一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用.pdf

本发明提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用，采用PCR克隆技术从玉米高活性的Mu品系中获得Mu转座子的相关片段，以双元质粒载体pCAMBIA1300为骨架，分别构建新型高效的双元质粒载体pMuE和pMuDR，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代中筛选出无选择标记基因的转基因植株。本发明能够提高转基因的转化效率，该载体系统的获得将为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体，尤其可为玉米、水稻等重要粮食作物的无标记基因转化提供可靠、有效的工具，具有重要的理论意义和应用价值。

1.  一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，包括如下步骤：
步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段连接获得pAHC20(Bar^－mudrA⁺)；用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar^－mudrA⁺)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi-mudrA-Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR；
步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收Mu1完整片段，用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切，然后进行连接，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)；用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒，用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)进行单酶切，酶反应后补平粘性末端，然后两者进行连接，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部形成新的双元质粒载体pMuE；
步骤三：将质粒载体pMuDR和pMuE分别导入农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代筛选无选择标记基因的转基因植株。

2.  根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一中引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.  根据权利要求2所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Pst I限制 性内切酶位点和保护碱基，保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Pst I限制性内切酶位点为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。

4.  根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二中引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

5.  根据权利要求4所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Kpn I限制性内切酶位点和保护碱基,保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Kpn I限制性内切酶位点为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。

6.  根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤二酶反应后补平粘性末端为采用PfuDNA聚合酶补平粘性末端。

7.  根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤一和步骤二PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系5U Taq，0.2mmol/L dNTPs,1×Taq buffer,引物各10μmol/L,模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性5min,(94℃,30s；53℃，30s；72℃，45s)×30，72℃最后延伸5min。

8.  根据权利要求1所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述步骤三中从后代筛选无选择标记基因的转基因植株为根据HPT基因序列设计一对引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，采用PCR扩增对转化株进行分子检测筛选。

9.  根据权利要求8所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为94℃预变5min；94℃变性，1min；56℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；72℃终延伸10min。

10.  权利要求1至9任一项所述的玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法在粮食作物中的应用。

一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体的说涉及一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用。
背景技术
随着商业化植物转基因品种的不断出现，人们对遗传工程生物的环境安全和食品安全问题越来越重视。这些问题主要由于抗生素或除草剂抗性的选择标记基因存留于转基因植物中产生的。随着植物遗传工程的发展，已经产生了大量具有人们所期望性状的农作物。为了加快作物改良的进展，将外源目的基因导入植物体，并筛选出相对少量的转化细胞，一个有效的转化系统是极为重要的。到目前为止，被广泛用于选择的标记基因(marker gene)主要是编码抗生素或除草剂抗性的基因，一旦一个完整的转基因植株已经形成，这些选择标记基因一般说来都是多余的。目前，具有抗生素或除草剂抗性的标记基因在转基因植物中的存在已引起了人们的广泛关注。其主要原因如下：第一，用于从未转化细胞中筛选少量的已转化细胞的抗生素或除草剂，一般都会对细胞的发育和分化产生负面的影响，可能会延迟转化过程中不定芽的分化。第二，当一个转基因植物中已含有一个抗性基因作为标记基因，在导入第二个目的基因时，要选用不同的选择基因。有许多人们感兴趣的性状和基因值得被引入到植物中，但能够被实际运用的选择标记基因数量是有限的，因此人们想要对同一植物品种导入多个基因是很难的。所以，人们期望建立一个系统去除选择标记基因，以便通过重复转化来增加转基因的数量。第三，从健康及安全角度来看，选择标记基因及其产物被使用时可能是有毒的或过敏的。人们的担心是，如果抗生素类选择标记基因被应用于临床或兽医上，它们有可能被转移到微生物中，并且可能会增加在人或动物消化道内的病原微生物的数量，这将危及抗生素在临床及兽医上的应用。从环境安全方面来看，存在的问题是:(Ⅰ)带有抗生素或除草剂抗性标记基因的转基因植物可能会变成有害 的杂草；(Ⅱ)选择标记基因传播到野生亲缘种中,可能会使杂草获得这些基因而使现有的除草剂无法将杂草杀掉；(Ⅲ)选择标记基因传播到其它生物体中，可能会破坏生态系统的平衡^[3]。因此，使转基因植物释放后不带选择标记基因，对从事转基因的工作人员及消费者来说都是极为重要的。此外，尽管也有安全性评估部门报道，使用新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)作为选择标记基因不存在健康或安全方面的问题。然而，要对其它每一个选择标记基因及其产物进行安全性评价，将耗费大量物力、财力及时间，影响转基因植物投入市场，一个更为有效的办法是从宿主基因组中去除掉这些选择标记基因。
因此，获得无选择标记基因的转基因植物是消除上述潜在不利因素的关键。目前通过以下方法可以获得无选择标记的转基因植物:1)共转化法，将标记基因与目的基因分别构建到独立的双元载体中或者同一载体两个独立的T-DNA元件，因为T-DNA在导入细胞的过程中会以多个拷贝的方式导入，通过对标记基因的选择可能同时获得含有目的基因的转基因植物，通过后代的分离而获得只含有目的基因的转基因植物。然而，这个系统必须符合以下两个条件:①共转化频率要高；②共转化的DNA在受体细胞中处于不连锁状态.实际上,位于不同转化载体中的转基因共整合频率往往较低,并且常整合在受体基因组的同一位点,这就使得共转化的应用受到了限制。2)位点特异重组系统，细菌噬菌体P1重组系统Cre/loxP包含重组酶Cre和重组酶识别位点loxP两个元件，将选择标记构建到两个loxP位点之间，目的基因置于loxP位点之外，然后分别将Cre元件和loxP元件导入到同一植物之中，通过Cre重组酶将选择标记基因从目的基因边上割离，在后代中筛选只含有目的基因而不含Cre元件及标记基因的转基因植株。3)MAT载体系统，利用异戊烯基转移酶基因ipt(Isopentenyltransfer-ase)或者发根农杆菌中的rol基因作为正向选择标记，结合位点特异重组系统，在不加细胞分裂素的分化培养基中获得正常形态的不定芽，再鉴定获得无标记转基因植株。4)玉米Ac/Ds转座子系统，它是利用可移动的转座子元件Ac或Ds能从染色体的一个位点转移到另一个位点，然后在后代中通过自交分离获得不含有 标记基因的转基因植株。譬如，Ebinuma等通过将标记基因插入玉米转座子Ac中,获得了无选择标记的转基因烟草。相对于前面三种方法，利用转座子系统构建无选择标记转基因载体系统，通过遗传转化和后代分离获得无选择标记的转基因植物方法，在实验过程中操作简便，利用转座子自身具有的转座特性在遗传杂交过程中更容易分离得到无选择标记的转基因植株。然而，目前植物中发现的可利用的转座子系统尚还比较缺乏，究其原因是人们对植物基因组中存在的大量的各种不同类型的转座子系统的特点，了解得还不够全面。关于转座子系统的转座特性及其应用的研究仍有大量的工作需要开展。虽然以Ac/Ds转座子系统构建无选择标记的转基因载体系统，目前在水稻、烟草等植物中已有报道，但由于受其转座活性和频率的影响较大，后代中获得无选择标记的转基因植株较少，从而阻碍了该方法在获得无选择标记转基因植株上的应用。因此，发掘新型的高活性的转座子系统代替Ac/Ds转座子系统来构建新型的无选择标记的转基因载体系统，将有助于克服这一技术上的障碍，获得更高转座活性的载体系统，进而获得更多的无选择标记转基因植株，提高转基因的转化效率。
玉米MuDR/Mu转座子系统是一类目前植物体内发现的转座活性最高的新型植物转座子系统。Mu转座子因其拷贝数高、正向突变率高、倾向于插入到低拷贝的DNA序列等独特的遗传特性，已成为玉米基因组学研究中重要的诱变剂之一。然而，运用MuDR/Mu转座子系统来构建新型的植物无筛选标记的转基因载体系统获得无标记转基因植株的研究，目前国内外还尚未报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用，克服了现有玉米转座子系统活性不高的难题，同时能够获得更多的无选择标记转基因植株，提高转基因的转化效率，为后期大规模地转化玉米、水稻等重要粮食作物，获得安全的和无选择标记的转基因植株提供技术保障。
为了实现上述目的，本发明提供一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系 统构建方法，包括如下步骤：
步骤一：双元质粒载体pMuDR构建：以phMR53质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收mudrA基因的全长cDNA片段；用Pst I限制性内切酶对mudrA基因的全长cDNA片段酶切，然后与用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒酶切去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段连接获得pAHC20(Bar^－mudrA⁺)；用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar^－mudrA⁺)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi-mudrA-Nos片段，连接构建得双元质粒载体pMuDR；
步骤二：双元质粒载体pMuE构建：设计引物进行PCR扩增，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳、切胶后纯化回收Mu1完整片段，用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切，然后进行连接，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1⁺),；用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒，用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)进行单酶切，酶反应后补平粘性末端，然后两者进行连接，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部形成新的双元质粒载体pMuE；
步骤三：将质粒载体pMuDR和pMuE分别导入农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米鲁元92自交系，从后代筛选无选择标记基因的转基因植株。
所述步骤一中引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
所述步骤一中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Pst I限制性内切酶位点和保护碱基，保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Pst I限制性内切酶位点为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。
所述步骤二中引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
所述步骤二中引物在上游和下游引物的5’端均添加了Kpn I限制性内切酶位点和保护碱基，保护碱基为引物的5’端的第一个碱基，Kpn I限制性内切酶位点 为引物的5’端的第二至第六个碱基所在的位点。
所述步骤二酶反应后补平粘性末端为采用PfuDNA聚合酶补平粘性末端。
所述步骤一和步骤二PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系5U Taq，0.2mmol/L dNTPs,1×Taq buffer,引物各10μmol/L,模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性5min,(94℃,30s；53℃，30s；72℃，45s)×30，72℃最后延伸5min。
所述步骤三中从后代筛选无选择标记基因的转基因植株为根据HPT基因序列设计一对引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，采用PCR扩增对转化株进行分子检测筛选。所述PCR扩增的反应程序为94℃预变5min；94℃变性，1min；56℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；72℃终延伸10min。
所述玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法在粮食作物中的应用，该载体系统通过遗传转化进入植物体后，具有较高的转座活性，便于遗传后代的分离和获得较多的无选择标记的转基因植株，极大地提高了转基因的转化效率，为后期大规模地转化玉米、水稻等重要粮食作物，获得安全的和无选择标记的转基因植株提供技术保障。
有益效果：本发明利用高活性的MuDR/Mu1转座子系统代替Ac/Ds转座子系统来构建新型的无选择标记的转基因载体系统，能够获得更多的无选择标记转基因植株，提高转基因的转化效率，该载体系统的获得将为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体，尤其可为玉米、水稻等重要粮食作物的无标记基因转化提供可靠、有效的工具，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为新型高效的双元质粒载体pMuDR和pMuE线性示意图；
图2为玉米mudrA基因全长cDNA克隆测序验证图；
图3为玉米Mu1非自主转座子全长片段克隆测序验证图；
图4为玉米新型双元质粒载体pMuDR酶切验证图；
图5为玉米新型双元质粒载体pMuE酶切验证图；
图6为质粒pMuDR和pMuE(EH105)电泳验证图；
图7为玉米鲁元92自交系遗传转化图；其中A:共培养；B:潮霉素抗性筛选；C:分化出绿色组织；D：抗性小苗的形成；E:植株生根；F:移栽大棚；
图8为转化植株T₀的PCR检测图；其中M：DNA Marker DL 2000plus；Lane1：阴性对照；Lane 2：阳性对照(p1300)；Lane 3-15：T₀代转化植株；
图9为mudrA-T-DNA和Mu1-T-DNA亲本植株的Southern杂交分析图；
图10为F2植株Mu1元件转座情况PCR分析图；
图11为pMuDR双元质粒载体构建示意图；
图12为pMuE双元质粒载体构建示意图。
具体实施方式
下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
克隆玉米高活性的Mu品系中Mu转座子的相关片段
从NCBI网站Genbank数据库中搜索玉米MuDR和Mu1转座子的全长序列及其侧翼序列，根据其序列的保守区域设计引物，通过PCR克隆技术分别从玉米高活性单拷贝Mu品系叶片基因组DNA中扩增出完整的非自主性Mu转座元件序列(1754bp)和phMR53质粒中扩增出编码转座酶(MUDR)的基因mudrA的cDNA完整片段(2783bp)，克隆片段连接到pUC-T载体，通过测序验证其序列的准确性。
构建新型的双元质粒载体pMuDR和pMuE
利用pCAMBIO1300质粒载体为骨架，参照图1载体线性示意图所示，分别构建新型的双元质粒载体pMuDR和pMuE，并对载体进行酶切验证。具体构建步骤如下：
(1)双元质粒载体pMuDR构建
以phMR53质粒为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，克隆大小2783bp目的片段，该目的片段含有编码玉米MuDR自主性转座子中转座酶基因mudrA 的全长cDNA序列，并且在引物设计时分别在上游和下游引物的5’端均添加了Pst I限制性内切酶位点和保护碱基(引物中下划线标注即为Pst I限制性内切酶位点，保护碱基为引物的5’端第一个碱基)。其中，PCR扩增引物为：
上游引物1：5`-GCTGCAGAATTCATGGACTTGACGCCCAG-3`；
下游引物2：5`-CGTGCAGTCCTACATAACAGTCTTACAAC-3`；
PCR扩增反应体系为：50μl反应体系5U Taq，0.2mmol/L dNTPs,1×Taq buffer,引物各10μmol/L,模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性5min,(94℃,30s；55℃，30s；72℃，45s)×30，72℃最后延伸5min。进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶后纯化回收目前片段(如图2)。
用Pst I限制性内切酶对pAHC20质粒进行酶切，去除bar基因后回收载体片段，然后将上面纯化回收的mudrA基因的全长cDNA片段先用Pst I限制性内切酶处理，后与去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段连接，形成新的带有mudrA基因全长cDNA片段质粒载体pAHC20(Bar^－mudrA⁺)。其中，酶切和连接反应体系如下：
首先,PstⅠ酶切pAHC20质粒/mudrA基因的全长cDNA片段，产生线状的粘末端载体。酶切体系为：

30℃酶切反应过夜，用Sangon EZ-10 Spin Colume PCR Product Purification Kit纯化。
其次，将纯化回收的cDNA片段和去除Bar基因的pAHC20(Bar^－)载体片段进行连接，连接反应体系：

16℃反应30min，转化大肠杆菌DH5α，涂平板(加氨苄青霉素50ug/ml)过夜培养，挑取阳性菌斑提取质粒，该重组质粒携带mudrA基因全长cDNA片段，命名为pAHC20(Bar^－mudrA⁺)。
最后，用EcoR I和Hind III限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300和pAHC20(Bar^－mudrA⁺)两者双酶切，前者回收载体部分，后者回收Ubi-mudrA-Nos片段，连接转化后的获得新的双元质粒载体，命名为pMuDR。酶切及连接反应体系同上。
如图4所示，0.5kp片段为从pAHC20质粒上去除的bar基因片段，5.1kp片段为去除bar基因的载体片段。中间质粒pAHC20的酶切目的片段的大小约为2.8kp。双元质粒载体pMuDR通过EcoR I和Hind III限制性内切酶双酶切获得目的片段约为5.1kb。
(2)双元质粒载体pMuE构建
根据其序列的保守区域设计引物，通过PCR克隆技术分别从玉米高活性单拷贝Mu品系叶片基因组DNA中扩增出完整的非自主性Mu转座元件序列(1754bp)，并且在引物设计时分别在上游和下游引物的5’端均添加了Kpn I限制性内切酶位点和保护碱基(引物中下划线标注即为Kpn I限制性内切酶位点，保护碱基为引物的5’端第一个碱基)。其中，PCR扩增引物为：
上游引物1：5`-GGGTACC GAGATAAGTGCTATTATGGACG-3`；
下游引物2：5`-CCCATGG GAACACGAGGAGATAATTGC-3`；
PCR扩增反应体系为：50μl反应体系5U Taq，0.2mmol/L dNTPs,1×Taq buffer,引物各10μmol/L,模板5ng左右；PCR扩增的循环程序：94℃预变性5min,(94℃,30s；53℃，30s；72℃，45s)×30，72℃最后延伸5min。进行1.5％琼脂糖凝胶电泳， 切胶后纯化回收目前片段(如图3)。
用Kpn I分别对回收的Mu1完整片段进行处理和对质粒pCAMBIA1300进行单酶切反应后，进行连接反应，将Mu1转座子片段插入Kpn I位点，形成新的携带Mu1转座子的质粒载体pCAMBIA1300(Mu1⁺),通过PCR和限制性酶切验证构建后的中间载体插入了1754bp大小的Mu1片段(如图5A和B所示)。
用Hind III和EcoR I限制性内切酶对pAHC20质粒进行双酶切，回收Bar基因表达盒(Ubi-Bar-Nos片段)，再用BstE II对载体pCAMBIA1300(Mu1⁺)进行单酶切(该载体内仅有一个单一的BstE II位点5’GGTATCC3’位于Mu1转座子内部第763～769个核苷酸位点处)，两者酶切反应后均用PfuDNA聚合酶补平粘性末端，然后两者进行连接反应，将Bar基因表达盒插入Mu1转座子片段内部，形成新的双元质粒载体，命名为pMuE。酶切及连接反应体系同上。通过酶切验证获得大小约为2.8kb的片段(如图5C所示)。
冻融法将质粒pMuDR和pMuE分别导入农杆菌EH105
由于构建的新型双元质粒载体pMuDR和pMuE载体均含有HPT基因，因此利用潮霉素引物(HPT-F:5’-AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3’；HPT-R:5’-AATAGCTGCGCCGATGGTTTCTAC-3’)，以从农杆菌中提取的质粒为模板扩增出的条带大小约为547bp。如图6所示，以从农杆菌空菌株中提取的质粒模板作为阴性对照，未扩增出条带，以从转化菌株中提取的质粒分别为模板均扩增出547bp的条带，与预测大小相同，进一步证明了所构建的载体已导入农杆菌中。
遗传转化获得转基因植株
利用农杆菌介导遗传转化体系，将表达载体通过农杆菌浸染幼胚后共培养2～3d(图7A)，在10mg/L潮霉素浓度作用下通过2～3轮筛选形成抗性愈伤组织(图7B)，将状态良好的抗性愈伤组织转入分化培养基，经过约20d左右分化出绿色组织(图7C)，再经过10～20d分化出抗性小苗(图7D)2至～3cm时，转入生根培养基(图7E)。经过抗性筛选最终获得抗性芽苗12株，愈伤组织的转化率最高达2.5％。由于在后期的炼苗和移栽过程中2株死亡。将这12株(含死亡植株) 抗性植株的少量叶片保存入冰箱，统一使用改良的CTAB基因组提取法提取各植株的基因组，以备后续检测验证。利用PCR技术对转化株进行分子检测，获得转基因植株。其中，转基因植株的PCR分子检测过程如下：
用改良的CTAB法提取转基因植株的幼叶基因组DNA。根据HPT基因序列设计一对引物：HPT-F:5’-AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3’,HPT-R:5’-AATAGCTGCGCCGATGGTTTCTAC-3’。以含HPT基因的质粒DNA作为阳性对照，以非转基因株玉米基因组作为阴性对照，来鉴定HPT基因是否已转化到玉米中。PCR反应的程序为：94℃预变5min；94℃变性，1min；56℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增产物大小为547bp。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR反应体系如下：

利用Southern杂交检测外源基因拷贝数
使用CTAB法大量提取经PCR扩增初步鉴定的玉米转基因株的叶片DNA，经限制性核酸内切酶Hind III酶切后，采用DIG标记法，以HPT-F和HPT-R为引物PCR扩增的³²P标记的hpt基因片段为探针，进行Southern杂交。结果表明基因组中含有与hpt基因同源的片段，从而进一步证实了携带有Mutator转座子片段的外源T-DNA已整合至玉米基因组中。由于T-DNA在基因组中可能存在多个不同的插入位点，故从Southern杂交筛选的群体中选取含有单拷贝的转基因植株作为后续试验材料。
转基因载体系统在后续筛选获得无选择标记转基因植株过程中的应用
利用上述方法，首先从获得的转基因植株中分别挑选出含有单拷贝的MudrA的转基因植株作为父本，与含单拷贝的Mu1作为母本的转基因植株杂交得子代F1，F1自交获得F2群体。
然后，利用PCR方法分析Mu1元件的在F2群体中转座情况，并筛选出不含有hpt而仅含有bar(目的基因)的植株(HPT^-BAR⁺)。通过F1代自交产生的F2代群体分析，随机选取100株后代进行三引物(EMu1，EMu2和Mu3-1)的PCR检测，结果出现与预期一致的4种条带模式(图9)，分别为EMu⁺FMu⁺(No.8、9)，EMu⁺FMu^-(No.3、5、13、14)，EMu^-FMu⁺(No.1、2、4、10、11、12)，EMu^-FMu^-(No.7)，其中EMu是通过引物对(EMu1，EMu2)扩增出的空供体位点，扩增片段大小为500bp，代表这些植株Mu1元件发生了转座，而FMu是通过引物对(EMu1和Mu3-1)扩增出的完整供体位点，扩增片段大小为250bp，代表这些植株的Mu1元件未发生转座。经过统计，100株F2代群体植株中共计有58株F2植株(包括EMu⁺FMu⁺植株和EMu⁺FMu^-植株)中检测到有EMu片段，Mu1元件在F2代中的转座频率为58/100(58％)。这一结果明显高于先前报道的AC/DS转座子载体系统的转座频率(25％)，获得了较高的转座效果，为后续进行遗传后代的分离和获得较多的无选择标记的转基因植株，极大地提高了转基因的转化效率。
另外，该载体系统的获得将为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体，尤其可为玉米、水稻等重要粮食作物的无标记基因转化提供可靠、有效的工具，具有重要的理论意义和应用价值。
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。