MIR1792基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用.pdf

本发明涉及一种生物技术领域的miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用；所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，神经细胞的数量会相应提升，进而促进神经细胞的增殖；提高miR-17-92基因簇的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进神经再生。本发明涉及的miR-17-92能够有效促进体内神经干细胞扩增，为利用神经干细胞进行神经再生提供了有力的工具；本发明为干细胞替代治疗策略提供一个崭新的调节靶点，推动神经干细胞在未来的临床应用。

1.  一种miR-17-92基因簇在制备促进神经细胞增殖药物中的应用。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一种或多种：miR-17，miR-19，miR-92，miR-106。

3.  如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-17的序列为caaagugcuuacagugcaggua。

4.  如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-19的序列为ugugcaaaucuaugcaaaacuga。

5.  如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-92的序列为agguugggauuugucgcaaugcu。

6.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经细胞为神经干细胞或神经祖细胞。

7.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，成体神经细胞的数量会相应提升，进而促进神经细胞的增殖。

8.  一种miR-17-92基因簇在制备促进神经再生药物中的应用。

9.  如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一种或多种：miR-17，miR-19，miR-92，miR-106。

10.  如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进神经再生。

miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用。
背景技术
现代社会人类受到各种各样的中枢神经系统疾病困扰，比如阿尔茨海默病、帕金森病、中风、创伤等等。神经干细胞替代策略为治疗多种中枢神经系统疾病提供了一个崭新的、具有乐观前景的方向。替代策略的其中一种方式，是移植外源性的神经干细胞。移植以后神经干细胞可以迁移到病灶处，分化为多种细胞，包括神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞，以替换疾病过程中死亡的细胞。
虽然干细胞移植的治疗方法有非常好的应用潜力，但在临床应用之前还有很多问题凾待解决。比如移植的神经干细胞在宿主体内的存活情况不容乐观；研究显示在创伤模型中，移植3个月以后只有0.47％的神经干细胞得以存活。另外存在的一个问题是，移植的神经干细胞在体内的分化方向需要调整和控制，如果任其自然分化，只有很小一部分神经干细胞会最终成为神经元和寡突胶质细胞，而更多的神经干细胞分化成为星形胶质细胞。星形胶质细胞不仅没有修复神经环路的贡献，在一些神经损伤中还可能参与到胶质疤痕的形成过程，妨碍损伤的恢复。因此，替代策略的另外一种方式是动员内源性的神经干细胞参与神经系统的修复。
在人类和啮齿类动物的成年大脑中，存在着神经干细胞(neural stem cells,NSCs)。在成年大脑中，神经干细胞至少有两个来源：一个来自于室管膜边缘的室管膜下区(subventricular zone,SVZ)，另一个来自于海马区齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒下层区(subgranular zone,SGZ)(图.1A-C)。在SGZ中，成体神经干细胞，又称为1型细胞，缓慢分裂并呈静态状。它们通常表达诸如胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经巢蛋白(Nestin)等成体神经干细胞标记物。当静态神经干细胞开始增殖，他们会分化产生过渡期扩增“神经祖细胞(neural progenitor)”。这类祖细胞表达类似胚胎神经干细胞标记物，例如Sox2。随后，成体神 经祖细胞分化成神经元细胞，表达双皮质素(Doublecortin,Dcx)和神经元特异核蛋白(NeuN)。
由于成年海马区的延续性神经发生与个体的认知功能相关联，例如学习和记忆能力(learning and memory),利用成体神经干细胞对神经系统疾病进行治疗，前景十分光明。然而，如何维持稳定的成体神经干细胞扩增和神经发生，以及调控成体神经干细胞分裂的分子机理依然不明晰。
微型RNA(microRNA，miRNA)的发现，使人们得以从基因调控的水平，用新的角度研究大脑发育和成熟的机制。miRNA是一类由22个核苷酸组成的内源性非编码小RNA。通过RNAase III—Dicer的酶切作用，miRNA前体被加工为成熟miRNAs。成熟miRNA能够识别他的靶标信使RNA(messenger RNA,mRNA)，并结合到靶标信使RNA的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)。从而降低该mRNA稳定性，或阻断mRNA的翻译。
申请人研究发现，miRNA对海马区的形态发育和正常功能发挥重要作用。在不同发育时段阻断miRNA的生成，会影响海马区神经祖细胞分裂并引起细胞凋亡。在成年小鼠大脑中敲除Dicer(也就是阻断了miRNA的生成)，可导致神经退化症状及减小的海马区。这些研究表明，和蛋白质编码基因一样，miRNA介导的转录后调控在海马区发育和功能中的机制，已成为一个新的研究热点；哪些特异的miRNAs在海马区发育中起着关键性作用依然不清楚。
miRNA基因簇(cluster)miR-17-92是一个高度保守的基因簇，编码多个miRNA。现有技术中，研究显示miR-17-92基因簇多与心肺等发育有一定的关系，尚未见有关于该基因簇与成体神经系统作用的相关的研究。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用。本申请的发明人研究成体海马区神经发生分子机制，重点阐明非编码miRNA在海马成体神经干细胞扩增和分化中的功能；申请人筛选了在成年小鼠大脑海马区高表达的miRNAs并发现了miRNA基因簇(cluster)miR-17-92；申请人进一步发现miR-17-92在成年大脑中的功能，是促进成体神经干细胞的增殖和分裂，显然，miR-17-92是一种促进神经再生的新基因，具有非常大的应用潜力。
本发明是通过以下的技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种miR-17-92基因簇在制备促进神经细胞增殖药物中的应用。
优选地，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一种或多种：miR-17，miR-19，miR-92，miR-106。
优选地，所述miR-17的序列为caaagugcuuacagugcaggua(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述miR-19的序列为ugugcaaaucuaugcaaaacuga(SEQ ID NO.2)。
优选地，所述miR-92的序列为agguugggauuugucgcaaugcu(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述神经细胞为神经干细胞或神经祖细胞。
优选地，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，神经细胞的数量会相应提升，进而促进成体神经细胞的增殖。
第二方面，本发明还涉及一种miR-17-92基因簇在制备促进神经再生药物中的应用。
优选地，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一种或多种：miR-17，miR-19，miR-92，miR-106。
优选地，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进成体神经再生。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明涉及的miR-17-92基因(此基因家族包含的主要基因RNA序列为：miR-17,caaagugcuuacagugcagguag；miR-19,ugugcaaaucuaugcaaaacuga；miR-92,agguugggauuugucgcaaugcu)，能够促进神经再生的新基因，对相关领域的基础研究和进一步的临床应用具有现实意义；在正常生理条件下，新生神经元是有限的，一旦发生损伤，神经元发生将大幅度增加，积极参与到修复过程中。动员内源性的神经干细胞不需要进行手术，可以规避手术带来的创伤风险。但与外源细胞移植不同，如何诱导这些细胞迁移到需要它们的病灶部位是一个难题。同时，要诱导出机体需要的特异的神经元类型也是一个挑战。本申请的发明人证实，miR-17-92能够有效促进体内神经干细胞扩增的新基因，为利用神经干细胞进行神经再生提供了有力的工具。从临床应用的角度，由于miRNA是小分子，极易体外合成和导入细胞内，操纵体内miRNA表达量具有非常高的可行性，进而高效地利用miRNA改变基因在神经干细胞中的表达，诱导神经干细胞分化成特异的细胞，为干细胞替代治疗策略提供一个崭新的调节靶点，推动神经干细胞在未来的临床应用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为成年鼠大脑中的神经干细胞(NSCs)示意图；图中，(A)成年鼠大脑两个冠状切片(1,2)。(B)室管膜下区(SVZ)和(C)海马区的齿状回颗粒下层区(SGZ)中存在神经干细胞；
图2为原位杂交结果图；图中，miR-17，miR-106，miR-19在小鼠成体大脑海马区齿状回(DG)呈现高表达量；
图3为BrdU+成体神经干细胞、神经祖细胞的增殖结果图；图中，敲除miR-17-92造成小鼠大脑海马区齿状回中成体神经发生显著减少。(A-D)与对照组(Ctrl)相比，miR-17-92条件敲除小鼠(miR-17-92KO)的BrdU+和PH3+成体神经干细胞、神经祖细胞显著降低。(E)miR-17-92条件敲除小鼠Dcx+新生神经元数量也显著降低(n>3,**:p<0.03)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施例1
为筛选在小鼠成年海马区高表达的miRNAs，申请人采用了微阵列(microarray)分析，并测定了miR-17-92的高表达。申请人提取了12周龄成年C57/BL6小鼠的海马区RNA，与事先标记了miR-17、miR-19、miR-92探针的芯片进行了吸附杂交，并测定了相对荧光强度。结果显示：相当于其他微型RNA，miR-17、miR-19、miR-92呈现了很强的荧光，标示miR-17-92在成年海马区的高表达。
为确定miR-17-92在成年海马区表达形式，申请人采用原位杂交法(in situ hybridization)检测miR-17-92在第12周龄成年小鼠大脑中的表达状态。申请人收取了12周龄成年C57/BL6小鼠的大脑组织，用4％的多聚甲醛(PFA)固定后，进行冷冻切片，收集了成年海马区组织切片。利用锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)做探针，申请人标记了miR-17，miR-106，miR-19探针。这些探针与海马区组织切片进行杂交。经过洗脱非特异性信号后，显色指示出miR-17，miR-106，miR-19的表达状况。申请人发现 miR-17-92基因簇中的miR-17，miR-106，miR-19在成体大脑海马区齿状回(dentate gyrus,DG)表达量很高(图2)。由于成体神经干细胞分布在齿状回，结果表明miR-17-92可能调控海马区的成体神经发生。
实施例2
为研究miR-17-92对成年海马区神经发生的作用，申请人繁育miR-17-92条件性敲除小鼠(knockout，KO)。在Nestin-CreER^tm小鼠和floxed的miR-17-92转基因小鼠交配后，只有在注射他莫昔芬(Tamoxifen)条件下，才能诱导Cre活性，以敲除miR-17-92在成年大脑海马区的表达。这个条件性敲除小鼠，称作miR-17-92KO(图.3)。
在小鼠第五周龄时，对其连续5天注射了Tamoxifen。在小鼠第九周龄时，连续六天给小鼠注射了BrdU(50mg/kg体重)，然后取脑。
分析BrdU+成体神经干细胞、神经祖细胞的增殖。与对照组相比，miR-17-92敲除鼠(KO)海马区齿状回中BrdU阳性细胞数量显著降低(图.3A,B)。有丝分裂M期的标记物磷酸化组蛋白(PH3)阳性细胞也显著降低(图.3C,D)。新生神经元的标志物双皮质素(Dcx)阳性细胞也减少(图.3E)。所以，敲除miR-17-92表达引起成体神经干细胞数量减少，并对海马区齿状回的成体神经发生造成降低。这些结果显示了miR-17-92基因的两个重要功能：1)当miR-17-92在成年大脑中的表达量减少时，成体神经干细胞、神经祖细胞的数量也相应降低。这说明miR-17-92基因的用途是促进成体神经干细胞的扩增；2)申请人还发现，降低miR-17-92基因的表达量，导致新生神经元数量的减少。这说明miR-17-92基因的另一个用途是增进新生神经元的产生，对神经再生起促进作用。
本领域技术人员知晓以下技术术语：成体神经干细胞：在成年大脑中依然有分裂扩增能力并生成新神经元和其他细胞的干细胞。神经再生：通过神经干细胞生成新的神经元的生物过程。神经退化性疾病：神经系统中因神经元凋亡而导致的疾病，症状表现为记忆力和运动协调能力的丧失。微型RNA：不编码蛋白质但在体内存在的小RNA。
综上所述，本发明涉及的miR-17-92基因，能够促进神经再生的新基因，对相关领域的基础研究和进一步的临床应用具有现实意义；在正常生理条件下，新生神经元是有限的，一旦发生损伤，神经元发生将大幅度增加，积极参与到修复过程中。动员内源性的神经干细胞不需要进行手术，可以规避手术带来的创伤风险。但与外源细胞移植不同，如何诱导这些细胞迁移到需要它们的病灶部位是一个难题。同时，要诱导出机体需要的特异的神经元类型也是一个挑战。本申请的发明人证实，miR-17-92能够有效促进 体内神经干细胞扩增的新基因，为利用神经干细胞进行神经再生提供了有力的工具。从临床应用的角度，由于miRNA是小分子，极易体外合成和导入细胞内，操纵体内miRNA表达量具有非常高的可行性，进而高效地利用miRNA改变基因在神经干细胞中的表达，诱导神经干细胞分化成特异的细胞，为干细胞替代治疗策略提供一个崭新的调节靶点，推动神经干细胞在未来的临床应用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。