本发明属于工业生物化学或生物化工(生化制药) 降钙素是比较新的多肽激素,在临床上有多种诊断和治疗用途,同时可用于航天事业上宇航员的保健方面,更可用于家禽产卵率的提高上。其在国际上被列入1979年~1982年世界上新开发的激素药物之一,我国药物发展长远规划中五个新多肽之一。
国内、外情况:在制备降钙素方面,近年国外多采用合成法,虽不受原料限制,但价格昂贵。基因工程的生产方式也正在研究,但尚未成功。故提取法仍是一个可靠的途径。与本技术相近的一些研究工作有以下几家:
Brewer(1)将猪甲状腺酸提取液经Sephadex G-25,Sephadex G-50和Bio-gel P2制备降钙素,用了三个层析柱。
Ciba-Geigy 公司(2)报道工业规模制备降钙素,经溶剂提取后也是经过三个柱:逆流分溶(实际是很多管子连成的)、Bio-gel P-6和Sephadex G-50。
以上是与本技术最为接近的、国际上比较成熟的工艺,且为工业规模的,可见其成熟程度。这些工艺与本工艺材料都用猪甲状腺。
本发明的目的在于用一个层析柱代替多个层析柱,用离子交换树脂代替其他多种不同的填充物,从而简化了工艺流程,降低成本,增进经济效益。
具体方法是以猪甲状腺为原料进行一系列提取,制成粗缺口,然后以具有专一吸附的弱碱性离子交换树脂单柱法代替Sephadex G-50 Sephadex G-25和DEAE纤维素精制纯化,获得精制品。树脂事先须用乙醇进行回流24小时,然后装柱,再经酸、碱处理后,即可上样。用PH8磷酸缓冲液洗脱,六十毫升后,就出现收集样品的高峰。
经纯度、活力检测,所达到的效果指标分别表示如下:
1.单位效价:200MRC单位/mg
2.吸收光谱分析:
收集样品后进行波长200nm-300nm的扫描,样品表现出可重复的特征性吸收高峰(278nm处)。如附图1。(使用仪器是:UV-300双光束分光光度计日本产)
3.色谱分析:
薄板层析出现可重复的单一层析点,说明纯度专一,且与标准品的Rf进行对照层析,完全一致。(Sigma产品)如附图2。
4.活力测定结果:
使用纯种大白鼠TRI,随机分组按统计学设计实验并处理数据,所得结果用直方统计图表示,如附图3。
由图3可见,钙含量随精制品地百分浓度的增加而下降,表示出降钙素的活力与对照组有显著性差异(P<0.05),符合英国药典(1980版)的规定。
降钙素的活力测定取血方法过去通用的方法是先将动物开胸,再从心脏取血,此法手续繁琐,且需事先进行麻醉等操作,故费时费力。试验动物只能一次性使用,耗资较多,不能连续观测。不适应生产中的需要。
为了改进上述的方法,我们设计采用直接由试验动物的眼角取血,无需麻醉、开胸、由心脏取血。而且试验的动物可以多次性使用,也可做多种试验,有利于科学试验和节约经费的开支。
实施例:取纯种大白鼠,随机分组后,进行处理,以便使处理组与对照组进行比较对照,从中分析出处理组的药效表现。为此,对各组分别处理后和对照组同时取血,直接由眼角静脉窦快速简捷地施行,这样试验动物间的个体条件易保持“对比齐同”的统计要求。取出血样。进行检测,及时得到所需的数据,进一步算出药物的活力,解决了一系列的问题。
参考文献
(1)Brewer:J Biol Chem 243,5739,1968.
(2)US 4,041,022
(3)李建民:科学通报 19(3):136,1974
(4)李建民:生物化学与生物物理进展 1975
(5)李建民:科学通报 26(9):576,1981
(6)李建民:全国第一次工业生化学术会议论文汇编
1983年 成都
(7)李建民:全国第三次生物化学学术会议论文汇编 下册
1984年 北京