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具有抗增殖特性的肽
    本发明涉及具有抗增殖特性的肽，编码所述肽的核酸分子(DNA/RNA)，结构上与所述核酸同源的肽核酸，以及所述肽，所述核酸，所述肽核酸和/或其药物组合物在生物技术，分子生物学，生物信息学和过度增殖性疾病，特别是癌症和动脉粥样硬化的诊断和治疗中的用途。

    在肿瘤学中，有多种不同的治疗方式，这些方式主要基于外科方法，化学疗法或放射性疗法。然而，在癌症治疗中，这些方法并不能提供所需的结果。根据美国最新的统计学资料，每3个美国人中有1个会患癌症，每5个人中有1个将死于癌症。此数字可能也适用于全世界所有的工业化国家，在十多年的时间里此数字没有明显的变化。另外，也注意到在过去的20年时间内，治疗癌症的效力基本上没有改善，因为对大多数癌症类型而言，5年存活率基本上维持原状(R.H.Proctor“The Sciences”,3月/4月1995,p20-24)。

    因此，本发明的目的是提供抑制多种不同类型的癌症生长，最终导致肿瘤消失的方法。

    通过权利要求1的肽，权利要求13的核酸(DNA/RNA)，权利要求16的肽核酸，权利要求17的药物组合物以及通过权利要求20的所述肽的用途，权利要求22的DNA/RNA的用途，权利要求23的肽核酸的用途和权利要求21的药物组合物的用途可达到上述目的。优选的实施方案示于从属权利要求中。

    本发明人已发现一种有希望的治疗癌症的方法，所述方法利用了可封闭导致癌症之物质，尤其是致癌蛋白质的特异性肽。本发明肽的特征在于序列长度短，这使得它们在合成方面较经济。另外，它们也能有效地穿透细胞，因而能中和促进癌症生长的细胞内蛋白质。

    以前发现在多种癌症类型中，肿瘤抑制基因缺失或突变的结果会导致不能充足提供相应的基因产物。这最终会导致癌症的生长(A.G.Knudson，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)(1993),vol90,p10914-10921；A.J.Levine，科学美国人，“科学与医药学”(Sci.Am.“Science &Medicine”),Jan./Feb,1995,p28-37)。

    肿瘤抑制蛋白，如RB1的缺损对于其它过度增殖性疾病，如动脉粥样硬化的病理似乎也是重要的。本发明人发现将肿瘤抑制蛋白质的一部分导入细胞以封闭加快细胞失控生长的生长因子即已足够。不可能导入完整的肿瘤抑制蛋白，因为这种蛋白质太长，在多数情况下会遭遇蛋白酶降解，从而阻止蛋白质行使其作用。另一方面，如果仅利用肿瘤抑制蛋白的一部分，所述部分也会被很快地降解，即它们不够稳定。

    因此，本发明的肽是合成的融合多肽，所述多肽由组分(A)和(B)组成，其中这些组分相互连接成AB或BA，第一组分(A)含有肿瘤抑制蛋白的有效部分(其类型为本发明人第一次发现)，或其亲水同源部分，第二组分(B)含有稳定第一组分(A)的序列。根据本发明，本发明的肽与生长因子或生长因子受体结合，优选与其中的序列LXCXE结合，更优选与胰岛素中的LXCXE结合，即与LVCGE结合(Radulescu等，生物化学和生物物理学研究通讯，1995,vol.206,p97-102)。由于生长因子IGF-1和IGF-2含有序列FVCGD，该序列与胰岛素中的区段LVCGE亲水同源(R.Radulescu & C.Wendtner，分子识别杂志(J.Mol.Recognition),1992,vol.5,p133-137)，因此本发明的肽能与IGF-1和IGF-2结合。

    本文所用术语“亲水同源”的根据是Kyte和Doolittle(J.Kyte & R.F.Doolittle，分子生物学杂志，1982,vol.157,p105-132)和J.E.Blalock和Smith,E.M．(生物化学和生物物理学研究通讯，vol.121,no.1,p203-207(1984))的教导。

    组分(A)其它的特征在于这样一个事实，即它分别根据互补肽理论(J.E.Blalock，生物技术趋势(Trends in Biotechnology),vol.8,p140-144,1990年6月)或根据三维构型与生长因子或生长因子受体的片断亲水互补。生长因子的例子是：胰岛素，IGF-1,IGF-2,EGF,FGF，血管生成素，NGF和PDGF。

    根据本发明，本发明肽之组分(A)的有效区域可得自下列肿瘤抑制基因产物：RB1,P107,P130,WT1,TP53,NF1,NF2,VHL,APC,NB1,MLM,MEN1,BCNS,RCC,BRCA1,BRCA2,DCC,MTS1=p16,MTS2,p21,p27等。在优选的实施方案中，组分(A)含有RB1的一部分，尤其是RB1的氨基酸649-654，即LFYKKV或其亲水同源部分。

    融合肽的组分(B)作为辅因子具有稳定所述组分(A)以使后者在细胞中不会被蛋白酶降解的特性。通过快速到达它们不易在其中被蛋白酶降解的细胞核中(R.Fahraeus等，Current Biology,1996,vol.6,no.1,p84-91)的本发明肽，或通过使用支化的组分(B)，如聚赖氨酸支链或聚赖氨酸核心(core)，或通过使用D-氨基酸可达到此目的。在优选的实施方案中，组分(B)是聚赖氨酸核心(R.Radulescu等，生物化学和生物物理学研究通讯，1995,Vol.206,p97-102；和G.Fassina,EPO 0 481 930 A2)或核定位序列(NLS)，尤其是SV40 NLS或Penetratin或二分的NLS或RNP A1 NLS(M9区域)。有关优选被导入(directed)细胞核中的肽的构建的一般性参考文献见Sheldon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.92,p2056-2060(1995)；Dingwall等，生化科学动态(Trends in Biochemical Science)16,p478-481(1991)；M.S.Moore，当代生物学(Current Biology),vol.6,no.2,p137-140(1996)；D.A.Jans，欧洲分子生物学联合会杂志(FASEB Joumal),1994,vol.8,p841-847；J.Moroianu&J.F.Riordan,PNAS,1994,vol.91,p1677-1681和D.Derossi等，生物化学杂志，1994,vol.269,p10444-10450。

    在优选的实施方案中，组分(A)具有下列序列或在至少两个位置上与其同源的序列：

    NH₂-LFYKKV-COOH                      (P1)

    NH₂-dLdFdYdKdKdV-COOH                (P4)

    NH₂-KVLYFKRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH      (P8)

    (线表示亲水同源)

    从上述序列中可推知下列的本发明优选肽：

    NH₂-[LFYKKVGGG]₄-[KRG]₂-KG-COOH    (P2)

    此肽是序列P1与聚赖氨酸核心[GGG]₄-[KRG]₂-KG地联合

    NH₂-[LFYKKVGGG]₄-[K]₂-KG-COOH      (P2i)

    此肽是序列P1与聚赖氨酸核心[GGG]₄-[K]₂-KG的联合

    NH₂-[dLdFdYdKdKdV-GGG]₄-[1KdRG]₂-1KG-COOH    (P3)

    此肽是序列P4与聚赖氨酸核心[GGG]₄-[1KdRG]₂-1KG的联合

    NH₂-[dLdFdYdKdKdVGGG]₄-[1K]₂-1KG-COOH    (P3i)

    此肽是序列P4与聚赖氨酸核心[GGG]₄[[1K]₂-1KG的联合

    NH₂-LFYKKVPKKKRKV-COOH    (P5)

    肽P5由序列P1和SV40病毒较大T抗原的核定位序列组成。

    NH₂-LFYKKVRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH    (P6)

    肽P6是序列P1与Penetratin的联合，所述Penetratin是由位于Antennapedia同源区域内的16个氨基酸组成的序列，该序列介导跨膜的转位，因此也是核定位。

    NH₂-[dKdVdLdYdFdKGGG]₄-[1KdRG]₂-1KG-COOH    (P7s)

    肽P7s是P1亲水同源的序列dKdVdLdYdFdK与聚赖氨酸核心[GGG]₄-[1KdRG]₂-1KG的联合。

    NH₂-[dKdVdLdYdFdKGGG]₄-[1K]₂-1KG-COOH    (P7)

    肽P7是与P1亲水同源的序列dKdVdLdYdFdK与聚赖氨酸核心[GGG]₄-[1K]₂-1KG的联合。

    NH₂-KVLYFKRQIKIWFQNRRMKWKK-COOH    (P8)

    肽P8是与P1亲水同源的序列dKdVdLdYdFdK与Penetratin的联合。

    “D”和“L”特指以单字母密码表示的氨基酸构型。

    本发明的肽一般含有L-和/或D-氨基酸，根据本发明，每种氨基酸的全-L-型，全-D-型，逆-反异构体以及L-和D-型的相应变换也在本发明的范围之内。另外，根据本发明，每种氨基酸氧化和还原形式的所有变换，游离形式和携有保护性基团的氨基酸也在本发明的范围之内。本发明肽的最有效的浓度范围为10-4-10-5M。根据具体的应用，其它有效的浓度也是可以的。就涉及支链肽而言，已显示它们以全-D形式存在是有利的。假设含有NLS的线性肽进入细胞核；支链肽可能进入细胞核，但它们在核外也有效。

    本发明的肽可被称为“SCAP”，即“合成的辅因子-相关的抗-致癌肽”。

    优选根据普通的固相法进行本发明肽的制备(见G.A.Grant，“合成肽”，W.H.Freeman and Company,New York,1992)。随后进行本发明肽的纯化，并按所述检定(R.Radulescu等，生物化学和生物物理学研究通讯，1995,vol.206,p97-102)。后一参考文献也提供了使用本发明肽以生物技术纯化如胰岛素的生长因子和生长因子受体的例子。为了用生物技术分离生长因子和生长因子受体，可将携有NLS的本发明肽与含有硫酸乙酰肝素基质的层析柱偶联。

    也可根据标准方法，将本发明肽的组分(A)和(B)从相应的蛋白质上切割下来，并相互连接。制备肽的其它技术是本领域技术人员熟知的(见G.A.Grant，“合成肽”，W.H.Freeman and Company,New York,1992)。

    本发明另外涉及编码本发明肽的DNA/RNA,DNA/RNA序列衍生自遗传密码。

    在优选的实施方案中，下列DNA/RNA序列编码表示本发明肽之组分(A)的上述氨基酸序列(P1)和(P4):

    5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU-3’    (D1)

    在优选的实施方案中，下列DNA/RNA序列编码本发明的上述肽(P5):

    5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU CCU AAG AAG AAG CGU AAGGUU-3’(D5)

    在优选的实施方案中，下列DNA/RNA序列编码本发明的上述肽(P6):

    5’-CUU UUC UAC AAG AAG GUU CGU CAA AUA AAG AUA UGGUUC CAA AAU CGU CGU AUG AAG UGG AAG AAG-3’(D6)

    在优选的实施方案中，下列DNA/RNA序列编码上述肽(P8):

    5’-AAG GUU CUU UAC UUC AAG CGU CAA AUA AAG AUA UGGUUC CAA AAU CGU CGU AUG AAG UGG AAG AAG-3’(D8)

    可将编码本发明肽的DNA/RNA序列掺入适当载体中以用于癌症的基因疗法，方法学的综述见R.C.Mulligan，科学，1993,vol.260,p926-932。

    本领域技术人员应知道上述DNA/RNA序列含有在严紧条件下能与之杂交的DNA/RNA序列。这些序列具体地是在低于DNA/RNA解链温度约20℃下与上述DNA/RNA序列杂交的DNA/RNA序列。另外，根据遗传密码的简并性，上述DNA/RNA序列含有与上述DNA/RNA序列相关的DNA/RNA序列。

    本发明也可应用于生物信息学和分子生物学，可使用下列策略鉴定与生长因子或其受体相互作用的肿瘤抑制蛋白。相应生长因子或其受体的cDNA分别得自NCBI数据库，利用DNA Strider软件，根据互补的肽策略可将此cDNA翻译成互补的DNA和肽。对于所得的互补肽而言，通过利用OWL数据库领航员(navigator)中的BLAST算法规则可发现同源的蛋白质/肽(想要的肿瘤抑制因子)。另一方面，可从肿瘤抑制基因的cDNA开始，以类似的方式分别寻找作为相互作用的伙伴的生长因子或其受体。此方法可分别加快和促进(新)肿瘤抑制蛋白或(新)生长因子或生长因子受体的克隆。例如，已从NCBI数据库中拷贝出人EGF前体的cDNA，并将其拷贝到DNA Strider软件中，利用所述软件，已由EGF前体cDNA得到互补的DNA序列，此DNA序列已被翻译成肽，翻译成所谓的与EGF前体蛋白互补的肽。随后，利用OWL数据库领航员中的BLAST算法规则，寻找与这些互补的肽同源的肽/蛋白质，结果，几个核蛋白质显示出与EGF前体同源，例如结构和功能与RB1相关的p130蛋白，尤其是p130的氨基酸290-313。更具体地，如果相互之间以反平行的方式排列区域，EGF前体氨基酸209-213(REGSN)和p130氨基酸305-309(IGTLS)相互之间亲水互补，因此是EGF前体和p130之间假定复合物的潜在结合位点。因此氨基酸序列IGTLS或与其亲水同源的序列可代表本发明抗增殖肽的组分(A)(见权利要求1和2)。

    就涉及治疗应用而言，本发明的肽可或单独或与几种普通的佐剂，填充剂和/或添加剂一起用于药物组合物。特别有利的实施方案分别是上述肽P3和P6以及P3和P5的联合。就涉及药物组合物的施用形式而言，下列形式是合适的：软膏，溶液，分散剂，乳剂，气雾剂，泡沫，微粒物质(例如颗粒剂，块粒剂(agglomerate)，粉末，微珠，吸附剂(adsorbate))，丸剂，软锭剂，片剂，糖锭剂或胶囊。本发明的肽也可与细胞抑制剂疗法一起使用，或与放射性疗法联合使用。优选局部，皮肤内或穿透皮肤地施用肽，对于全身性施用而言，优选静脉内，动脉内，口服和直肠施用肽，优选膜内，腹膜内或腔内将肽施用到腔内。

    显示出显著的细胞毒效应的本发明肽，DNA/RNA序列和药物组合物可用作药物以治疗癌症，并可根据本发明以此方式应用。

    观察到抗乳腺癌细胞，骨肉瘤细胞和白血病细胞的特殊效力。归功于构成概念的基础，本发明的肽一般分别对显示缺损的成视网膜细胞瘤基因或蛋白质的所有细胞起作用。

    下文将参照15个附图和表描述本发明，其中：

    图1-图12表示在存在或缺乏本发明不同肽时，G1-,S-和G2/M期中的MCF-7细胞或SAOS-2细胞之细胞群体的％；

    图13表示肽P3对K562细胞的细胞毒效应；

    图14表示肽P3对CCRF-CEM细胞和CCRF-CEM/ACT 400细胞的细胞毒效应；

    图15表示肽P3对正常的外周血单核细胞的效应；

    表1表示在MCF-7细胞中由P5-和P-6介导的对细胞循环渐进过程的抑制作用，与之相比，Penetratin不能介导这种抑制作用；

    表2表示在SAOS-2细胞中由P5-和P-6介导的对细胞循环连续的抑制作用，与之相比，Penetratin不能介导这种抑制作用。

    图1表示在无血清的条件下，浓度为10-5M的本发明肽P3在G0/G1期已同步的MCF-7细胞中缩短G1期而延长S期。用P3处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图2表示浓度为10-5M的本发明肽P3在经最适浓度为10-8M的胰岛素类生长因子1(IGF-1)刺激的MCF-7细胞中导致G1和G2/M期的延长以及S期的缩短，从而P3封闭了IGF-1对MCF-7细胞的作用。具体地说，P3延迟了由IGF-1引起的细胞循环的连续，从而延迟了细胞分裂。用P3处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图3表示在无血清的条件下，浓度为10-5M的肽P4,P5和P6中的每一种在G0/G1期已同步的MCF-7细胞中缩短G1期而延长S期。所述细胞，尤其是用P6处理过的那些细胞的形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图4表示浓度为10-5M的本发明肽P6在经最适浓度为10-8M的IGF-1刺激的MCF-7细胞中延长G1期以及缩短S期，从而P6封闭了IGF-1对MCF-7细胞的作用。具体地说，P6延迟了由IGF-1引起的细胞循环的连续，从而延迟了细胞分裂。用P6处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图5表示浓度各为10-5M的肽P3和P5的联合以及浓度各为10-5M的肽P3和P6的联合在经10％胎牛血清(FCS)刺激的MCF-7细胞中导致G1和G2/M期的延长以及S期的缩短。用这些肽联合处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图6表示浓度为10-5M的本发明肽P3在经最适浓度为10-9M的雌二醇(E2)刺激或经最适浓度为10-8M表皮生长因子(EGF)刺激的MCF-7细胞中导致G1-和G2期的延长以及S期的缩短。用P3处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图7表示本发明肽P3以剂量依赖的方式封闭由IGF-1[10-8M]导致的细胞循环的连续。用P3[5×10-6M]处理过的细胞，尤其是用P3[10-5M]处理过的细胞形态学各相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图8表示在无血清的条件下，本发明肽P3[10-5M]在G0/G1期已同步的SAOS-2细胞中缩短G1期而延长S和G2/M期。用P3处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图9表示肽P3[10-5M]在经10％FCS刺激的SAOS-2细胞中延长G1期而缩短S期。用P3处理过的细胞形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图10表示本发明肽P3[10-5M]将不同步生长的MCF-7细胞的G1期缩短而延长其S期，所述细胞已在含有10％FCS的DMEM细胞培养基中温育。用P3处理过的所述细胞的形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图11表示本发明肽P8[10-5M]在经最适浓度为10-8M的IGF-1刺激的MCF-7细胞中延长G1期和G2/M期以及缩短S期，从而P8封闭了IGF-1对MCF-7细胞的作用。具体地说，P8延迟了由IGF-1引起的细胞循环的连续，从而延迟了细胞分裂。用P8处理过的所述细胞的形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图12表示本发明肽P7s[10-5M]在经最适浓度为10-8M的IGF-1刺激的MCF-7细胞中延长G1期和G2/M期以及缩短S期，从而P7s封闭了IGF-1对MCF-7细胞的作用。具体地说，P7s延迟了由IGF-1引起的细胞循环的连续，从而延迟了细胞分裂。用P7s处理过的所述细胞的形态学相当于编程死亡的细胞的形态学。

    图13表示本发明肽P3[10-5M]对温育于RPMI细胞培养基中的不同步生长的K562细胞的细胞毒效应是依赖于时间的，结果已被作图为用P3处理过的活细胞相对于未经P3处理过的活细胞的百分数。活细胞的数目是根据台盼蓝方法，通过在每个时间点至少计数200个细胞而测定的。

    图14表示本发明肽P3[10-5M]以细胞毒的方式对不同步生长的CCRF-CEM_敏感细胞和CCRF-CEM/ACT400_抗性细胞起作用，所述细胞已在含有10％FCS的RPMI培养基中温育。

    图15表示本发明肽P3[10-5M]对正常的人外周血单核细胞不起作用，而不论所述细胞是静止(a)状态或激活(b)状态，从而，经P3处理过的细胞未显示出任何形态学的变化，细胞与P3一起保温24小时。

    表1表示浓度各为10-5M的本发明肽P5和P6分别在经IGF-1[10-8M]或胰岛素[10-6M]刺激的MCF-7细胞中缩短S期，肽Penetratin[10-5M]如所期望的那样未显示出任何作用。

    表2表示浓度各为5×10-5M的本发明肽P5和P6在经10％FCS刺激的SAOS-2细胞中导致G1期的延长和S期的缩短。

    总之，基于图1-15和表1和2，可确证在特殊的细胞培养条件下，本发明的肽P3,P5,P6,P7s或P8单独和/或联合具有在相当程度上延迟细胞循环的连续，因而可延迟MCF-7乳腺癌细胞，SAOS-2骨肉瘤细胞或白血病细胞(K562,CCRF-CEM_敏感细胞，CCRF-CEM/ACT400_抗性)之细胞分裂的特性。所示的针对IGF-1[10-8M]的数据也适用于胰岛素[10-6M]。

    结果，这些肽具有也可成为有效的抗肿瘤剂的潜力，所述抗肿瘤剂可在人体内抵抗癌症的生长。

    现通过下列实施例阐明本发明：

    实施例

    实验设置包括含完整成视网膜细胞瘤蛋白质的乳腺癌细胞系MCF-7的实验，和含缺损的成视网膜细胞瘤蛋白质的骨肉瘤细胞系SAOS-2的实验。以100000(=十万)个细胞/孔/ml的密度将细胞接种于12孔培养板中的含10％FCS的RPMI培养基或DMEM培养基中，并使细胞贴壁24小时，随后，通过在不含FCS的DMEM中温育3天使细胞饥饿，以使它们在G0/G1期同步，然后分别加入10％FCS或10-8M IGF-1或10-6M胰岛素达24小时以刺激细胞。检测所加入的每种肽对上述每种刺激模式的效应，所述效应反映了细胞分裂的速率。在饥饿3天后0时固定对照细胞(在G0/G1期同步的细胞)，24小时后固定其余的细胞(+/-肽)。随后通过FACS分析细胞的细胞循环分布，类似方法见于R.Fahraeus等，Current Biology,1996,vol.6,no.1,p84-91和L.Zhu等，基固和发育(Genes & Development),1993,vol.7,p1111-1125。

    第二种实验设置涉及白血病细胞系K562和CCRF-CEM和CCRF-CEM/ACT400。在6孔培养板中将100000个不同步生长的细胞/孔/mlRPMI/10％FCS各与每种肽一起温育48小时，48小时温育之后，根据台盼蓝方法(L.D.Attardi等，EMBO J.,1996,vol.15,no.14,p3693-3701和M.K.Reeder & H.C.Isom，细胞生长&分化，1996,vol.7,p449-460)测定死细胞/200计数细胞的读出数目。死细胞越多，肽更具细胞毒性，因而肽更有效。

    实施例的结果示于图1-15和表1和2。

                        表1

       对照    IGF-1    P5+IGF-1    P6+IGF-1    Penetratin+IGF-1G1:    70.2    47.3       54.0        53.7           50.5S:     17.7    45.4       32.4        27.7           39.3G2/M   12.1    7.3        13.6        18.6           10.1

           对照    胰岛素     P6+胰岛素     Penetratin+胰岛素G1:        70.2     38.3        48.7                39.6S:         17.7     52.8        36.6                49.6G2/M:      12.1     8.9         14.6                10.9

                        表2

       对照    FCS      P5+FCS       P6+FCS    Penetratin+FCSG1:    79.6    63.1       73.5         76.6        62.3S:     12.0    32.5       13.2         12.2        29.9G2/M   8.4     4.4        13.3         11.2        7.8