一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及微生物来源杀虫剂，具体的说是一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用。所述缩酚酸肽类化合物如式（一）所示。本发明所涉及的缩酚酸肽类化合物由白僵菌（Beauveria felina AS-70）（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号：CGMCC NO.6643）经发酵培养、提取分离而获得，其化学结构经核磁共振和质谱等技术鉴定，具有较好杀虫活性。

1.  一种缩酚酸肽类化合物，其特征在于：缩酚酸肽类化合物如式(一)所示，


2.  一种权利要求1所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：
1）将白僵菌（Beauveria felina AS-70）（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号：CGMCC6643）接种于真菌固体培养基中静置发酵，经有机溶剂提取，获得提取物，待用；
2）将上述提取物进行硅胶柱层析，依次以石油醚–乙酸乙酯及氯仿–甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3）将上述步骤2）中氯仿–甲醇体积比20–10:1梯度的洗脱组分，依次进行反相硅胶柱层析、凝胶柱层析与制备高效液相色谱分离纯化，收集保留时间t_R值为10.8–14.8min的组分，即得式(一)所示缩酚酸肽类化合物。

3.  按权利要求2所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤3）收集保留时间t_R值为12.8min的组分，即得式(一)所示缩酚酸肽类化合物。

4.  按权利要求2所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）将白僵菌（Beauveria felina AS-70）接种于真菌固体培养基中发酵培养35-40天，经乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、水中的一种或几种作为有机溶剂进行提取，获得提取物。

5.  按权利要求2所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）真菌固体培养基为大米培养基。

6.  按权利要求2所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中石油醚–乙酸乙酯洗脱梯度为20:1至1:1，氯仿–甲醇洗脱梯度为40:1至1:1。

7.  按权利要求2所述的缩酚酸肽类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的甲醇–水；凝胶柱层析洗脱液为丙酮；制备高效液相色谱条件为体积比9:11的乙腈–水，流速为16mL/min，检测波长为210nm。

8.  一种权利要求1所述的缩酚酸肽类化合物的应用，其特征在于：所述式(一)所示缩酚酸肽类化合物可用于制备农用杀虫剂。

一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物来源杀虫剂，具体的说是一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用。 
背景技术
随着化学农药的大量使用，植物病虫害对其抗药性也越来越明显，随之也带来了环境污染与人畜中毒等问题。近年来，因化学农药残留而导致的“绿色壁垒”严重制约着我国农产品的出口，传统农业产业也面临着更大的风险与挑战。而与传统的化学合成农药相比，微生物源农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性及易于规模化生产等优点。所以微生物源农药的开发与应用对人类健康、环境保护和农业的可持续发展具有重要意义。 
发明内容
本发明的目的是提供一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用。 
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为： 
一种缩酚酸肽类化合物，缩酚酸肽类化合物如式(一)所示， 

一种缩酚酸肽类化合物的制备方法， 
1）将白僵菌（Beauveria felina AS-70）（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，保藏日期：2012年9月29日，保藏号：CGMCC6643，分类学命名为Beauveria felina）接种于真菌固体培养基中静置发酵，经有机溶剂提取，获得提取物，待用； 
2）将上述提取物进行硅胶柱层析，依次以石油醚–乙酸乙酯及氯仿–甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测； 
3）将上述步骤2）中氯仿–甲醇体积比20–10:1梯度的洗脱组分，依次进行反相硅胶柱层析、凝胶柱层析与制备高效液相色谱分离纯化，收集保留时间t_R值为10.8–14.8min的组分，即得式(一)所示缩酚酸肽类化合 物； 
所述步骤3）收集保留时间t_R值为12.8min的组分，即得式(一)所示缩酚酸肽类化合物。 
所述步骤1）将白僵菌（Beauveria felina AS-70）接种于真菌固体培养基中发酵培养35-40天，经乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、水中的一种或几种作为有机溶剂进行提取，获得提取物， 
所述步骤1）真菌固体培养基为大米培养基。 
所述步骤2）中石油醚–乙酸乙酯洗脱梯度为20:1至1:1，氯仿–甲醇洗脱梯度为40:1至1:1。 
所述步骤3）中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的甲醇–水；凝胶柱层析洗脱液为丙酮；制备高效液相色谱条件为体积比9:11的乙腈–水，流速为16mL/min，检测波长为210nm。 
一种缩酚酸肽类化合物的应用，所述式(一)所示缩酚酸肽类化合物可用于制备农用杀虫剂。 
本发明所具有的优点： 
1）本发明所涉及的缩酚酸肽类化合物具有较好杀虫活性，对卤虫LD₅₀值为26.6μM。 
2）本发明所涉及的缩酚酸肽类化合物可以作为具有杀虫作用的新农药成分或先导化合物。 
3）本发明所涉及的缩酚酸肽类化合物可以利用微生物进行规模发酵，具有生产工艺简单，周期短、产品成本低等特点。 
具体实施方式
为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。 
实施例1：缩酚酸肽类化合物如式（一）所示（结构式中的阿拉伯数字及希腊字母是化学结构中的碳原子的标位）。 

实施例2：缩酚酸肽类化合物的发酵生产及分离纯化： 
1)发酵培养 
菌种培养：按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于琼脂－麦芽 膏培养基的白僵菌（Beauveria felina AS-70）菌种，接种于PDA平板表面，28℃培养3天，作为规模发酵培养的菌种，待用。 
切取上述PDA平板表面的菌种适量，接种至已灭菌的、盛有大米培养基的锥形瓶中，室温静置培养35天。加入乙酸乙酯灭菌，待用。 
所述大米培养基为大米100g/瓶，蛋白胨0.6g/瓶，天然海水100mL/瓶，1000mL Erlenmeyer三角瓶。 
2)化合物的分离纯化 
将上述大米培养基用乙酸乙酯超声提取3次，合并乙酸乙酯提取液，减压蒸馏得浸膏。将其进行硅胶VLC（vacuum liquid chromatography）快速柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，以体积比20:1至1:1的石油醚–乙酸乙酯（流速为150mL/min），体积比40:1至1:1氯仿–甲醇（流速为150mL/min）依次进行梯度洗脱。收集洗脱液，并经薄层层析（TLC）检测，检测时以茴香醛-浓硫酸作为显色剂，根据Rf值以及显色情况来合并相同或类似部分。收集氯仿–甲醇体积比20–10:1梯度的洗脱组分，将收集的组分进行反相硅胶柱层析，以体积比1:9至1:0的甲醇–水（流速为5mL/min）依次进行梯度洗脱，收集体积比为1:1的甲醇–水洗脱组分。该组分经凝胶柱层析，以丙酮为洗脱溶液（流速为2mL/min），最后经制备高效液相色谱分离纯化（色谱分离条件为体积比9:11的乙腈–水，流速为16mL/min，检测波长为210nm），收集保留时间t_R值为12.8min的组分，即得式（一）所示缩酚酸肽类化合物。 
式（一）所示缩酚酸肽类化合物，无色晶体;UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.45)nm;ESIMS m/z540[M+H]⁺;HRESIMS m/z540.3392[M+H]⁺(calcd for C₂₆H₄₆N₅O₇⁺,540.3392);¹H与¹³C NMR，见表1。 
表1.式（一）所示缩酚酸肽类化合物的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125MHz)谱图数据 

NMR测试所用溶剂：DMSO-d₆。 
实施例3：杀虫活性试验 
卤虫（brine shrimp）也称盐水丰年虫，分类上属于节肢动物门，甲壳纲，无甲目，盐水丰年虫科，卤虫属。卤虫作为一种杀虫剂筛选模型，国内外已经有相关报道，王再强等[农药,2011,50(4):261–263]以卤虫作为模型生物评价了14种常见杀虫剂的杀虫活性，结果表明用卤虫筛选具有杀虫活性的化合物，方法简便，且对多种不同作用机制的杀虫剂敏感；胡志钰等[海洋通报,2000,19(4):36–41]以卤虫作为指示生物，快速筛选海洋放线菌中具有杀虫活性的化合物；Blizzard T.A.等[J.Antibiot,1989,42(8):1304–1307]以卤虫快速筛选杀虫剂阿维菌素的类似物。总之，卤虫作为杀虫活性测定的模型生物具有来源广泛、操作简单、所需化合物的量少等优势，可以提高筛选效率，对新农用杀虫剂的研发具有重要意义。 
1)卤虫卵的孵化 
取卤虫卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用充气泵缓缓充气，室温孵化24h，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫继续培养24h，备用。 
2)样品溶液的制备 
待测化合物以DMSO溶解，配制为4mg/mL溶液，并依此稀释至2,1与0.5mg/mL溶液，备用。 
3)试验方法 
按照Solis改良法，取96孔细胞培养板，每孔加195μL含10-15个卤虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和各浓度样品组各设三个平行孔，空白对照组加5μL人工海水，样品组加5μL所需浓度的样品液。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。 
卤虫致死活性用校正死亡率表示，计算公式如下： 
校正死亡率＝(对照组存活率－处理组存活率)/对照组存活率×100%，并计算半数致死率LD₅₀值。 
试验结果为式（一）所示缩酚酸肽类化合物的LD₅₀值为26.6μM，具有较好杀虫活性。 
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物具有较好杀虫活性，它们可用于制备农用杀虫剂。