氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用 本发明涉及氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
由于乙型肝炎遍布全世界，全世界大约有3亿多人为乙肝病毒携带者，其中中国占1.2亿，这就是说，中国占世界乙肝病毒携带者的1/3。乙型肝炎可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发肝癌，在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，乙型肝炎的总感染率为60％，其中乙肝病毒携带率约为10％，全国以12亿人口计，约有6亿人受到过乙肝感染，在这些携带者中，有25％的人一生中发展为各种类型的肝病，全国现有慢性乙肝病人约1200万，这给人民健康和国民经济带来极大损失，因此，研究乙肝的治疗问题是全社会面临的重大课题。
目前治疗乙肝药物包括(1)对症治疗和保肝药物；(2)免疫调节剂和免疫抑制剂；(3)针对病毒复制或抑制病毒复制的药物。前两类药物对病人有辅助治疗作用，并不能从根本上治疗乙型肝炎。在第三类药物中，国外使用最多的是α-干扰素，它主要作用于病毒复制的合成酶，抑制DNA复制，可以使43％的病人HBV-DNA转阴，但该药的严重缺点是“反跳”，即在停药以后又恢复原来状态；尽管现在有基因重组干扰素，但价格仍然很贵，是一般工薪阶层所不能负担，且对于有自身免疫和肝硬化的病人不能应用。阿糖腺苷也能抑制乙肝病毒，由于它对骨髓和胃肠道有毒性作用，在国外已经淘汰。阿昔洛韦是治疗单纯疱疹、EB病毒、带状疱疹病毒感染，国内也有人用它来治疗乙肝，同样因有＂反跳＂和毒性作用，并未被医院接受，所以，寻找新的药物，事在必行。
本发明目的为氧化苦参碱在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。针对目前治疗乙肝药物上述(1)，(2)类不能从根本治疗乙肝，第(3)类药物可抑制DNA复制，可使部分病人HBV-DNA转阴，但有“反跳”现象，而且价格昂贵。为此，根据氧化苦参碱可抑制乙肝病毒复制的特性，提供用氧化苦参碱制备的治疗乙型肝炎的药物。
本发明的目的是通过下列技术方案实现地：
氧化苦参碱是从苦参和苦豆子中提取的一种白色固体，其分子式C15H24N2O2，纯度在99％以上，余量是水分。用无热源去离子的纯净蒸馏水将氧化苦参碱溶解，配制成100mg/ml的注射剂-即苦参素注射液。以往用于治疗肿瘤在化疗或放疗后引起的白血球减少，以及其它原因引起的白血球减少症，有效率达85％以上。在大量临床治疗白血球减少症过程中，苦参素注射液对乙型肝炎也有很好的治疗作用，为此，利用苦参素注射液治疗乙型肝炎，进行了大量的科学实验和临床验证工作，进一步证实氧化苦参碱是制备治疗乙型肝炎的有效药物。具体实验和临床结果分述于下：
一、动物实验：在上海市传染病院肝炎研究室进行。
1、毒性试验：以昆明种小鼠腹腔注射氧化苦参碱制备的苦参素注射液，LD50为750mg/Kg，静脉注射LD50为150mg/Kg，以北京大耳白家兔静脉注射，LD50为120mg/Kg。结果说明该药物毒性非常低，临床使用安全。
2、苦参素注射液的药理、病理、抗乙型肝炎病毒(HBV)试验：
(一)实验方法：选择十月龄不分性别但体重相近的麻鸭，随机分组，在相同条件下饲养。鸭乙型肝炎(DHB)模型是以鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染制作。
实验用苦参素注射液，即实施例1所生产的制剂，分为0.05g/Kg、0.15g/kg和0.45g/kg三个治疗组；阿昔洛韦治疗对照组，剂量为100mg/Kg；DHBV-DNA阳性对照组；DHBV-DNA阴性对照组和健康麻鸭苦参素治疗组，各组均为12只。
各组均采用腿部肌肉注射途径给药，每周3次，隔日给药，连续12周。DHBV DNA(+)和DHBV DNA(-)两个对照组肌肉注射生理盐水(1ml/kg)。以上各组麻鸭分别在给药前、给药第四周、第八周、第十二周和停药后第二周同时静脉采血，作血清DHBV DNA斑点杂交试验。在停药后第二周，各组麻鸭同时放血至死，取肝脏，置于福尔马林固定液和2.5％戊二醛固定液中保存，作鸭肝的光学显微镜和电子显微镜检查。
(二)、实验结果：
①、药理作用：静脉注射后，氧化苦参碱进入细胞内的微粒体，作用细胞代谢酶，特别是进入肝细胞的微粒体，作用于乙肝病毒，各组麻鸭血清DHBV DNA测定，如表1所示。
表1 各实验组和对照组麻鸭清血清DHBV DNA含量测定结果 用药 剂量 麻鸭 编号 采血时间 统计学 检 验 给药前 给药四周 第8周 第12周 停药两周 苦参素 注射液 0.05g/ Kg A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + ++ - + + + + - + + + + + - + + + + + - + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - P＜0.5 苦参素 注射液 0.15g/ Kg B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + + + + + + + + - + + + - + + - + + 死亡 + + P＜0.05 苦参素 注射液 0.45g/ Kg C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ + - + + + + + + + - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - - - + + + + + - + - + + + + P＜0.05用药剂量 麻鸭 编号 采血时间 统计学 检 验 给药前 给药四周 第8周 第12周 停药两周DHBV-DNA阳性对照 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + - + + + ++ + + P＞0.05DHBV-DNA阴性对照 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - P＜0.05阿昔洛韦药物对照组0.1g/Kg F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 + + + + + ++ + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + - - - - - - + + - + + - - - - - - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + P＜0.05注：表中++++相当于DHBV DNA含量为100Pg；+++为50Pg；++为25Pg ；+为10Pg，
数据经自然对数转换后作自身前后比较的方差分析，用药前后有显著性差异。
从表1可以看出，苦参素注射液三个不同剂量组麻鸭血清DHBV-DNA含量在用药前后有显著的变化，用药八周后DHBV DNA含量即有不同程度的下降；用药十二周时，DHBV DNA平均含量分别下降42.6％、61.97％和65.50％，在停药后2周分别有2，2和5只麻鸭血清DHBV DNA转为阴性，其中0.45g/kg组DNA转阴率达41.7％，显示苦参素注射液有较明显的抗病毒作用，能抑制鸭乙肝病毒DNA的复制，降低血清DHBV DNA含量。此外，在血清中HBVDBA含量在苦参素注射液停药后第2周仍能维持于停药时的水平，未见有阿昔洛韦组的停药后“反跳”现象，表明苦参素注射液有持续抗病毒复制作用，图1所示阿昔洛韦组在停药两周以后，曲线又开始上升。
②、各组麻鸭病理检查试验：
1、实验组和对照组鸭肝光镜检查结果如表2所示：
表2 实验组和对照组鸭肝光镜检查结果
从表2可以看出，DHBV DNA阳性对照组麻鸭肝组织炎性改变个体之间差别较大，以“+”变化加权法计算，平均为1.0625，炎症改变类似慢性肝炎的变化，肝组织汇管区炎症和小叶实质炎症明显，肝细胞肿胀显著，窦细胞活跃，汇管区胆管增生，有界板破坏和碎屑样坏死。DHBV DNA(-)对照组麻鸭肝组织炎性改变不大，平均加权为0.5417。阿昔洛韦组变化与DHBVDNA(-)组相似。苦参素注射液组的肝脏病理有所改善，三个剂量组的平均加权为0.6969，肝组织炎症减轻，表明苦参素注射液有较明显的改善肝脏病变作用。
2、各组电镜观察结果：见附图2，3，4，5，6，7所示，结果表明：
(1)DHBV DNA阴性组：肝细胞(1)内线粒体与内质网较丰富，糖元颗粒丰富，分散存在。肝窦内皮细胞和窦壁完好，内有枯否氏细胞。细胞间纤维(2)连接紧密。
(2)DHBV DNA阳性组：在肝小叶边缘的肝细胞完整，内有较多脂粒(3)，但靠近中央静脉处，有些肝细胞核(4)被挤向一边，胞内有大的脂滴。肝窦内枯否氏细胞作活跃的变形运动，在有的肝窦与肝细胞之间有较多增生纤维和少量坏死物质，肝细胞表面有较多微绒毛伸入狄氏腔。肝细胞间连接较松，少见紧密。
(3)阿昔洛韦对照组：多数肝细胞均较完好，与DHBV DNA阴性对照组基本相似，特别是小叶边缘肝细胞基本完好。有较多双核肝细胞，有些肝细胞的细胞器有浓缩的迹象，肝窦内有较多贮脂细胞。
(4)苦参素注射液低剂量组：绝大多数肝细胞结构类似阿昔洛韦对照组，肝细胞核居中，胞浆内线粒体和内网质较丰富，糖元颗粒也较多。在靠汇管区的肝细胞内，可见少量细胞器坏死碎片和较大的脂粒，有些肝细胞的外侧有少量增生纤维。
(5)苦参素注射液中剂量组：肝细胞核正常，胞浆内线粒体等细胞器丰富，糖元颗粒少见。有些肝细胞内有较大的脂滴，肝窦内皮细胞有坏死，枯否氏细胞内可见较多吞食的坏死细胞残体。肝细胞间连接较松，紧密连接少见。
(6)苦参素注射高剂量组：肝细胞核完好居中。多数肝细胞内有大的脂滴，细胞器较少，糖元颗粒少见。细胞间有间隙，紧密连接少见。肝窦内有坏死细胞残体，但枯否氏细胞的伪足没有吞食包。
综上所述，得出下述结论：
(1)苦参素注射液有较好的抗病毒作用，能抑制乙肝病毒DNA的复制、降低血清DHBV-DNA含量，三个试验组在用药第12周时，DHBV-DNA平均含量分别下降42.60％，61.97％和65.5％，尤以高剂量组的血清DHB-DNA转为阴性更为明显，转阴率达41.7％。
(2)血清DNA含量在苦参素注射液停药后第二周仍能维持停药时的水平，未见有其它药物所常见的停药后的反跳现象。
(3)苦参素注射液可减轻鸭肝炎症，对肝脏超微结构的病理具有改善作用，对肝细胞本身无任何毒性作用。
由此可见，苦参素治疗乙型肝炎的药理机制主要通过抑制肝炎病毒复制。
二、临床治疗：
由上海市传染病医院、南汇县传染病医院、南市区传染病医院和徐汇区医院用氧化苦参碱制备的苦参素注射液治疗慢性乙型肝炎121例，其中男病例98例，女性23例，年龄为18-60岁，按照全国第三次病毒性肝炎学术会议制订的慢性乙型肝炎诊疗标准，121例病人中慢性迁延性肝炎70例，慢性活动性肝炎51例。121例病人血清HBsAg或HBeAg或抗HBc为阳性，HBV DNA40例阳性，经肌肉注射苦参素治疗，200mg/支，每日2-4支，连续一个月为一个疗程，治疗三个疗程，分别对乙肝抗原和抗体指标，临床症状和体征和化验结果见表3，4，5。
表3 苦参素治疗前后HBVM变化乙肝指标 治疗前(+)例数 治疗后(-)例数 ％HBsAg 119 8 7抗HBs 120 1 0.8抗HBc 119 4 3抗HBclgM 52 26 50HBeAg 121 62 51抗HBe 121 19 16HBV-DNA 40 14 35
表4苦参素治疗后症状与体征改善比较症状体征 存在例数 消失例数 ％乏力 104 83 80纳差 93 79 85腹胀 55 53 96肝痛 71 60 86面色黝黑 18 7 39关节酸痛 20 14 70出血 13 10 77失眠 28 9 32肝肿大 59 23 39脾肿大 16 3 19
表5 苦参素治疗后ALT和SB变化统计
治疗恢复正常例数化验 总例数 升高例数 合计 恢复率％指标 4周 8周 12周ALT 121 120 29 38 29 96 80SB 121 40 20 12 4 39 90
从表3，4，5得出如下结果：
1.苦参素注射液有较好的抑制乙肝病毒的作用，病人血清HBeAg转阴率为51.0％，HBV-DNA转阴率为35％。
2.苦参素注射液对慢性乙型肝炎有较好的改善临床症状的作用，如乏力、纳差和肝痛，有效率为80.5-86.2％。
3、苦参素注射液对慢性乙型肝炎有较好的降酶除黄效果，ALT复常率为80％，SB复常率为90％。
三、药效对比观察：
在上海长征医院用苦参素与胸腺肽注射液进行药效对比观察，每组20例，并作肝脏穿刺病理检查，结果见表6。
表6 苦参素与胸腺肽治疗前后HBeAg及HBV-DNA比较
HBeAg HBV-DNA ALT组 别 复常
病例数 阴转例 阴转率 阴转例 阴转率 例数治疗组 20 10 (10/20)50％ 9 (9/20)45％ 18对照组 20 2 (2/20)10％ 1 (1/20)5％ 16*HBeAg阴转率治疗组对照组相比P＜0.05，有显著性差异，HBV-DNA治疗组与对照组相比P＜0.05，有显著性差异
结果证明苦参素有显著改善症状，降低ALT和清除乙肝病毒作用。
在上海市第八人民医院以苦参素与无环鸟苷注射液进行药效对比观察，结果见表7。
表7 两组治疗前后HBVM变化
治疗组(N＝20) 对照组(N＝16)指标 P值
阳性例数 转阴例数 ％ 阳性例数 转阴例数g ％HBsAg 20 0 0 16 0 0HBeAg 16 7 43.8 15 7 46.7 ＞0.05HBV-DNA 4 2 50.0 5 2 40.0 ＞0.05
结果表明，苦参素注射液和无环鸟苷都有明显抑制肝炎病毒复制和乙肝抗原转阴作用，但无环鸟苷对人体有毒害作用和反跳现象。
四、毒副作用的临床实验观察：
苦参素注射液治疗了121例，在治疗前、后均检查外周血象，血红蛋白11.5克，红血球290万-380万，白血球4500-6700立方毫米，胸透全部阴性，心电图无异常，肾功能：尿素，肌酐均在正常范围之内，尿常规未见红、白血球、蛋白质、管型。治疗期间及结束后未见发热、皮疹、恶心呕吐、腹泻等消化道症状。
本发明技术与已有的技术相比，具有如下的优点及效果：
1、本发明将氧化苦参碱用于制造治疗乙肝药物-苦参素注射液，能抑制乙型肝炎病毒，改善临床症状，效果明显，优于其它治疗乙肝药物。
2、苦参素注射液经毒性试验和临床观察，证明无毒付作用。
3、制造氧化苦参碱制剂，设备简单，制造容易，价格低廉，治疗方便。
附图说明：
图1为用药前后各组鸭血清DHBV DNA平均含量变化曲线图。
图2为DHBV DNA阴性组鸭肝电镜观察结果*6000。
图3为DHBV DNA阳性组鸭肝电镜观察结果*8000。
图4为阿昔洛韦药物对照组鸭肝电镜观察结果*6000。
图5为苦参素注射液治疗低剂量组鸭肝电镜观察结果*8000。
图6为苦参素注射液治疗中剂量组鸭肝电镜观察结果*5000。
图7为苦参素注射液治疗高剂量组鸭肝电镜观察结果*5000。
其中，1--为肝细胞；2--为连接肝细胞之间的纤维；
3--为脂肪滴；4--肝细胞核。
*为电子显微镜放大倍数。
临床典型病例：
病例1郑某男38岁，外科医师，住院号0236641，发现HBsAg阳性5年，因明显乏力和纳差而入院，检查：全身皮肤黄染，肝肋下2cm，脾肋下1cm，B超显示腹水征，肝功总胆红素97umol/L，ALT580U，HBsAG阳性；HBeAg阳性，抗HBc≥1∶100，HBV-DNA阳性，抗-HCV阳性。肝组织病理检查示：肝小叶结构不完整，部分肝细胞气球样变性，有点状及碎屑样坏死，汇管区有较多的细胞浸润及少量纤维增生，病理诊断为慢性活动性肝炎。用苦参素注射液治疗，每天4支分两次肌肉注射，三个月后复查肝功恢复正常，HBeAg阴性，抗HCV阴性，HBV-DVA阴性，恢复正常工作。
病例2周某男34岁，工人，住院号0236681，体检发现HBsAg阳性，乏力、恶心而入院。肝功：胆红素27umol/L，ALT232U，HBsAg和HBeAg阳性，HBV-DNA阳性，肝脾组织病理学检查示：肝小叶结构不完整，部分肝细胞气球样变，可见肝细胞点状及碎屑样坏死，病理诊断为慢性活动性肝炎。经苦参素注射液治疗，每天4支分两次肌肉注射，2个月后复查肝功恢复正常，HBeAg转阴性、HBV-DNA阴性，抗HBe阳性。3个月后复查，HBeAg阴性，HBV-DVA阴性。
病例3付某女37岁，本院干部，住院号229694，慢性肝炎病史4年，曾3次住院治疗，本次因明显乏力，上腹胀10月，皮肤黄染而入院，肝功检查：总胆红素40umol/L，ALT200U。经苦参素注射液治疗，每天4支分两次肌肉注射，1个月后症状消失，2个月后肝功恢复正常，HBeAg及HBV-DNA均转阴性，抗HBe阳性。3个月后复查疗效巩固。
实施例1：苦参素注射液
取含量为99％以上白色固体氧化苦参碱20克，加入180ml用反渗透去离子法生产的无热源注射用纯净蒸馏水，于容器中搅拌，将固体氧化苦参碱完全溶解。测定含量：取2ml溶液于三角瓶中，加入蒸馏水15ml，碘化钠12g振摇溶解，加茜素红指示剂2滴，用0.05ml/L硫酸溶液滴定至黄色，每ml硫酸相当于26.44mg氧化苦参碱，计算氧化苦参碱含量，在原液中再加入适量注射用纯净蒸馏水，使氧化苦参碱溶液含量在9.8-10.8％。
把上述氧化苦参碱溶液置于无菌室中除菌，再将溶液置于安瓿罐装机中，灌装于2ml的安瓿中，制出含量为0.2g/2ml的苦参素注射液。
实施例2：复方苦参素注射液
取含量为99％以上白色固体氧化苦参碱14克，白色含量为99％以上固体苦参碱6克置于溶器中，加入180ml用反渗透去离子法生产的无热源注射用纯净蒸馏水，搅拌使固体完全溶解。
测定含量：取2ml上述溶液于三角瓶中，加入15ml蒸馏水后，再加入8gNaI溶解，加茜磺酸钠指示剂2滴，用0.05ml/L硫酸溶液滴定至黄色，每毫升硫酸相当于26.44mg的有效成份，计算有效成份含量，在原药液中再加入适量注射用纯净蒸馏水，使有效成份含量在10.2-11.0％。
把上述溶液置于无菌室中灭菌，再将溶液置于安瓿灌装机中，灌装于2ml的安瓿中，制成含量为0.2g/2ml的复方苦参素注射液。