一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法.pdf

本发明涉及一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，由兔场健壮肉兔粪样中的复合微生物直接发酵而得，能够与宿主肠道的菌群结构相契合，满足了宿主对益生菌的特异性要求，更加有效地维护宿主的肠道健康，其中的双歧杆菌、乳酸菌等有益菌含量超过1011cfu/g，并伴随有一些不可培养的肠道未知菌，协助有益菌在肠道中的定植，达到显著的益生效果。

1.  一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采集新鲜的肉兔粪样，转移到预先制备的无菌蛋白胨水中，并置于4℃温度下保存，得到粪便悬浮液，将粪便悬浮液用蛋白胨水调整至粪样浓度为20%（w/v），均质并轻微离心除去大颗粒，得到接种粪样，备用；
（2）在蒸馏水中加入柠檬酸钠并预热至90℃，然后加入吉兰糖胶和黄原胶干粉，搅拌溶解得到聚合物溶液，然后使用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌，并冷却至43℃，在无菌条件下接种步骤（1）得到的粪样，接种后的聚合物溶液溶入疏水相中，得到油相水滴悬浮液，冷却后形成凝胶小珠，分离冲洗并在氯化钙溶液中浸透，凝胶小珠变硬，通过湿法筛分筛选出直径为1-2mm的凝胶小珠，备用；
（3）将步骤（2）得到的凝胶小珠置于发酵容器的底部，然后加入发酵培养基，控制温度为37℃，进行厌氧发酵，收集发酵液，真空冷冻干燥得到微生态制剂。

2.  如权利要求1所述的一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中新鲜的肉兔粪样为肉兔排便两小时内的粪便。

3.  如权利要求1所述的一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的聚合物溶液中柠檬酸钠浓度为0.2%（w/v），吉兰糖胶浓度为2.5%（w/v），黄原胶干粉浓度为0.25%（w/v）。

4.  如权利要求1所述的一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的疏水相为菜籽油。

5.  如权利要求1所述的一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的发酵培养基成分为：氯化钠4.5g/l，氯化钾4.5g/l，七水硫酸镁1.25g/l，二水氯化钙 0.15g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，碳酸氢钠1.5g/l，七水硫酸铁0.005g/l，半胱氨酸0.8g/l，胆汁盐0.05g/l，粘蛋白4.0g/l，吐温1.0g/l，氯高铁血红素0.01g/l，酵母膏2.5g/l，蛋白胨0.5g/l，胰蛋白胨0.5g/l，酪蛋白1.2g/l，水解乳清蛋白7.2g/l，可溶性大米淀粉6.8g/l，麦芽糊精1.2g/l和乳糖5.0g/l。

6.  如权利要求1所述的一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中凝胶小珠为发酵培养基体积的30%。

一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高与营养保健意识的增强，兔肉的高蛋白、高磷脂、高消化率、低脂肪、低胆固醇、低尿胺的“三高两低”特点越来越被人们所认识，国内外市场对兔产品的需求量逐步上升，这给养兔业的发展提供了广阔的市场和良好的前景。但是，在养殖生产过程中抗生素的滥用一度引起人们对食品安全的恐慌，因此急需一种能够替代抗生素的安全制剂作为饲料添加剂，维护肉兔的健康生长的同时保证肉质的绿色安全。从1989年Fuller提出的益生菌，到1995年Gibson和Roberfroid提出的益生元，再到新近提出的合生元，近几十年来，人们对肠道调节微生态制剂的研究，正在一步步朝着纵深化、高效多样化的方向发展。随着研究的深入，人们发现一开始通过筛选出的单菌株制备益生菌制剂调节肠道微生态平衡的效果是有限的，因为肠道微生态是一个复杂的系统，多菌混居且联系紧密，当中有许多菌是无法单独培养的，每个个体的肠道菌群结构都有特异性，同时受到遗传以及饮食与环境的影响等，同样的微生物进入不同动物体内可能产生完全相反的作用效果，因此根据不同个体的菌群特征设计出合适的复合微生态制剂显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，由兔场健壮肉兔粪样中的复合微生物直接发酵而得，能够有效满足肉兔肠道菌群的特异性，迅速在肠道中定植，达到显著的益生效果。
本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采集新鲜的肉兔粪样，转移到预先制备的无菌蛋白胨水中，并置于4℃温度下保存，得到粪便悬浮液，将粪便悬浮液用蛋白胨水调整至粪样浓度为20%（w/v），均质并轻微离心除去大颗粒，得到接种粪样，备用；所述新鲜的肉兔粪样为肉兔排便两小时内的粪便。
（2）在蒸馏水中加入柠檬酸钠并预热至90℃，然后加入吉兰糖胶和黄原胶干粉，搅拌溶解得到聚合物溶液，聚合物溶液中柠檬酸钠浓度为0.2%（w/v），吉兰糖胶浓度为2.5%（w/v），黄原胶干粉浓度为0.25%（w/v），然后使用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌（121℃，15min），并冷却至43℃，在无菌条件下接种步骤（1）得到的粪样，接种后的聚合物溶液溶入疏水相（商业菜籽油）中，得到油相水滴悬浮液，冷却后形成凝胶小珠，分离冲洗并在氯化钙溶液中浸透，凝胶小珠变硬，通过湿法筛分筛选出直径为1-2mm的凝胶小珠，备用；
（3）将步骤（2）得到的凝胶小珠置于发酵容器的底部，然后加入发酵培养基（凝胶小珠为发酵培养基体积的30%），控制温度为37℃，进行厌氧发酵，收集发酵液，真空冷冻干燥得到微生态制剂。
所述发酵培养基成分为：氯化钠4.5g/l，氯化钾4.5g/l，七水硫酸镁1.25g/l，二水氯化钙 0.15g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，碳酸氢钠1.5g/l，七水硫酸铁0.005g/l，半胱氨酸0.8g/l，胆汁盐0.05g/l，粘蛋白4.0g/l，吐温1.0g/l，氯高铁血红素0.01g/l，酵母膏2.5g/l，蛋白胨0.5g/l，胰蛋白胨0.5g/l，酪蛋白1.2g/l，水解乳清蛋白7.2g/l，可溶性大米淀粉6.8g/l，麦芽糊精1.2g/l和乳糖5.0g/l。
本发明微生态制剂的使用方法为：每公斤饲料添加3-6mg的微生态制剂，同时还可以在饲料中添加1mg的菊粉，有助于提高益生菌的生存能力。
有益效果
（1）本发明制得的微生态制剂源于同品种兔的肠道菌群，能够与宿主肠道的菌群结构相契合，满足了宿主对益生菌的特异性要求，更加有效地维护宿主的肠道健康，其中的双歧杆菌、乳酸菌等有益菌含量超过10¹¹cfu/g，并伴随有一些不可培养的肠道未知菌，协助有益菌在肠道中的定植。
（2）本发明在厌氧发酵时采用肠道模拟发酵培养基，培养基组成与宿主的肠道内容物相似，在富集有益菌生长的同时能够有效抑制有害菌的生长，获得的发酵液菌体含量高，且成分稳定。
具体实施方式
    一种与肉兔肠道菌群结构同源的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）采集新鲜的肉兔粪样，转移到预先制备的无菌蛋白胨水（pH=7，浓度0.1%）中，并置于4℃温度下保存，得到粪便悬浮液，将粪便悬浮液用蛋白胨水调整至粪样浓度为20%（w/v），均质并轻微离心（700转/分钟）除去大颗粒，得到接种粪样，备用；所述新鲜的肉兔粪样为肉兔排便两小时内的粪便。
（2）在蒸馏水中加入柠檬酸钠（终浓度0.2%，w/v）并预热至90℃，然后加入吉兰糖胶（终浓度2.5%，w/v）和黄原胶干粉（终浓度0.25%，w/v），搅拌溶解得到聚合物溶液，然后使用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌（121℃，15min），并冷却至43℃，在无菌条件下接种步骤（1）得到的粪样，接种后的聚合物溶液溶入疏水相（商业菜籽油）中，得到油相水滴悬浮液，冷却后形成凝胶小珠，分离冲洗并在氯化钙溶液中浸透，凝胶小珠变硬，通过湿法筛分筛选出直径为1-2mm的凝胶小珠，备用；
（3）将步骤（2）得到的凝胶小珠置于发酵容器的底部，然后加入发酵培养基（凝胶小珠为发酵培养基体积的30%），控制温度为37℃，进行厌氧发酵，收集发酵液，真空冷冻干燥得到微生态制剂。
    所述发酵培养基成分为：氯化钠4.5g/l，氯化钾4.5g/l，七水硫酸镁1.25g/l，二水氯化钙 0.15g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，碳酸氢钠1.5g/l，七水硫酸铁0.005g/l，半胱氨酸0.8g/l，胆汁盐0.05g/l，粘蛋白4.0g/l，吐温1.0g/l，氯高铁血红素0.01g/l，酵母膏2.5g/l，蛋白胨0.5g/l，胰蛋白胨0.5g/l，酪蛋白1.2g/l，水解乳清蛋白7.2g/l，可溶性大米淀粉6.8g/l，麦芽糊精1.2g/l和乳糖5.0g/l。
平板菌落鉴定和计数：分别取发酵前的粪样和发酵后的成熟发酵液涂平板计数，用Beerens培养基计双歧杆菌数，MRS培养基计乳酸菌数，麦康凯培养基计肠杆菌，EC培养基计肠球菌。
 ERIC-PCR分析：经前处理后的样品10000 r/min离心3min，收集沉淀，用CTAB法提取基因组，稀释为20ng/μl，-20℃保存，可用作PCR反应的模板。ERIC-PCR引物序列ERIC1 3’-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5’，ERIC2 5’-AAGTAAGTACT GGGGTGAGCG-3’，反应体系为，25μl的PCR反应液中，DNA模版用量约为80ng。
结果分析：复合微生态制剂主要菌群培养基鉴定结果如下表。并且微生态制剂的ERIC-PCR指纹图谱分析也显示双歧杆菌和乳酸菌所对应的条带范围明显增多，与菌落分析情况相一致。

家兔饲喂实验
    取45日龄体重1.030±0.056kg的花巨兔60只，分为三组，分别为A组（空白对照组，正常饲喂饲料）、B组（饲料中添加发酵培养基）和C组（饲料中添加复合微生态制剂冻干粉），每组20只肉兔，连续饲喂42天，每天记录家兔体重变化和饲料消耗量，收集饲喂前后各组粪便，做菌群结构分析，所得结果如下表所示，饲喂微生态制剂后肉兔的饲料转化率显著提高。