可可茶提取物用于制备预防及改善糖尿病及其临床症状的药物及食品的应用 【技术领域】
本发明涉及天然植物提取及应用领域，尤其是涉及可可茶提取物的应用。
背景技术
糖尿病是一种因糖代謝异常引起的疾病，以缺乏胰岛素(insulin)引起的慢性高血糖为主要特征，同时伴有各种糖代謝异常引起的的临床疾患症候群。近年来的研究证明糖尿病不仅起因于遗传因素，也受环境因素的影响。一般临床上将糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病/insulin-dependent diabetesmellitus；IDDM)和胰岛素非依赖型糖尿病(II型糖尿病/non-insulin-dependentdiabetes mellitus；NIDDM)。胰岛素依赖型糖尿病也称I型糖尿病，一般认为是由病毒等原因诱发，并通过自身免疫系统作用于胰脏β细胞使之坏死或者功能停止，结果引起胰岛素合成及分泌障碍的一种疾病。实际上，临床上的I型糖尿病患者仅占糖尿病的少数。胰岛素非依赖型糖尿病，也称II型糖尿病，是一种包括遗传因素在内的胰岛素分泌异常或者作用低下导致的疾病。当然，II型糖尿病的病态也受生活习惯、肥胖、饮食过度以及运动不足等环境因素的影响。临床上，II型糖尿病在糖尿病患者中占有多数。根据流行病学调查，糖尿病作为脑卒中、心脏病的危险因素之一为人们所关注。同时由糖尿病引起的神经损伤、视网膜病变及肾脏损害等并发症影响也已成为社会生活中不可忽视的现象。近年来流行病学的调查证明，糖尿病患病人数也在逐年增加。作为生活习惯病的糖尿病，已成为人民生活中受人关注的健康问题之一。
众所周知，日常生活中的清凉饮料、果汁饮料、点心及淀粉等含有大量多糖类物质。人类在摄取这些多糖类物质后，需在消化酶(digestive enzymes)作用下将其分解成葡萄糖后才能吸收。葡萄糖被吸收后，体内血糖值即会急剧上升，被称为食后一过性血糖现象。血糖值的上升将刺激胰岛素分泌，从而促进末梢组织吸取血中葡萄糖以降低血糖值。如果经常持续出现进食后一过性血糖增高现象，或者长期维持进食后地高血糖状态，将会导致分泌胰岛素的胰脏β细胞疲惫不堪，从而使胰岛素分泌功能降低，并诱发耐糖功能的异常，导致糖尿病的进一步恶化。因此，对食后高血糖现象的有效抑制也被认为是可以减轻II型糖尿病的发病和预防其恶化的一种重要手段。对糖尿病患者而言，除接受临床治疗外，注意改变饮食习惯或采取增加运动量等促进糖代谢方法来降低血糖也是非常有效和重要的措施。当然，抑制血糖吸收也可有效减轻或改善高血糖的症状。通常，采用糖类消化酶抑制剂可以有效地抑制多糖分解为单糖，进而抑制葡萄糖的吸收。近年来，尽管acarbose、voglibose等葡萄糖苷酶(glucosidase)抑制剂已经广泛用于临床，并且与改善耐胰岛素制剂配伍应用治疗II型糖尿病显示出一定的治疗效果，但仍然远远不能满足临床医疗的需要。众所周知，为了有效地预防糖尿病及糖尿病引发的生活习惯病，人们不仅要注重对糖尿病病理生理的解析或治疗药物的研制及开发，同时也应注意改变生活方式，从根本上改善体质。从改善身体素质及生活习惯上着想，人们期待出现一种可以长期服用且安全性高，可用于改善或治疗糖尿病的健康食品或药物。当然，从预防观点考虑，能够作为日常饮料应用的糖尿病改善、治疗剂的研制为人们所期待。同时也是现在社会受人关注和急需解决的课题之一。
茶的故乡在中国南部，其根据之一是中国南部自然分布生长着茶的多种变种及野生种。可可茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种野生茶，在植物分类学上是传统茶叶(Camellia sinensis)的近缘种植物，被人们发现后又称为新种茶。根据近年的调查结果，野生可可茶主要自然分布在广东省龙门地区的狭窄范围，长期以来被当地人们通过杀青、半发酵、发酵等不同方法制成绿茶、乌龙茶及红茶等茶叶日常饮用。可可茶是一种饮用安全的日常饮料，长期以来被当地人们用作健康茶饮用，迄今为止没有发现任何副作用及不安全的现象。与传统茶叶中的甲基黄嘌呤(methyxanthine)类物质代谢途径不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆碱(theobromine)(为巧克力的原料-可可豆cacao的主要活性成分)，因此被称为可可茶(cocoa tea)。与咖啡因的化学结构不同，可可豆碱在咖啡因化学结构的1位上没有甲基取代，因而表现出与咖啡因不同的生理作用，不仅不显示咖啡因特有的中枢兴奋作用，相反显示出镇静等功能。因此，可可茶又被称作睡前可以饮用的休息茶，适用于老年、孕妇、儿童、胃肠功能低下或心脏不健康等人的饮用。
近年来，人们非常关心天然物质生理活性的研究，对茶类所具有生物功能更是特别关注。茶和咖啡、可可被并称为世界三大嗜好饮料，为世界绝大多数人所喜爱。人类饮茶已有数千年的历史。茶叶对健康的种种调节功能自古以来早以为人们所知，例如茶叶的抗氧化作用(antioxidant)、抗菌作用、对血中胆固醇的调节作用等更是令人注目。传统茶叶的提取物及所含主要活性成分多酚类(polyphenols)物质对糖的吸收抑制作用等已有报道。尽管可可茶是传统茶叶的近缘种植物，但对于可可茶的生物活性及其中主要活性成分对糖的吸收影响以及对葡萄糖苷酶的抑制活性尚无任何应用方面的探讨。
【发明内容】
本发明的发明目的在于提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶有效成分为原料，制备的安全性高、质量稳定、可供长期服用，不存在副作用的、用于减轻、改善和预防I型糖尿病、II型糖尿病或因糖尿病引起的包括高血糖、糖代谢异常及上述疾患引起的各种生活习惯病及临床症状的的药物的用途。所述的药物包括有效治疗剂量的可可茶提取物，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一发明目的在于提供以可可茶提取物及可可茶有效成分为原料，制备的可用于预防或改善高血糖症、糖代謝异常、糖尿病或因糖尿病引起的各种临床症状的、无副作用、无毒性的健康食品、食品或食品添加剂的用途。
本发明的原理是基于可可茶在小鼠糖负荷试验中对升高的血糖值显示有明显的抑制作用，并具有统计学意义。本发明以2g/kg葡萄糖或4g/kg蔗糖荷糖小鼠为动物实验模型，评价可可茶提取物对高血糖值的抑制效果。结果证明可可茶提取物对蔗糖荷糖小鼠表現出在统计学上有意义的糖吸收抑制作用。此外，本发明也确认可可茶提取物及其所含主要活性成分1，3，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA对葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的活性具有明显的抑制效果。
本发明所述的可可茶提取物是采用热水或水与甲醇、乙醇等低级醇类、丙酮等极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。
因为可可茶中的生物碱(alkaloid)及儿茶酚类(catechins)都属于小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同浓度的低级醇类、丙酮等极性溶剂或任意混合溶剂来提取。在提取时，随着醇的添加，可可茶中活性成分的回收率会有所增加。尽管用水提取效果不如用醇添加提取，但随着水温增加，以及提取时间的延长，也可以达到与醇提取法相当的结果。因此，对可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意组合都可得到本发明所述的提取物。
鉴于可可茶提取物是以药剂或饮料作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择乙醇为宜。提取时可可茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般可可茶与溶剂的比例以5∶1～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取时间从10秒到24小时范围都可以。在提取可可茶提取物时，根据需要也可以在溶剂中添加碳酸氢钠、抗坏血酸钠盐(sodium ascorbate)等物质。这些提取方法不会影响可可茶本来具有的生物活性。
本发明提供的可可茶提取物固形剂使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因为通常饮料添加浓度一般在0.1％至40％(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，可可茶提取物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加物的可可茶提取物随着加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度可可茶提取物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。
本发明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用于各种口服剂型投放市场，提供预防、改善或减轻糖尿病、高血糖症、糖代谢异常及因上述疾患引起的各种临床症状为目的的医药品、健康食品、食品或食品添加剂。当然，可可茶提取物也可以与常用的赋形剂等医药用载体结合做成制剂。必要时，还可以添加一些防腐剂、抗氧化剂、色素、甜味剂等添加物用于各种制剂。
比较适宜的可可茶赋形剂，一般考虑有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。
本发明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。可可茶提取物也可与其它饮料原料结合制成一定的饮料制品，如可可茶饮料、碳酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。可可茶提取物食品还可以考虑制成饼干、巧克力类、糖果类、口香糖类、快餐点心类、果冻点心类、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。
本发明提供的可可茶及可可茶活性成分可以用作预防、改善或治疗糖尿病、高血糖症、糖代谢异常及因上述疾患引起的各种临床症状为目的医药品、健康食品、食品或食品添加剂。其在日常生活中的应用通过下述试验得到证明。预防和改善糖尿病的作用包括降低空腹时的血糖值，对进食后血糖值急剧上升的抑制作用及耐糖能力的改善作用。其血糖值改善效果可以通过禁食一夜后的血糖值测定得以确认，也可以通过对进食后血糖值的测定及耐糖试验得以确认。本发明提供的可可茶提取物用量可以根据使用者的健康状态、年龄、性别及体重等条件进行适当调节。成年人平均体重如以60公斤计算，一般一天口服可可茶提取物可以考虑在3克至10克范围内，分次服用。当然10克以上也不存在副作用等问题。
本发明所述的可可茶提取物含有以下活性成分：
gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)。
每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg。
发明人首次从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种已知化合物：
1)gallogatechin-gallate(GCG)
2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)
3)gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)
上述三种成分在传统茶叶品种中尚无报道，可能是含量很少或很难检测出的。
通过葡萄糖苷酶(Glucosidase)抑制活性的测定实验，结果表明：可可茶活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA显示出非常强的葡萄糖苷酶抑制活性。因此，本发明确认GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA是可可茶中抑制糖的吸收、降血糖及抗糖尿病的活性成分。
实验证明，本发明所提供的可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA，通过抑制葡萄糖苷酶的活性以减少糖的分解，通过抑制摄食后引起的高血糖可以用于预防、改善及治疗I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖症、糖代谢异常以及因上述疾患引起的各种临床不良症状。当然，可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA也可以单独作为改善高血糖症、糖尿病及上述疾患引起的并发症，还可与其他糖尿病治疗药物配合用于预防或改善糖尿病恶化。
由于可可茶是天然来源的物质，民间具有长期饮用的经验，且不含有咖啡因，故不仅适用于一般成年人饮用，作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，可可茶提取物及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶用于减肥、抗高脂质症等的应用提供给消费者。
【附图说明】
图1为可可茶提取物的HPLC分析图谱。
图2为小鼠耐糖实验的结果分析图，本图所示实验的给药量为2g/kg葡萄糖；图中1为对照组，2为给药可可茶提取物250mg/kg，3为给药可可茶提取物125mg/kg。
图3为小鼠耐糖实验的结果分析图，本图所示实验的给药量为4g/kg蔗糖；图中1为对照组，2为给药可可茶提取物250mg/kg，3为给药可可茶提取物125mg/kg。
【具体实施方式】
本发明可以通过以下实施例进行详细说明，但并不仅仅局限于以下实施例。
实施例一：可可茶提取物的制备
取可可茶干燥叶100g，加入90℃热水2000ml浸提4分钟。提取液经纱布滤过后，将滤液在1000rpm、5分钟离心分离，回收上清液冷冻干燥即成。可可茶叶的上述冷冻干燥提取物用于本发明的下列实施例。
实施例二：可可茶提取物的HPLC分析
将上述可可茶提取物配制成1％水溶液后，经Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附过滤，水洗净后，用乙腈洗脱分离。随后，将250mg所得分离组分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化学制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在条件下，用5-30％乙腈按线性梯度洗脱方式(5ml/mim，180分钟，220nm紫外检测)洗脱分离。回收得到的分离组分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按线性梯度洗脱方式(6ml/mim、60分钟，280nm紫外检测)洗脱精制。结果如图1所示，从中分离得到与传统茶叶不同的三个组分。
可可茶提取物的HPLC分析条件。层析柱：资生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流动相：A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分钟)，B35％→B70％(7分钟)，B70％(5分钟)。检测：A280nm峰面积定量。PDA 220～500nm检测。
结果如图1所示，从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种在传统茶叶品种中含量很少或很难检测出的已知化合物：gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)。
左侧为EGCG的结构式 右侧为gallogatechin-gallate(GCG)的
结构式
传统茶主要含有EGCG。
1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)的结构式
gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)的结构式
实施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下：
Theobromine 278.75
EGC 43.25
(+)C 62.75
EC 14.50
EGCG 37.25
GCG 199.00
1，3，4，6-GA-glc 54.75
GC-3，5-diGA 32.50
由于用水提取、用醇提取、用其他极性溶剂提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差别，但发明人的不同实验多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg。
实施例三：小鼠耐糖实验
使用动物为7周龄雄性ICR小鼠，由日本CLEA公司购入。饲养温度23±1～2℃，湿度55±5％，换气次数12～15次/时，照明时间12小时/日(上午7点开灯，下午7点关灯)，5只/饲养笼(235×325×170H mm)，饲养条件：固形饲料CE-2(CLEA公司)，自由饮水。经1周饲养后进行试验。小鼠每组10只，禁食一夜后，按250mg/kg或125mg/kg剂量，经口给药给与可可茶提取物水溶液(10ml/10g)。对照组给与等容量蒸馏水。30分钟后再经口给药以2g/kg葡萄糖及4g/kg蔗糖水溶液。随后，每隔30分钟从尾静脉采一次血，测定血糖浓度。实验结果以student t-test做统计学处理，结果如图2和图3所示。对于给以葡萄糖的小鼠，可可茶末能显示吸收抑制作用；但对于给以蔗糖的小鼠来说，与蒸馏水对照组相比，可可茶提取物给药组对高血糖值显示出有意义的抑制效果，并呈剂量依存性关系。
实施例四：葡萄糖苷酶(Glucosidase)抑制活性的测定。
将从酵母中得到的葡萄糖苷酶(glucosidase)(14units/mg protein/ml，Sigma)溶解于含有0.2％牛白蛋白血清(bovine serum albumin)及0.02％NaN3的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中作为酶液。另将5mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside溶解于0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)作为前体溶液(substrate solution)。将可可茶提取物用20％EtOH水溶液稀释成不同浓度后，分别吸取10μl先加入50μl酶液中，在405nm处测定。随后，再加入50μl前体溶液，在室温下作用5分钟后在405nm处再次测定。将测得的结果与20％EtOH/H2O在405nm、5分钟测得的数值比较，其上升差值即为样品对葡萄糖苷酶的抑制活性。
结果如表一所示：
表一：可可茶提取物中活性成分的葡萄糖苷酶(glucosidase)抑制活性 序号样品 Glucosidase抑制活性(IC50 ug/ml) 1GCG 0.57 21，3，4，6-GA-glc0.81 3C-3，5-diGA 1.39
从表1可以看出，可可茶活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA显示出非常强的葡萄糖苷酶抑制活性。因此，本发明确认GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA是可可茶中抑制糖的吸收、降血糖及抗糖尿病的活性成分。
上述实验证明，本发明提供可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA，通过抑制葡萄糖苷酶的活性以减少糖的分解，通过抑制摄食后引起的高血糖可以用于预防、改善及治疗I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖症、糖代谢异常以及因上述疾患引起的各种临床不良症状。当然，可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA也可以单独作为改善高血糖症、糖尿病及上述疾患引起的并发症，还可与其他糖尿病治疗药物配合用于预防或改善糖尿病恶化。由于可可茶是天然来源的物质，民间具有长期饮用的经验，且不含有咖啡因，故不仅适用于一般成年人饮用，作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶用于减肥、抗高脂质症等的应用提供给消费者。