能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂 本发明涉及一种采用基因重组等分子生物学技术，构建能表达有活力的苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌，进而制成口服制剂的方法。
经典型苯丙酮尿症(Phenylketonuria)是在我国及世界各国均常见的导致患儿智力低下、呆傻的遗传病。现行的治疗方法主要是，对在新生儿筛查中发现的患儿立即给予特制低苯丙氨酸(Phenylalanine，简phe)含量的奶粉，而不能吃母乳及牛奶等一切富含phe的正常食品，直至其智力发育基本正常，有的需要十几年时间。这种特殊饮食疗法不但价格昂贵，而且时间长，难以持久。有少数用苯丙氨酸脱氨酶(PhenylalanineAmmonia-lyase，简称PAL)进行试验性治疗的研究报告，但该酶不稳定，价格贵，尚无临床应用价值。另外，现行的基因治疗方法一般是设法使正常的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因在患儿肝脏表达，以替代其有缺陷的PAH基因发挥功能。该方法存在着载体选择、给药方式、长期服用安全性及伦理学上等一系列困难，尚有待解决。
本发明的目的在于利用基因工程技术，提供一种能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，该制剂进入人体小肠后，使来自食物消化的phe在其被吸收之前被PAL脱氨变成对人体无害的肉桂酸，从而能够达到与低phe饮食疗法相同的疗效，安全可靠，价格低廉，易于为患儿接受。
本发明提供的能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，通过以下方法得到：
1、从植物中抽提总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术，制备完整PAL的cDNA，并使其两端带上适当地限制性内切酶识别序列，用相应的限制性内切酶酶切该cDNA，克隆到pBluescript载体上，获得pBS PAL1(参见图2-4)；
2、将原核表达载体PET23b、pMG36e等，用适当限制性内切酶酶解，纯化出经酶切具适当末端的载体DNA片段；
3、将上述制备好的PAL cDNA片段与原核表达载体片段在T4 DNA连接酶催化下进行连接；
4、用上述连接混合物转化感受态宿主菌细胞，所说的宿主菌为人类肠道正常菌群；
5、用特异引物的PcR筛选含完整PAL cDNA的阳性克隆，并用限制性内切酶图谱鉴定其正确性；
6、用高压液相层析HPLC检测到所得的阳性克隆工程菌，PET23b-PAL、pMG36e-PAL、pMG36e-s-PAL等能将外加苯丙氨酸转化为肉桂酸，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可见到一条分子量约为70KD的蛋白产物带，即苯丙氨酸脱氨酶；
7、将上述能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌制成口服制剂。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例：
1、从受机械损伤的欧芹茎叶中抽提总RNA，用RT-PCR技术制备PAL的cDNA，用SnaBI和XbaI消化PAL cDNA，得到2.4Kb的具有XbaI粘性末端和平末端的PAL cDNA片段；用EcocRI和XbaI酶解穿梭质粒pMG36e DNA，得到具XbaI粘性末端和平末端的载体DNA；将二者重组连接。转化感受态E.Coli，得到PALcDNA插入方向正确的大肠杆菌表达株pMG36e-PAL；用PCR法及XbaI，/HindIII酶切分析均证实其正确性。如图2所示，每ml该大肠杆菌工程菌培养液(NZCYM)中加入phel.25mg，37℃保温不同时间后，用HPLC分析培养液中肉桂酸，发现其浓度逐渐增大，说明pMG36e-PAL确实能将phe脱氨而生成肉桂酸(见图1)。
用电穿孔技术(Electroporation)将重组质粒pMG36e-PAL转导进乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)及双歧杆菌(Bafitobacterium)，分别得到能表达活性PAL的乳酸杆菌工程菌pMG36e-PAL-L、乳球菌工程菌pMG36e-PAL-LC、双歧杆菌工程菌pMG36e-PAL-B，将它们送入高苯丙氨酸血症大鼠肠道，均检测到大鼠外周血中phe浓度显著下降(见图2所示)。
2、制备2.4Kb具有平末端及XbaI粘性末端的完整PALcDNA。用SacI和XbaI双酶解pMG36e质粒DNA，用DNA合成及递归PCR技术，制备长180bp，具SacI末端和平末端的含有能引导融合PAL蛋白从细菌细胞分泌到胞外的信号肽基因片段。这三种DNA在T4 DNA连接酶作用下，便重组成含完整PAL cDNA，并在pp其上游区有一编码27个氨基酸的信号肽的基因片段。这一重组表达质粒，定名pMG36e-s-PAL。将其分别转化E.Coli，乳酸杆菌等宿主菌，筛选到其在大肠杆菌的工程菌pMG36e-s-PAL-E.Coli，在乳酸杆菌中的工程菌(pMG36e-s-PAL-L)，在乳球菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-LC，在双歧杆菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-B，上述工程菌均能使phe脱氨而变成肉桂酸(见图3所示)。
3、用NdeI和Bgl II酶解PAL-cDNA，制得具NdeI和Bgl II粘性末端的PAL cDNA。用NdeI和Bgl II处理原核表达载体pET23b，将二者在T4DNA连接酶作用下连接，转化感受态E.Coli，用pCR技术和酶切图谱法鉴定阳性克隆，即工程菌pET23b-PAL。PET23b-PAL工程菌裂解液经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮兰染色，可见工程菌经IPTG诱导后出现一条长约70kd的新的蛋白产物，与PAL理论分子量一致。说明该工程菌可诱导表达PAL。后者能将phe转化为肉桂酸(见图4所示)。
本发明的优点体现在以下几方面：
1、安全，有效。用本发明基因工程菌口服制剂治疗苯丙酮尿症，外源基因及载体DNA不进入人体组织细胞内，绝无与人基因组DNA整合或激活诸如癌基因等的可能性。加之乳酸杆菌、双歧杆菌等本来就是人类肠道内有益的正常菌群，phe经PAL转化后的产物肉桂酸对人体亦无毒害。
2、提高了患儿生活质量。苯丙酮尿症患儿及孕妇在服用本制剂期间，可与常人一样正常饮食。与食用十几年特制异味低phe奶粉的治疗方法相比较，本发明易于为苯丙酮尿症患儿、孕妇及家长所接受，患儿可吃到美味食品是其极大的幸福。
3、用药方式简便易行，且可通过控制服药次数、剂量来调节肠内PAL活力，达到最佳疗效。
4、市场大，用量大，经济效益可观。苯丙酮尿症虽发病率有限(约1/1.6万)，但全世界各国、各人种均有此病发生，且每个患者用药时间长达十几年，为本发明提供了广阔的应用前景。
总之，本发明巧妙地避开了现行基因治疗所遇到的一系列难题，利用PAL这一本来与phe体内正常代谢无关的酶及人类肠道正常菌群，直接在小肠内设一小“药厂”，就地生产PAL，就地发挥药效，同时避开了现行基因工程药物的分离、纯化等后处理的难题。
本发明中的图式说明：
图1：工程菌PAL酶活性检测结果。
图2：组成性表达PAL示意图。
图3：分泌表达PAL示意图。
图4：诱导表达PAL示意图。