌液，按1:100~300稀释，二次发酵24~48h后，即得微生态口服液。

2.  根据权利要求1所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：秤取以下重量份的中药：金银花80~100、地锦草80~100、白头翁80~100、黄连80~100、牛胆汁60~80、板兰根60~80、车前草40~60、黄芪40~60、石榴皮30~40、甘草20~30。

3.  根据权利要求1所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：除牛胆汁外，秤取重量份的中药，超微粉碎，加入中药总重量8～10倍量的50%～70%的乙醇溶液，浸泡30～60min，武火煮沸，文火保温30～60min，冷却十二层纱布过滤；滤渣再加6～8倍量的水，武火煮沸，文火保温30～60min，冷却十二层纱布过滤，合并两次滤液，浓缩回收乙醇，用乙醇检测仪检测浓缩液中无乙醇时停止浓缩，同时向浓缩液中加入牛胆汁。

4.  根据权利要求1所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：以100 Kg浓缩液为单位添加白糖10～15Kg，并煮沸3～5min，冷却至常温，接种乳酸杆菌、红茶菌、酵母菌（市售）制剂20～25Kg，设定发酵温度28～35℃，静置发酵培养120～168h,至pH6.5～7.0长出白色菌块为止。

5.  根据权利要求1所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：将白色菌块和菌液，按1:100～300兑入5%～10%冷糖开水稀释，发酵温度20～35℃，二次发酵24-48h后，即得微生态口服液。

6.  根据权利要求1所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：步骤二是在无菌发酵室内进行。

一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生态饲料添加剂技术领域，具体说是涉及一种防治鸡大肠杆菌病的天然绿色禽用中药微生态口服剂的制备方法。
背景技术
大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）为革兰氏阴性、不形成芽孢的杆菌，大小通常为0.4～0.7μm×2～3μm，两端钝圆，散在或成对，大多数菌株具有周身鞭毛，能活波运动，变异株无鞭毛不能运动。大肠杆菌为兼性厌氧型菌，在普通培养基上生长良好，最适温度为37℃，最适pH为7.2～7.4。它是人和大多温血动物肠道中正常菌群之一，在人和动物出生后数小时即可进入消化道后段增殖，终生伴随，并经粪便不断散播于周围环境。故大肠杆菌在环境卫生和食品卫生学上，常被用作粪便直接或间接污染的检测指标。根据表面抗原的不同大肠杆菌抗原主要有O、K、H 3种，是本菌血清型鉴定的物质基础。已经确定的大肠杆菌O抗原有173种，K抗原有80种，H抗原有56种，自然界中可能存在的血清型可达数万种，导致了其防治方面困难很大，但致病性大肠杆菌的血清型是有限的。
鸡大肠杆菌病是由某些血清型的鸡致病性大肠埃希菌引起的传染病，包括大肠杆菌性败血症、肉芽肿、气囊炎、肝周炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎等一系列疾病，该病是鸡胚胎和雏鸡死亡的重要原因之一。该病主要发生在集约化养禽场，各种禽类不分品种、性别、日龄、均对本菌易感。特别是幼禽最易发生此病，如处于污秽、拥挤、潮湿、通风不良的环境，过冷过热或温差很大，有毒有害气体长期存在，饲养管理失调，营养不良(特别是维生素的缺乏)以及病原微生物(如支原体及病毒)感染所造成的应激等均可促使本病的发生。该普遍存在于自然界和各种动物的肠道内，但有致病性的仅有10%-15%；粪便污染和种蛋污染是该病主要的传播途径。鸡大肠杆菌病临床症状表现为发病初期病鸡精神沉郁，食欲减退或废绝，两翅下垂，饮欲稍增，眼睑肿胀，鼻分泌物增多，呼吸有啰音，鸡冠呈暗紫红色；部分鸡拉黄绿色、灰白色稀便、有时混有血液，肛门周围及腹下羽毛被粪便污染。鸡大肠杆菌病的病理变化：纤维素性心包炎，心包积液混浊、增厚；纤维素性肝周炎，肝脏肿大、表面有纤维素性渗出物；纤维素性腹膜炎，腹腔有数量不等的腹水及纤维素渗出物，或其渗出物充斥于腹腔各脏器间；卵黄性腹膜炎输卵管伞部粘连、卵泡跌入腹腔引起广泛腹膜炎；卵巢炎、输卵管炎输卵管充血、出血，卵泡膜充血、卵泡变形、变色（呈红褐色或黑褐色）有的变硬，卵黄变稀。
目前，我国鸡大肠杆菌耐药性严重而复杂，几乎所有的抗菌药物都已经产生耐药性，而且其耐药性以多重耐药为主，不再停留在对同一类中数种抗生素的交叉耐药。大肠杆菌耐药菌株引起的感染在临床上不但有增多的趋势，而且耐药性也在不断发生变化，大肠杆菌多重耐药菌株的出现，严重影响了该病的临床治疗效果。家禽大肠杆菌产生耐药性的速度极快，主要与我国目前抗生素的滥用、家禽养殖环境、养殖方式和技术水平密切相关。养殖户把使用抗生素作为控制大肠杆菌的主要手段，但实际应用中，由于药敏试验普及率低,用药盲目性大，随意加大剂量，低剂量长期使用，不注意轮换用药，造成大肠杆菌耐药严重。随着时间的推移，鸡大肠杆菌的耐药率大幅度上升，多重耐药菌株迅增，耐药谱增宽。耐药性的发生，导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大。另外药物的滥用造成机体内微生物菌群的失调，也是大肠杆菌病一个常见的诱发因素。
中草药是中华民族几千年来在生产斗争中认识自然、改造自然的智慧结晶，是我们民族繁衍兴旺的保障。它是天然药物，在进化过程中获得了适应环境和抵御各种损害的相应的各种成分与能力，建立起自身的调节系统(BRM)，而中药所含有的BRM物质又能加强或保护动物固有的抗药能力，且它药性温和，毒副作用小甚至无毒副作用，这些都是化学药物所不能比拟的。中兽医辩证论治理论认为该病是由疫毒内侵、肺胃热盛、血淤气滞引起,中药治疗时宜以清热解毒、凉血、燥湿药物为主。许多中药都具有抗菌消炎的作用，同时使用中药治疗疾病不易产生耐药性、无毒或低毒、无残留或低残留，一些中药还兼有调节机体功能和补充营养的功效。因此选用中药来治疗鸡大肠杆菌病必将是养殖业防病治病的发展趋势。
而将中药和微生物在一起发酵制备成防治鸡大肠杆菌病的微生态口服剂，现有技术中未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对以上技术的不足，解决目前大肠杆菌病的耐药性和抗生素残留的问题，提供一种具有防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，该制备方法简单、使用方便、安全环保、纯生态、无残留、活菌含量高。
为达到上述目的，本发明采用的制备方法如下：
一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：它是按以下步骤制备：1、秤取金银花、地锦草、白头翁、黄连、牛胆汁、板兰根、车前草、黄芪、石榴皮、甘草；2、除牛胆汁外，将各中药超微粉碎加乙醇溶液武火煮沸，文火保温，冷却过滤，浓缩滤液，加入白糖煮沸，冷却降至常温后接种乳酸杆菌、红茶菌及酵母菌，经120~168h发酵至长出白色菌块；3、将白色菌块和菌液，按1:100~300稀释，二次发酵24~48h后，即得微生态口服液。
所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：秤取以下重量份的中药：金银花80~100、地锦草80~100、白头翁80~100、黄连80~100、牛胆汁60~80、板兰根60~80、车前草40~60、黄芪40~60、石榴皮30~40、甘草20~30。
所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：除牛胆汁外，秤取重量份的中药，超微粉碎，加入中药总重量8～10倍量的50%～70%的乙醇溶液，浸泡30～60min，武火煮沸，文火保温30～60min，冷却十二层纱布过滤；滤渣再加6～8倍量的水，武火煮沸，文火保温30～60min，冷却十二层纱布过滤，合并两次滤液，浓缩回收乙醇，用乙醇检测仪检测浓缩液中无乙醇时停止浓缩，同时向浓缩液中加入牛胆汁。
所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：以100 Kg浓缩液为单位添加白糖10～15Kg，并煮沸3～5min，冷却至常温，接种乳酸杆菌、红茶菌、酵母菌（市售）制剂20～25Kg，设定发酵温度28～35℃，静置发酵培养120～168h,至pH6.5～7.0长出白色菌块为止。
所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：将白色菌块和菌液，按1:100～300兑入5%～10%冷糖开水稀释，发酵温度20～35℃，二次发酵24-48h后，即得微生态口服液。
所述的一种防治鸡大肠杆菌病中药微生态口服剂的制备方法，其特征在于：步骤二是在无菌发酵室内进行的。
本发明中药微生态口服剂具有增加肠道内有益菌群数量、提高免疫功能、增强鸡体抗病力等功效，且制备方法简单、使用方便、无残留。本发明的有益效果预防效果好,治愈率达到94.6%，活菌含量高经测定含量在8×10⁸cfu/g。
本发明中药微生态口服剂的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定以及药敏试验，分别测定第一次发酵液和二次发酵液，本试验所用菌株为大肠杆菌O₇₈ ( CVCC1418 ) 购自中国兽医药品监察所。采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，具体操作如下：取加塞无菌小试管9支, 每管中加入制好的普通肉汤培养基1mL，在1管加中药1mL,用微量移液器混匀，吸取1mL至第2管混匀，依次到第7管，从第7管吸出1mL混合液并弃之，第8管做阳性对照（加菌液不加中药），第9管做阴性对照（加中药不加菌液），此时1到7号管内药液的浓度分别相当于500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.81mg/mL生药浓度；向1-8管加稀释好的菌液0.1mL，第9管不加菌液，但加0.1mL LB肉汤培养基；将各组试管置于37℃条件下培养20h，观察并记录结果；与对照组比较,有絮状沉淀的管则为有细菌生长，无絮状沉淀的管为细菌生长受抑制管，以肉眼观察无絮状沉淀管的最低药物浓度作为该药的最小抑菌浓度（MIC）；由于中草药对细菌的MIC国内目前尚无统一的标准，本试验参照同类试验的标准作为判断标准（当MIC≤15.63mg/mL生药浓度时为高度敏感；当MIC在15.63～62.5mg/mL生药浓度时为中度敏感；当MIC为62.5～250.00 mg/mL生药浓度时为较敏感；当MIC>250.00 mg/mL生药浓度时为不敏感）测出MIC后，再依次从未见细菌生长的各试管培养物中取一接种环，接种于不含药的普通琼脂平板上，轻轻摊开菌液，37 ℃培养24 h，观察有无细菌生长，普通琼脂平板中，生长的菌落数小于5个菌落的药液最低浓度，即为MBC；药敏试验采用纸片扩散法，测定抑菌圈直径，参照标准药敏试验结果，判定药物的敏感性。测得结果见表1。
表1 MIC、MBC和药敏试验结果