一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用.pdf

本发明公开了一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用，其通过枯草芽孢杆菌D9和棘孢木霉12发酵畜禽养殖污水制备得到，所述液体制剂中微生物总量＞10×108cfu ml-1，其中，有效功能微生物菌落形成单位≥0.5×107cfu ml-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×107cfu ml-1，棘孢木霉T12的含量＞0.1×106cfu ml-1，其能够有效的增加扦插组织或者移栽作物苗根圈周围生防微生物的数量，减少连作土壤中病原菌侵染植物的扦插组织或者移栽苗的几率，有效地防除连作障碍，同时能够消耗大量的养殖业污水。试验表明，芦蒿连作障碍土壤施用该产品后，发病率降低了93.8％，且每亩芦蒿连作地可消纳养殖废水5～8吨；连作西红柿土壤使用该产品后，发病率降低了87.3％，每亩西红柿种植地可消纳养殖业废水10～20吨。

1.  一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂通过枯草芽孢杆菌D9和棘孢木霉12发酵畜禽养殖污水制备得到，所述利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的液体制剂中微生物总量＞10×10⁸cfu ml^-1，其中，有效功能微生物菌落形成单位≥0.5×10⁷cfu ml^-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×10⁷cfu ml^-1，棘孢木霉T12的含量＞0.1×10⁶cfu ml^-1。

2.  根据权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌D9的菌株保藏号为CGMCC NO.9170，于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的棘孢木霉12的菌株保藏号为CCTCC NO：M2013213，于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。

3.  权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌D9接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，制得枯草芽孢杆菌D9发酵液；其中，发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度35～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～180rpm，发酵16～18h，获得枯草芽孢杆菌D9发酵液；
(2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度25～30℃，溶氧通气量范围为30～100％，150～170rpm，发酵30～36h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；
(3)将步骤(2)得到的棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5％，23～28℃，发酵5～8天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉；
(4)将畜禽养殖废水用微生物菌剂进行分解、絮凝沉淀，除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水；
(5)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的养殖废水中，枯草芽孢杆菌D9液体菌种按照2～10L/m³畜禽养殖污水、棘孢木霉T12固体菌粉按照2～10kg/m³畜禽养殖污水的比例分别添加到步骤(4) 得到的畜禽养殖污水中，将添加菌种的畜禽养殖污水转入曝气发酵槽，槽底供气，通过温室大棚或者太阳能转换器于槽底供热，确保发酵的污水温度不超过30℃；发酵5～8天，即得一种利用畜禽养殖废水生产液体制剂。

4.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所用的液体发酵培养基以体积1L计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0～7.5，于121℃灭菌20min后备用。

5.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所用的PDA培养液配制方法为：以配制1L培养基为例，用100g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000ml，pH值自然，于115℃灭菌30min后备用。

6.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所用的固体发酵基质的制备方法为：玉米芯粉∶麦麸按照质量比例为1∶1，调节含水量50～55％，于120℃灭菌30min后备用。

7.  权利要求1所述的利用畜禽养殖废水生产的液体制剂在防除作物连作障碍中的应用。

8.  根据权利要求7所述的应用，其特在于，在应用中：
对于扦插苗繁殖的作物，采用带有压辊的旋耕机翻动连作土壤，土壤翻动完毕，采用常规的打孔方法打孔后，利用小泵将一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品均匀的喷施于田面土壤的表面；采用带有喷头的水管浇灌，将田面的一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品冲入上述所打的孔中，田面稳定1～2天，扦插茎秆；
对于采用移栽苗的作物，土壤翻动粉碎，翻动土壤，在田面开一条小沟，向开沟中浇施本产品，土壤稳定1～2天后，移栽作物于田面所开的小沟中。

一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地涉及一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍中的应用。
背景技术
随着社会发展，畜禽养殖多企业化运作、集约化养殖，养殖密度高，单位养殖成本降低。但是集约化养殖造成畜禽养殖产生大量的废弃物，其中固体废弃物可以采用堆肥处理，形成固体的产品，可以长距离的运输到它处应用。但是产生的大量废水，由于周边的农田无法及时消纳，而且以肥料的形式运输到远距离的农田，运输成本太高，养殖企业和种植户运输积极性都不高，因此，大量的废水不合理的处置极容易造成环境污染。
连作障碍是指在同一块地里连续种植两茬以上同种或同科作物，连作的植物出现植株长势变弱，发病率增加，产品产量和质量均下降的现象。连作病害发病率可达100％，严重威胁相关作物的农业生产。土壤病原菌数量增加是土壤连作病害发生的主要原因之一。由于土壤的分解能力很强，土壤添加少量的杀菌剂，很难杀死土壤病原菌，如果采用高毒农药熏杀病菌，很容易威胁食品安全。利用有益的生物防治菌株抑制病原菌生长是目前为止比较有效的防控连作障碍的方法。
通过特定的方式施用生物有机肥或者具有生物农药功能的产品，让生物防治菌株能够在移栽或者扦插植物的四周形成高浓度的保护圈，有利于生物防治菌株在植物的根系或者匍匐茎上定殖，有利于抑制病原菌的侵染。
因此，发明一种既能高附加化利用畜禽养殖废水又能防控连作病害的生物制品十分必要。迄今为止，没有发现涉及本发明主题的文献报道。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂及其在防除连作障碍上的应用，该液体制剂充分的利用畜禽养殖废水，同时进行连作作物病害的防控，有效防除连作障碍对产业的危害。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提出了一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂，所述的液体制剂通过枯草芽孢杆菌D9和棘孢木霉12发酵畜禽养殖污水制备得到，该液体制剂中微生物总量＞10×10⁸cfu ml^-1，其中，有效功能微生物菌落形成单位≥0.5×10⁷cfu ml^-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×10⁷cfu ml^-1， 棘孢木霉T12的含量＞0.1×10⁶cfu ml^-1。
其中，所述的枯草芽孢杆菌D9的菌株保藏号为CGMCC NO.9170，于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的棘孢木霉12的菌株保藏号为CCTCC NO：M2013213，于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明进一步提出了上述一种利用畜禽养殖废水生产的液体制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌D9接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，制得枯草芽孢杆菌D9发酵液；其中，发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度35～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～180rpm，发酵16～18h，获得枯草芽孢杆菌D9发酵液；
(2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度25～30℃，溶氧通气量范围为30～100％，150～170rpm，发酵30～36h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；
(3)将步骤(2)得到的棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5％，23～28℃，发酵5～8天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉；
(4)将畜禽养殖废水用微生物菌剂进行分解、絮凝沉淀，除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水；
(5)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的养殖废水中，枯草芽孢杆菌D9液体菌种按照2～10L/m³畜禽养殖污水、棘孢木霉T12固体菌粉按照2～10kg/m³畜禽养殖污水的比例分别添加到步骤(4)得到的畜禽养殖污水中，将添加菌种的畜禽养殖污水转入曝气发酵槽，槽底供气，通过温室大棚或者太阳能转换器于槽底供热，确保发酵的污水温度不超过30℃；发酵5～8天，即得一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品。
具体地，步骤(1)中，所用的液体发酵培养基以体积1L计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0～7.5，于121℃灭菌 20min后备用。
步骤(2)中，所用的PDA培养液配制方法为：以配制1L培养基为例，用100g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000ml，pH值自然，于115℃灭菌30min后备用。
步骤(3)中，所用的固体发酵基质的制备方法为：玉米芯粉∶麦麸按照质量比例为1∶1，调节含水量50～55％，于120℃灭菌30min后备用。
本发明进一步提出了上述利用畜禽养殖废水生产的液体制剂在防除作物连作障碍中的应用。
具体地，在应用中：
对于扦插苗繁殖的作物，采用带有压辊的旋耕机翻动连作土壤，土壤翻动完毕，采用常规的打孔方法打孔后，利用小泵将一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品均匀的喷施于田面土壤的表面；采用带有喷头的水管浇灌，将田面的本产品冲入上述所打的孔中，田面稳定1～2天，扦插茎秆；
对于采用移栽苗的作物，土壤翻动粉碎，翻动土壤，在田面开一条小沟，向开沟中浇施本产品，土壤稳定1～2天后，移栽作物于田面所开的小沟中。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品为通过具有生物防治作用的微生物菌株发酵畜禽养殖废水得到的微生物一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品，与目前市场上的产品相比具有如下优点：
(1)本发明的一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品能够通过水的分散作用在移栽苗或者扦插苗周围10～20cm的范围内分布高密度的生防菌，能够有效的保护植物的根系免受连作土壤中病原菌侵害；
(2)部分经济作物每亩土壤能够施用本发明产品5～20吨，是百头猪养殖基地2～10天的废水排量，能够大量的消纳养殖业产生的污水；
(3)废水经过高附加值化处理之后，企业周边经济作物的种植户具有较高的积极性使用该产品，可以有效的减少养殖企业处理废水的成本，同时减少废水排放造成环境污染。
附图说明
图1不同处理连作芦蒿病害的生防效率；
图2不同处理西红柿连作20cm处土壤微生物数量；
图3不同处理连作土壤西红柿的发病率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
其中：
棘孢木霉12(Trichoderma asperellum 12)，菌株保藏号为CCTCC NO：M2013213，于2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
枯草芽孢杆菌D9(Bacillus subtilis D9)菌株保藏号为CGMCC NO.9170，于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1 用于防除作物连作障碍的液体制剂的制备。
(一)菌剂生产
(1)将枯草芽孢杆菌D9接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，制得枯草芽孢杆菌发酵液。其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度35～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～180rpm，发酵18h，获得枯草芽孢杆菌D9发酵液；其中，所用的液体发酵培养基以体积1L计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0～7.5，121℃灭菌20min后使用。
(2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度25～30℃，溶氧通气量范围为30～100％，170rpm，发酵30h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用100g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
(3)将棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5％，23～28℃，发酵5天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉；所用的固体发酵基质由玉米芯粉和麦麸按照质量比例为1∶1，调节含水量至50～55％制备得到，并于120℃灭菌30min后备用。
(二)畜禽养殖污水发酵
(1)将畜禽养殖废水用购自河海大学环境研究所的微生物菌剂(主要菌种为解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和棘孢木霉)进行分解、絮凝沉淀，以除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水；
(2)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的畜禽养殖废水(即畜禽养殖污水)中，其中，养殖污水中枯草芽孢杆菌D9液体菌添加量为2L/m³，棘孢木霉T12固体菌粉添加量为2kg/m³。在温室大棚中建发酵槽，槽宽1.2m，槽深2m，将添加菌种的养殖污水转入曝气发酵槽，槽底用直径20mm的PVC管供气，用直径30mm铁管5根铺设于发酵槽底部，通过太阳能吸热管加热水，将热能导于槽底部加热养殖污水，确保发酵污水的温度不超过30℃；发酵8天，即得到一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品，其中，产品中微生物总量＞10×10⁸cfu ml^-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×10⁷cfu ml^-1，棘孢木霉T12的含量＞0.1×10⁶cfu ml^-1。
实施例2 用于防除作物连作障碍的液体制剂的制备。
(一)菌剂生产
(1)将枯草芽孢杆菌D9接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，制得枯草芽孢杆菌发酵液。其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度35～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～180rpm，发酵16h，获得枯草芽孢杆菌D9发酵液；其中，所用的液体发酵培养基以体积1L计量，包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 3g、自来水1000ml，pH范围7.0～7.5，121℃灭菌20min后使用。
(2)将棘孢木霉12接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，得到棘孢木霉12发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5～7.2，培养温度25～30℃，溶氧通气量范围为30～100％，170rpm，发酵36h，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；所用PDA培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：用100g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加5g普通蔗糖和2g水稻秸秆粉，定容至1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
(3)将棘孢木霉12发酵液接种到固体发酵基质中，接种量为体积比5％，23～28℃，发酵8天，低温烘干，粉碎过200目筛，获得棘孢木霉12固体菌粉；所用的固体发酵基质由玉米芯粉和麦麸按照质量比例为1∶1，调节含水量至50～55％制备得到，并于120℃灭菌30min后备用。
(二)畜禽养殖污水发酵
(1)将畜禽养殖废水用购自河海大学环境研究所的微生物菌剂(主要菌种为 解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和棘孢木霉)进行分解、絮凝沉淀，以除去养殖废水中大量的固形颗粒物、蛔虫卵、部分的微生物，得到畜禽养殖污水；
(2)将枯草芽孢杆菌D9液体发酵液和棘孢木霉T12固体菌粉添加到处理后的畜禽养殖废水(即畜禽养殖污水)中，其中，养殖污水中枯草芽孢杆菌D9液体菌添加量为10L/m³，棘孢木霉T12固体菌粉添加量为10kg/m³。在温室大棚中建发酵槽，槽宽1.2m，槽深2m，将添加菌种的养殖污水转入曝气发酵槽，槽底用直径20mm的PVC管供气，用直径30mm铁管5根铺设于发酵槽底部，通过太阳能吸热管加热水，将热能导于槽底部加热养殖污水，确保发酵污水的温度不超过30℃；发酵8天，即得到一种利用畜禽养殖废水生产的防除连作障碍的产品，其中，产品中微生物总量＞10×10⁸cfu ml^-1，枯草芽孢杆菌D9的含量＞0.5×10⁷cfu ml^-1，棘孢木霉T12的含量＞0.1×10⁶cfu ml^-1。
实施例3 本发明的用于防除连作障碍的液体制剂在芦蒿连作障碍地上的应用。
试验地选址江苏南京栖霞区，土壤连续种植芦蒿5年，第4年冬春芦蒿发病率9％，第5年冬春芦蒿发病率100％。
试验设置3个处理，分别为：
(1)对照处理：常规种植；
(2)养殖废水处理：连作土壤施用养殖废水5吨/亩；
(3)本发明产品处理：连作土壤施用本发明的产品(实施例1制备的防除连作障碍的液体制剂)5吨/亩；
种植芦蒿品种为大叶蒿，采用带有压辊的旋耕机翻动连作土壤，翻动深度15cm，土壤人工打孔完毕后喷施养殖废水或者本发明产品，喷施完毕后，每亩土壤浇水5m³，将土表废水或者本发明产品冲洗入人工打的孔洞，土壤稳定48h，插苗。
插苗50天后，测定3个处理的累积的发病率，结果如图1所示，对照处理的发病率100％，废水处理和本发明产品处理都能够很好的防控连作病害，其中废水处理的防病率30.6％，本发明产品的防病率93.8％，本发明产品能够很好的防除连作障碍的发生，且每亩芦蒿连作地可消纳养殖废水5～8吨。
实施例4 本发明的用于防除连作障碍的液体制剂在西红柿连作障碍地的应用。
试验地选址江苏宿迁宿豫区，种植西红柿温室大棚土壤，上一季西红柿青枯病发病率100％，青枯病为细菌性病害，由茄科劳尔氏菌引起。
试验设置3个处理，分别为：
(1)对照处理：常规种植方法；
(2)养殖废水处理，土壤施用废水15吨/亩；
(3)本发明产品处理，土壤施用本发明产品(实施例2制备的液体制剂)15吨/亩。
西红柿大棚土壤采用旋耕机翻动，土壤翻动深度25cm，土壤整理成畦，将养殖废水或者本发明产品浇灌于即将移栽西红柿苗的土壤，分多次浇灌，确保将养殖废水或者本发明产品浇灌入土壤，土壤浇灌完毕后，稳定5～10天，移栽西红柿苗。
移栽前对土壤微生物测定显示，相较于对照处理，废水处理和本发明产品处理距离地表20cm处土壤中芽孢杆菌总量均显著上升(如图2所示)，但是废水处理木霉菌数量和对照没有显著差异。相较于对照处理，本发明处理20cm处土壤木霉菌数量增加了33倍、芽孢杆菌数量增加了181倍，因此本发明产品能够显著地增加移栽苗根圈环境的有益微生物数量。
西红柿栽种60天后，测定的累积的发病率如图3所示，对照处理发病率100％，西红柿主要受到了青枯病的危害，废水处理和本发明产品处理病害的累积发病率分别56.2％和12.7％。本发明产品能够显著地抑制西红柿连作障碍地病害的发生，对病害的防治率达87.3％，同时每亩西红柿种植地可消纳养殖业废水10～20吨。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。