一种调节血脂的保健药物组合物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种调节血脂的保健药物组合物，尤其涉及一种调节血脂的胶囊及其制备方法。
背景技术
血脂为血液中所含脂类物质的总称。血液中的脂类主要包括甘油三酯、磷脂、胆固醇和游离脂肪酸等，它们在血液中是与不同的蛋白质结合在一起，以“脂蛋白”的形式存在。血液中脂类含量与全身脂类总量相比只占极少的一部分，但它转运于各组织之间，往往可以反映出体内脂类代谢情况。正常成人血浆脂类含量相对稳定，有一定的波动范围。血脂是人体中一种重要的物质，有许多非常重要的功能，但是不能超过一定的范围。高血脂是指血中胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，现代医学称之为血脂异常。如果血脂过多，容易造成“血稠”，在血管壁上沉积，逐渐形成小斑块(就是我们常说的“动脉粥样硬化”)这些“斑块”增多、增大，逐渐堵塞血管，使血流变慢，严重时血流被中断。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)约占血浆脂蛋白总量的40-50％。它的主要生理功能是转运体内的胆固醇。将肝脏内的胆固醇经血液转运到各个组织进行利用。它是动脉硬化的重要检测指标，LDL-C升高是动脉硬化的危险因素，协助诊断高脂蛋白血症。这种情况如果发生在心脏，就引起冠心病；发生在脑，就会出现脑中风；如果堵塞眼底血管，将导致视力下降、失明；如果发生在肾脏，就会引起肾动脉硬化，肾功能衰竭；发生在下肢，会出现肢体坏死、溃烂等。此外，高血脂可引发高血压、诱发胆结石、胰腺炎，加重肝炎、导致男性性功能障碍、老年痴呆等疾病。最新研究提示高血脂可能与癌症的发病有关。调节人体血脂含量正常，已经是一个世界范围内的课题。
红曲是一味传统药材，为红曲科红曲霉属真菌紫红曲霉Monascuspurpureus Went接种于大米上发酵而成。洛伐他丁(lovastatin)即monacolin K是红曲霉菌属代谢过程中产生的新的抗胆固醇剂，其是特异性的3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG-COA)还原酶抑制剂，抑制胆固醇的合成，其对血清胆固醇降低作用显著，并能降低甘油三酯及低密度脂蛋白的作用。同其他降血脂的药物相比，monacolin K地降脂效果好于氯贝丁酯、考来稀胺、普罗布考和烟酸等。《中草药》1999年第30卷第10期792-附2“红曲代谢产物及其药用功能”(作者代春华等)和《药学实践杂志》1999年第17卷第3期172-174“中药红曲的研究进展”(作者宋洪涛等)，对红曲的代谢产物洛伐他丁的降脂作用有清楚完整的描述。
甲壳素(几丁质)是一种天然的多糖类物质，广泛存在于虾蟹等甲壳类动物的壳中，其化学名称为聚(1，4)-2-乙酰氨基葡萄糖，难溶，不能被人体吸收利用。将甲壳素脱乙酰基得到壳聚糖(几丁聚糖)，化学名称为聚(1，4)-2-氨基葡萄糖，可溶，易于被人体吸收。从甲壳素脱乙酰基制备壳聚糖已经是很成熟的工艺。《中国海洋药物》第2000年第6期(总第78期)37-41“壳聚糖调血脂活性研究概况”(作者田得峰等)描述了壳聚糖的调节血脂作用。其能抑制高密度脂蛋白胆固醇降低、血浆胆固醇上升及肝重的增加。
原花青素(Procyanidins，PC)属于缩合单宁(Condensed tannin)，广泛存在于自然界中，如葡萄、松树皮、蓝莓、樱桃、李子、山楂、可可豆和花生等，其中葡萄籽为原花青素的最佳来源。原花青素具有极强的抗氧化活性，是一种很好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂。《中国药理学通报》2002 Feb：18(1)：9-12“原花青素的药理学研究进展”(作者凌智群等)具体揭示了原花青素的药理作用。研究发现，原花青素能降低血浆胆固醇过氧化氢脂、血清TC、血清TG和血清LDL，抑制血清HDL降低，对血脂有调节作用。
现在红曲、壳聚糖和原花青素已经用于保健药品，如：公开号为CN1383819A的专利申请公开了一种原花青素缓释微囊，该微囊壁由海藻酸钙凝聚层、壳聚糖与海藻酸盐的络合层以及壳聚糖沉积层三层物质组成，该微囊囊芯物质为原花青素或含原花青素的混合物，囊壁延缓了原花青素的释放时间，从而延迟了其代谢作用时间。该申请中，活性药物是原花青素，壳聚糖是辅剂，其作用是利用自身结构特点增强囊壁的强度，提高囊壁的稳定性。公开号为CN1398632A的专利申请公开了一种调节血脂的药物组合物，该药物由绞股蓝总甙粉、红曲霉菌粉和栀子组成。公开号为CN1318317A的专利申请公开了一种可减肥和降脂的保健食品，其含有不同分子量的壳聚糖、左旋肉碱石酸盐和食用辅料。现有产品都是以红曲、壳聚糖和原花青素中的一种为活性药物，再同其他的成分组合，得到不同的保健药物。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是，基于现有技术提出一种全新组合的调节血脂的保健药物组合物，尤其是一种调节血脂的胶囊及其制备方法。
本发明的主要构思为，本发明人利用我国中医药瑰宝结合现代科学技术，通过大量工作，从数以千、万种原料中提出了一种新的调节血脂的药物组合物。
本发明提出的调节血脂的保健药物组合物包含以下重量配比的原料成分：红曲2000-3000份，壳聚糖(脱乙酰甲壳素)1500-2000份，葡萄籽提取物150-200份；优选红曲2300-2700份，脱乙酰甲壳素1650-1800份，葡萄籽提取物170-190份；最优选红曲2590份，脱乙酰甲壳素1727份，葡萄籽提取物183份。
本发明还提出了上述药物组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a.葡萄籽除去杂质、洗净，烘干，粉碎，用乙醇提取三次；
b.合并提取液，过滤，取滤液，回收乙醇，将残留液减压浓缩至相对密度为1.12，向所得浓缩液中加入去离子水，过滤除去不溶物；
c.取上清液，用盐酸调节pH值为3-5，优选3.5，分离沉淀，取滤液；
d.向所得滤液中加入乙醇，放置12-24小时，过滤，加去离子水，浓缩至没有乙醇气味，150-250目，优选200目网过滤；
e.将所得滤液喷雾干燥，喷雾干燥器进口温度为170℃、出口温度为90℃，水分低于5％，所得物质为葡萄籽的提取物，备用；也可以将所得葡萄籽提取物进行辐照灭菌后备用；
f.依照重量配比，称取红曲2000-3000份、脱乙酰甲壳素1500-2000份和上述葡萄籽提取物150-200份，优选红曲2300-2700份、脱乙酰甲壳素1650-1800份和上述葡萄籽提取物170-190份，更优选红曲2590份、脱乙酰甲壳素1727份和葡萄籽提取物183份，将其混合均匀，可以使用本领域的常规方法制成常规的口服剂型，如胶囊、丸剂、片剂等，优选胶囊。
还可以将所得胶囊辐照灭菌，包装，入库。
其中，步骤a中，乙醇提取的温度优选79-85℃，更优选80℃；提取所用乙醇浓度优选65-75％，更优选70％；
步骤b中，回收乙醇的温度优选79-85℃，更优选80℃；所加入去离子水的体积优选为浓缩液体积的2-6倍，更优选4倍；
步骤d中，所加入乙醇浓度优选95％，其体积优选为浓缩液体积的5-7倍，更优选6倍。
本发明中，所用红曲从河北涿州东方生物有限技术公司购买，菌种名为Monascupurpureus Went，菌种号为红曲菌味A S3.991，洛伐他丁含量0.6％，其质量标准如下： 项目 指标 外观 深红色粉末状 气味 微有酸气 洛伐他丁含量， 0.6％ 水份 ≤7.0％ 灰分 ≤3.0％ 砷 ≤2ppm 铅 ≤1ppm 汞 ≤0.1ppm 铜 ≤10ppm 菌落总数 ≤1000cfu/g 大肠菌群，MPN/100 不得检出 霉菌 ≤100cfu/g 酵母 ≤25cfu/g 致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色 葡萄球菌贺溶血性链球菌) 不得检出
脱乙酰甲壳素，是从甲壳动物外壳提取出来的几丁聚糖，经水解去乙酰基形成的物质，脱乙酰度不小于90％，购自桓台县金湖甲壳制品有限公司其质量标准如下：
项目 指标 脱乙酰度 ≥90％ 颜色 淡黄色 粘度 100mps 水份 ≤8.0％ 灰分 ≤1.0％ 砷 ≤0.5ppm 铅 ≤0.3ppm 汞 ≤0.005ppm 铜 ≤30.0ppm 菌落总数 ≤1000cfu/g 大肠菌群，MPN/100 不得检出 霉菌 ≤25cfu/g 酵母 ≤25cfu/g 致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色 葡萄球菌贺溶血性链球菌) 不得检出
葡萄籽，清洁、新鲜，无霉变、虫蛀，葡萄籽提取物质量标准如下： 项目 指标 外观 红棕色粉末状 味道 涩味 原花青素含量 ≥95.0％ 酸溶性 溶解 水中不溶物 ≤5.0％ 酸中不溶物 ≤5.0％ 灰分 ≤2.0％ 水份 ≤5.0％ pH(4％溶于水) 2.5-4.5 重金属 ≤10％ 铁 ≤10％ 砷 ≤2％
乙醇是食用级，符合GB 10343-1989的规定。
红曲含有丰富的代谢产物洛伐他丁，能显著降低血清胆固醇，还能降低甘油三酯和低密度脂蛋白，有效降低血脂，红曲还具有降血压、降血氨作用；壳聚糖分子与人体具有良好的亲和性和相溶性，可以降低血液和肝脏中的胆固醇、降低血清中低密度脂蛋白浓度、提高高密度脂蛋白浓度，具有良好的调节血脂功能；葡萄籽提取物中富含原花青素，其能显著降低血浆胆固醇血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白，并增加血清高密度脂蛋白，具有明显的调节血脂作用，而且还具有抗氧化、抗衰老、抗高血压，抗动脉粥样硬化等作用。三种原料药物以合理的重量配比组合后，具有优异的调节血脂作用，对其他心血管疾病，如高血压、动脉硬化等也具有很好的预防、保健治疗作用。
服用本发明的保健药物胶囊时，每天2次，每次3粒，每粒450mg，相当于成年人每千克体重45mg(以60千克计)。服用本发明保健药物的其他口服剂型时，药量折合为原料药材与胶囊相同。
本发明的保健药物通过了经卫生部的指定的机构检验：动物安全性毒理学评价为无毒性物质，经Ames试验、微核试验和精子畸变试验证实无致突变性，稳定性、卫生学检验合格，功效成分原花青素、洛伐他丁等含量合格，动物试验证明具有调节血脂作用。
一、安全性评价
检验单位：中国医学科学院营养与食品卫生研究所
检验依据：《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193-94
检验样品为本发明的胶囊
试验动物和饲料：昆明种小鼠(二级)购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场(合格证号：SCXK11-00-0006)；SD大鼠(二级)购自北京市实验动物研究中心(合格证号SCXK11-00-0008)，饲料购自北京市实验动物研究中心。
1.急性毒性试验
大鼠急性毒性试验：按霍恩氏法。选取SD健康成年大鼠20只，雌雄各10只。平均体重雌性大鼠为191.7g(181-202)，雄性大鼠为196.3(182-208)。灌胃给受试物，剂量为10.0g/kg。，每日3次，灌胃量为1.0ml/100g。观察14天内动物中毒反应和死亡情况。
在观察期间内各组大鼠未见异常反应，生长情况良好，无死亡发生，动物终重雌雄为213.8(198-228)克，雄性为243.7(226-257)克。经查表受试物大鼠口LD50雄、雌性均大于10g/kg，根据急性毒性分级标准受试样品实际无毒。
小鼠急性毒性试验：按霍恩氏法。选取昆明种健康小鼠20只，雌雄各10只。平均体重雌性小鼠为19.4g(18.6-20.5)，雄性大鼠为19.5(18.3-20.5)。样品用蒸馏水配制成溶液，灌胃给受试物，剂量为10.0g/kg。每日2次，灌胃量为0.2ml/10g。观察14天内动物中毒反应和死亡情况。
在观察期间内各组大鼠未见异常反应，生长情况良好，无死亡发生，动物终重雌雄为30.7(28.5-33.2)克，雄性为35.1(32.9-36.7)克。经查表受试物小鼠口LD50雄、雌性均大于10g/kg，根据急性毒性分级标准受试样品实际无毒。
2.致突变试验
Ames试验：采用平板掺入法，使用该所分装的TA97、TA99、TA100和TA102四个菌株，S-9也是该所自制，经菌株五项鉴定和S-9活性测定均正常。试验剂量为每个菌株分别加入被测样品0、0.008、0.04、0.2、1.0及5.0mg/皿，将1g受试物以无菌水稀释至20ml，混匀过柱(填充物为已活化的XADII树脂)，吹干水份，以10ml丙酮洗柱2次，挥发丙酮，以DMSO溶剂溶解定容至10ml为高浓度(100μl/皿)。阳性物分别为2-AF(2-氨基芴，TA97、TA98和TA100，加S-9使用，剂量为10.0μg/皿；NPD(4-硝基-O-次苯二胺，TA97、TA98不加S-9，20.0μg/皿)；叠氮钠(TA100使用，不加S-9，1.5μg/皿)；MMC)丝裂霉素，TA102使用，不加S-9，2.5μg/皿)和1，8-二羟基蒽醌(TA102，加S-9，50μg/皿)。
受试样品Ames试验结果(-S9) 名称 剂量 菌落数(X±SD) TA97 TA98 TA100 TA102 受试组 0.008 139.0±14.2 39.3±3.1 123.7±15.0 306.3±10.1 0.04 128.3±11.0 37.0±7.8 122.0±11.5 308.3±1.5 0.2 137.7±7.6 43.0±4.6 139.0±7.5 320.7±15.0 1.0 128.3±17.6 37.0±10.8 140.7±19.8 311.7±11.2 5.0 132.3±4.7 30.7±2.5 127.0±16.5 304.0±17.5 空白对照 162.7±12.5 26.3±2.1 128.7±8.1 291.3±15.9 试剂对照 160.3±8.5 26.7±3.1 130.7±11.2 276.7±19.9 阳性对照 1729±219 1747±131 2183±159 2031±70
受试样品Ames试验结果(+S9) 名称 剂量 菌落数(X±SD) TA97 TA98 TA100 TA102 受试组 0.008 124.0±5.3 45.3±2.5 138.7±13.9 299.7±11.6 0.04 134.7±6.1 50.3±12.0 122.3±14.8 302.7±11.6 0.2 123.0±20.5 42.7±4.9 137.7±14.8 306.0±24.5 1.0 131.7±10.1 38.8±3.2 135.0±7.0 307.0±23.1 5.0 112.7±14.5 28.0±4.6 113.7±16.4 288.7±23.2 空白对照 173.7±7.2 29.0±1.0 129.3±7.6 281.0±15.9 试剂对照 162.7±22.0 27.7±3.5 136.7±12.1 282.0±8.5 阳性对照 1721±110 2966±141 1903±140 828±131
其中，各皿所示数值为三个平皿的回变菌落数均值。
在所试剂量范围(0.008-5.0mg/皿)内，各菌株未见突变菌落数的明显升高，而阳性对照皿油明显反应，表明在正常实验条件下，受试物在受试剂量范围内无致基因突变的作用。
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：选取健康昆明小鼠50只，体重为25-30g，按体重核性别随即分为5组，每组10只，雌雄各半。第1组为阴性对照组给蒸馏水；第2-4组为实验组，低、中、高剂量分别为0.56、1.67、5.0g/kg；第5组为阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg。2次灌胃给以受试物，灌胃量为0.4ml/20g，间隔24小时，第二次灌胃后6小时颈椎脱臼法处死小鼠，取胸骨骨髓涂片，吉姆萨染色并油镜镜检，每鼠计数1000个嗜多染红细胞的微核细胞数。
受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率的影响性别 剂量 (g/kg.bw) 动物数 (只) 观察细胞数 (个) 微核数 (个) 发生率 (‰) 阴性对照组a 0.56g/kg组雌 1.67g/kg组 5.0g/kg组 阳性对照组b 5 5 5 5 5 5×103 5×103 5×103 5×103 5×103 11 8 8 9 169 2.2 1.6 1.6 1.8 33.8 阴性对照组a 0.56g/kg组雌 1.67g/kg组 5.0g/kg组 阳性对照组b 5 5 5 5 5 5×103 5×103 5×103 5×103 5×103 9 7 8 9 154 1.8 1.4 1.8 1.8 30.8
注：a：示与各受试物处理组比较，泊松分布统计P＞0.05
b：示与阴性对照组和各受试物处理组比较，泊松分布统计P＜0.01
无论雌性还是雄性小鼠环磷酰胺阳性对照组微核发生率均明显高于阴性对照组和各受试处理组，而各受试样品与阴性对照组比较无显著差异，说明该受试物对小鼠体细胞染色体无致突变作用。
小鼠精子畸变试验：选取健康成年雄性昆明种小鼠25只，体重为25-30克，随即分为5组，每组5只，第1组为对照组，给蒸馏水；第2-4组为实验组，低、中、高剂量分别为0.56、1.67、5.0g/kg；第5组为阳性对照组，腹腔注射给环磷酰胺40mg/kg。各组连续给受试物5天，灌胃量0.4ml/20g，于第35天，颈椎脱臼处死小鼠取两侧腹睾，去脂肪，生理盐水剪碎，离心，1000转/分离心7分钟、去上清液，留少许混液滴于涂片、甲醇固定、1.5％伊红染色并镜检。每鼠计数1000个精子，计数各组精子畸变数及畸变率，精子畸变率以百分率表示。
受试物对小鼠精子畸变的影响剂量 动物数 (只) 观察精子数 (个) 精子畸形数 (个) 精子畸形率 (％)阴性对照组a0.56g/kg组1.67g/kg组5.0g/kg组阳性对照组b 5 5 5 5 5 5×103 5×103 5×103 5×103 5×103 123 136 133 125 291 2.46 2.72 2.66 2.50 5.82
注：a：示与各受试物处理组比较，X2检验P＞0.05
b：示与阴性对照组和各受试物处理组比较，X2检验P＜0.01
阳性组畸变发生率明显高于阴性对照组和各受试物处理组，各剂量受试物组和阴性对照组畸变率比较无显著差异，说明该受试物无致小鼠生殖细胞畸变作用。
3.大鼠30天喂养试验：选用健康、断乳SD大鼠80只，体重43-65克，动物按体重随即分为4组，每组20只，雌雄各半。第1组为对照组，第2-4组为实验组，低、中、高剂量分别为每公斤体重1.12g、2.25g和4.5g(高剂量组相对于人服最高推荐量2.7g/日的100倍)。饲料为常备饲料(单加鱼粉)，按10％进食量计算添加受试物，混匀备用。动物分笼饲养，自由进食，观察如下指标：
动物体重与食物利用率：每周记录进食量，每周称体重一次，计算食物利用率(每摄入100克饲料的体重增长克数)；
血液学检查：包括血红蛋白、红细胞计数、血小板计数、白细胞计数及其分类。尾静脉取血，于实验终期测定一次；
血液生化指标：尾静脉取血，于实验终期测定一次。取血后离心分离血清(3000转/分，15分钟)，采用北京中国生物工程高技术公司提供的试剂盒，用自动生化仪(日立公司生产7060型)进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血糖、肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、总蛋白、白蛋白的测定；
脏器系数：于实验结束处死动物前称体重，断头处死动物取肝、肾、胃及十二指肠、睾丸(或卵巢)放入10％福尔马林溶液中固定，石蜡切片，H.E染色，在光学显微镜下观察组织形态学变化。
受试物对大鼠体重的影响(mean±SD) 性 别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 始重 (g) 第一周 (g) 第二周 (g) 第三周 (g) 第四周 (g) 雄 性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 63.1±5.5 63.5±3.6 63.6±3.6 63.2±3.6 104.9±7.3 101.3±7.7 105.2±7.4 114.6±9.6 160.3±7.8 162.0±7.2 163.0±7.2 164.8±13.5 212.9±4.8 212.4±8.4 215.4±6.7 220.1±18.5 260.8±10.1 256.0±12.4 258.0±12.0 262.8±19.8 雌 性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 57.4±4.7 57.9±5.8 57.6±3.4 57.0±3.4 99.7±9.0 97.4±8.2 96.1±8.2 103.1±7.1 141.2±5.5 135.2±6.4 131.9±9.6 144.0±12.4 170.2±8.7 164.5±8.7 167.9±12.3 166.3±10.9 193.3±10.1 191.5±9.7 195.7±9.7 1903±16.8
雄、雌性各剂量组动物体重与对照组无显著差异(P＞0.05)。
受试物对大鼠总食物利用率影响(mean±SD) 性别 剂量(g/kg) 动物数 (只) 体重增量 (g) 进食量 (g) 食物利用率 ％ 统计值F P值 雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 197.7±11.8 192.5±13.6 194.4±12.5 199.6±21.1 568.4±51.0 561.8±26.6 569.6±34.3 571.6±42.4 35.1±4.5 34.3±3.1 34.3±3.7 35.3±5.8 0.1433 0.9333 雌性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 135.9±12.8 133.6±10.3 138.1±9.6 133.3±16.8 508.4±26.6 510.2±37.1 518.4±24.4 512.1±37.4 26.8±2.8 26.3±2.5 26.7±2.0 26.1±3.0 0.1611 0.9218
食物利用率单位：克/100克
受试物各剂量组雌、雄性大鼠的总增重、总进食量和食物利用率与对照组相比均无显著性差异(总增重、总进食量与对照组相比，统计量值分别为F＝0.3118，P＝0.8167；F＝0.1860，P＝0.9052；雄F＝0.4415，P＝0.7247；F＝0.1148，P＝0.9509)。
泰康牌脂清胶囊大鼠血液学检查结果(mean±SD)性别剂量(g/kg)动物数(只) 白细胞计数 (109/L) 红细胞计数 (1012/L) 血小板 (109/L) 血红蛋白 (g/L)雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 18.1±2.88 17.6±2.76 17.1±2.47 17.6±1.99 6.75±0.33 6.59±0.35 6.77±0.33 6.57±0.38 1109.9±15.5 1143.8±61.9 1113.8±40.0 1115.0±57.9 134.6±9.02 135.5±6.89 135.2±5.22 133.5±7.91雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 15.9±3.26 16.8±2.57 16.0±3.13 16.2±2.53 6.27±0.41 6.24±0.41 6.25±0.44 6.22±0.35 1133.8±35.5 1167.4±87.3 1106.0±61.0 1167.4±87.3 131.8±6.46 129.1±8.32 132.6±7.64 131.5±9.22
受试物大鼠WBC的影响(mean±SD) 性别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 淋巴 ％ 中性 ％ 嗜酸性 ％ 单核 ％雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 77.7±4.22 76.7±5.08 79.2±2.90 78.6±5.64 20.3±4.45 21.3±4.78 18.6±2.55 19.7±4.72 0.9±0.88 0.8±0.79 0.9±0.74 0.5±0.53 1.1±0.99 1.2±0.92 1.3±0.95 1.2±0.92雌性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 79.5±7.18 78.4±5.12 78.2±5.51 78.0±4.94 18.4±6.00 19.3±5.08 19.3±5.58 19.7±5.42 0.8±0.92 0.8±0.79 0.7±0.67 0.9±0.88 1.3±1.06 1.5±1.08 1.8±1.03 1.4±1.17
雌、雄各剂量组动物的血红蛋白含量、血小板数、白细胞数、白细胞分类与对照组比较均无显著差异(P＞0.05)。
受试物大鼠血清生化指标测定值(mean±SD)性别剂量(g/kg) 动物数 (只) 谷丙转氨酶 (U/L) 谷草转氨酶 (U/L) 尿素氮 (mmol/L) 肌酐 (μmol/L) 胆固醇 (mmol/L)雌性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 43.3±9.4 43.5±8.6 45.2±7.8 44.1±4.2 159.4±34.8 169.4±30.9 157.7±22.2 159.7±36.7 6.13±0.80 6.66±0.73 6.78±1.25 6.63±0.94 58.62±3.41 60.58±4.90 62.80±5.14 63.08±4.45 1.74±0.33 1.81±0.20 1.89±023 1.80±0.23雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 47.3±10.3 44.9±6.1 53.6±12.4 54.0±15.7 162.9±30.5 160.0±29.2 182.6±35.3 185.2±37.2 6.15±0.73 6.17±1.18 6.09±0.54 5.89±0.81 60.91±3.90 62.50±3.60 61.48±5.15 61.06±2.73 1.74±0.15 1.91±0.28 1.65±0.43 1.61±0.31
受试物大鼠血清生化指标测定值(mean±SD) 性别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 甘油三酯 (mmol/L) 血糖 (mmol/L) 总蛋白 (g/L) 白蛋白 (g/L) 雌性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 1.44±0.39 1.54±0.53 1.27±0.47 1.41±0.30 6.83±0.62 6.87±0.76 7.20±0.79 7.31±0.71 66.5±3.61 68.6±3.50 68.3±4.14 69.1±3.48 40.3±1.42 41.2±1.71 41.2±1.64 41.2±1.10 雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 1.78±0.48 1.58±0.72 1.67±0.74 1.82±0.91 6.66±0.72 6.42±0.39 6.60±0.53 6.80±0.56 68.4±5.41 69.9±3.79 71.6±2.50 69.1±3.29 40.6±1.53 40.6±1.35 41.2±1.29 40.0±1.25
雌、雄性各剂量组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、甘油三酯、总胆固醇、总蛋白及白蛋白与对照组相比均无显著性差异。雌鼠：血清谷丙转氨酶F＝0.1068，P＝0.9556；谷草转氨酶F＝0.2812，P＝0.8386；尿素氮F＝0.9083；P＝0.4466；肌酐F＝2.1365，P＝0.1127；总胆固醇F＝0.6234，p＝0.6045；甘油三酯F＝0.6662，P＝0.5783；血糖F＝1.0899，P＝0.3658；总蛋白F＝0.9213，P＝0.4403；白蛋白F＝0.9180，p＝0.4419。
雄鼠：血清谷丙转氨酶F＝1.5272，P＝0.2241；谷草转氨酶F＝1.5473，P＝0.2190；尿素氮F＝0.2279；P＝0.8764；肌酐F＝0.3309，P＝0.8030；总胆固醇Hc＝4.2434，P＝0.2362；甘油三酯F＝0.2226，P＝0.8800；血糖F＝0.7843，P＝0.5105；总蛋白F＝1.2330，P＝0.3119；白蛋白F＝1.2461，P＝0.3074。
受试物对大鼠脏体比的影响(mean±SD)性别 剂量 (g/kg) 动物数 (只) 肝/体 ％ 肾/体 ％ 脾/体 ％ 睾丸(卵巢)/体 ％雌性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 2.51±0.27 2.73±0.28 2.66±0.25 2.57±0.21 0.70±0.40 0.68±0.07 0.67±0.06 0.68±0.05 0.23±0.03 0.26±0.05 0.25±0.04 0.25±0.04 1.05±0.02 1.03±0.07 1.08±0.07 1.05±0.06雄性 对照 1.12 2.25 4.50 10 10 10 10 3.48±0.58 3.57±0.56 3.59±0.48 3.58±0.33 0.84±0.05 0.87±0.04 0.86±0.04 0.87±0.06 0.32±0.06 0.31±0.03 0.32±0.05 0.33±0.04 0.057±0.012 0.053±0.005 0.052±0.006 0.055±0.009
单位：脏体比：克/100克
雌、雄性各剂量组大鼠肝、肾、脾和性腺脏体比与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。
病理组织学检查：大体解剖各组大鼠各脏器未见明显异常。组织学检查大鼠肝、肾、胃及十二指肠、睾丸(或卵巢)等脏器，肾曲管上皮细胞未出现变性、坏死或炎反应；胃粘膜完整，未见上皮细胞脱落及炎反应；睾丸(或卵巢)发育无异常；肝小叶完整，未见肝细胞出现坏死等病变，部分动物肝细胞浆出现不同程度疏松和个别单核细胞灶性浸润，但与对照组相比无显著性差异。故认为未见受试物引起的毒性病理改变。
4.统计：数据经EXCEL计算均数盒标准差，经PEMS统计软件包进行方差分析，方差不齐者采用非参数分析。
5、结果：
综上所述，经大、小鼠急性毒性、致突变试验和30天喂养试验，该受试物无明显毒性。
二、保健功能评价
检验单位：中国医学科学院营养与食品卫生研究所保健食品功能检验中心
检验依据：《保健食品功能学评价程序和检验方法》
1.材料和方法
1.1检验样品为本发明的胶囊。推荐量为每人每天2次，每次3粒，每粒450mg，相当于成年人每公斤体重45mg(以60公斤计)。产品内容物为暗红色粉末。
1.2实验动物：二级SD雄性大鼠，48只，体重范围：160-200克；购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号：SCXK11-00-0008。
1.3剂量选择：
高脂饲料由中国医学科学院实验动物繁育厂提供的基础饲料加胆固醇、猪油、胆盐配制而成。其中基础饲料93.3％，胆固醇1.5％，猪油5％，胆盐0.2％。
以灌胃方式给予受试物，各组具体剂量为低剂量组225mg/kg.bw、中剂量组450mg/kg.bw、高剂量组1350mg/kg.bw、对照组给予蒸馏水，各剂量组给予受试物的剂量分别相当于人推荐量(45mg/kg.bw)的5、10、30倍。观察周期28天；每次取血前禁食12小时。
1.4主要仪器与试剂
体重秤、722光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。
主要试剂及测定方法：
血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的测定采用中生高技术生物工程公司出产的酶试剂盒，在500nm波长下比色测定。
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定采用中生高技术生物工程公司出产的酶试剂盒，经磷乌酸-镁(PTA-MG2+)沉淀后在500nm波长下比色测定。
测得吸光值后，分别根据以下公式计算样品中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度：
(式中：2-为稀释倍数)
1.5实验方法：
以基础饲料喂饲大鼠5天后，禁食，称体重，取尾血，酶法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。根据体重、TC水平将动物随机分为4组：对照组、3个受试组(225mg/kg.bw；450mg/kg.bw；1350mg/kg.bw)。自正式试验开始，各组动物换用高脂饲料，受试物用植物油配至所需浓度。以灌胃方式给予受试物，对照组分别给予蒸馏水。分别在第14，28天时称体重，取尾血测定各项血脂指标。
1.6实验数据统计：用SPSS软件进行统计分析。
2结果
2.1受试物对大鼠体重的影响
实验初期、中期、末期各组大鼠的体重(g，M±SD) 组别 动物数(只) 剂量(mg/kg.bw) 初期体重 中期体重 末期体重对照组低剂量组中剂量组高剂量组 12 12 12 12 0 225 450 1350 204.2±28.4 192.6±12.5 195.6±12.7 196.4±14.2 261.8±15.4 271.2±15.7 264.8±21.8 260.6±22.0 320.2±32.9 332.5±19.2 334.5±28.8 325.2±24.7
整个实验期间各组大鼠生长正常。各实验组大鼠体重与对照组大鼠体重无差异(P＞0.05)。
2.2受试物对血清总胆固醇(TC)浓度的影响
实验初期、中期、末期各组血清TC浓度(mmol/L，M±SD) 组别 动物数 (只) 实验初期 实验中期 实验末期 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 12 12 12 12 1.95±0.21 1.95±0.22 1.96±0.22 1.92±0.21 2.28±0.30 2.12±0.28 2.04±0.30 2.03±0.29* 2.47±0.34 2.19±0.26* 2.17±0.31* 2.16±0.34*
*与对照组相比P＜0.05
在实验末期与对照组相比，低、中、高各剂量组大鼠血清总胆固醇(TC)浓度显著降低(P＜0.05)。
2.3受试物对大鼠血清甘油三酯(TG)浓度的影响
实验初期、中期、末期各组血清TC浓度(mmol/L，M±SD) 组别 动物数(只) 实验初期 实验中期 实验末期 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 12 12 12 12 1.58±0.25 1.57±0.20 1.60±0.23 1.53±0.19 1.73±0.21 1.59±0.23 1.56±0.22 1.56±0.18 1.95±0.35 1.74±0.24 1.71±0.22* 1.70±0.28*
与对照组相比：*P＜0.05
中、高剂量组大鼠的血清甘油三酯(TG)水平与对照组相比显著降低，并有统计学上的差异(P＜0.05)。
2.4受试物对大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(用DL-C)浓度的影响
试验初期、中期、末期各组血清HDL-C浓度(mmol/L，M±SD) 组别 动物数(只) 实验初期 实验中期 实验末期 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 12 12 12 12 1.17±0.17 1.21±0.23 1.18±0.26 1.27±0.31 1.02±0.12 1.02±0.12 0.98±0.11 0.97±0.17 0.95±0.17 0.90±0.17 0.85±0.11 0.84±0.12
各个实验组大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度和对照组相比无统计学上的差异(P＞0.05)。
2.5受试物对大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇(HDL-C/TC)比值的影响
实验初期、中期、末期各组血清HDL-C/TC比值(M±SD) 组别 动物数 实验初期 实验中期 实验末期 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 12 12 12 12 0.60±0.08 0.62±0.09 0.61±0.15 0.67±0.18 0.45±0.08 0.49±0.07 0.49±0.09 0.49±0.10 0.39±0.09 0.42±0.08 0.40±0.05 0.40±0.07
高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇(HDL-C/TC)比值反映了心血管“保护因子”HDL-C在TC中的比例，各组的HDL-C/TC比值无显著性差异(P＞0.05)。
2.6受试物对大鼠血脂水平的影响
受试物对大鼠血脂水平的影响 组别 TC (％) TG (％) HDL-C (％) 低剂量组 -11.3 -10.8 -5.3 中剂量组 -12.1 -12.3 -10.5 高剂量组 -12.6 -12.8 -11.6
以225、450、1350mg/kg.bw剂量的本发明药物胶囊灌胃，在第28天后，血清TC较对照组下降百分率分别为11.3、12.1、12.6；以225、450、1350mg/kg.bw剂量的本发明药物胶囊灌胃，血清TG较对照组下降百分率分别10.8、12.3、12.8。
3.结论
本实验结果表明，与饲喂高脂饲料的对照组大鼠相比，给予低、中、高剂量的受试物可使大鼠血清总胆固醇(TC)浓度显著下降(P＜0.05)；给予中和高剂量(P＜0.05)的受试物可使大鼠血清甘油三酯(TG)浓度显著下降。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中的判定标准，可认为该检验样品有调节血脂作用。
【具体实施方式】
下面结合实施例来描述本发明的实施方式，但这些实施例并非限制本发明的实施方式。本发明具有多种不同的实施方式，并不只限于本说明书中所述内容。本领域的技术人员在不违背本申请发明精神情况下，所完成的方案应在本发明的范围内。
实施例1
a.葡萄籽除去杂质、洗净，烘干，粉碎，在温度为80℃时用70％乙醇提取三次，每次所用乙醇重量分别为葡萄籽重量的3倍、2倍和2倍，每次提取时间为1小时；
b.合并提取液，过滤，取滤液，在80℃时回收乙醇，将残留液减压浓缩至相对密度为1.12，向所得浓缩液中加入体积为其4倍的去离子水，过滤除去不溶物；
c.取上清液，用盐酸调节pH值为3.5，分离沉淀，取滤液；
d.向所得滤液中加入体积为其6倍的95％乙醇，放置20小时，过滤，加去离子水，浓缩至没有乙醇味道，200目网过滤；
e.将所得滤液喷雾干燥，喷雾干燥器进口温度为170℃、出口温度为90℃，水分低于5％，所得物质为葡萄籽的提取物；
f.将所得葡萄籽提取物进行辐照灭菌后备用；
g.称取红曲2590g、脱乙酰甲壳素1727g和葡萄籽提取物183g，将其混合均匀，按450mg/粒标准装入胶囊，共得10000粒胶囊。
实施例2
a.葡萄籽除去杂质、洗净，烘干，粉碎，在温度为83℃，68％乙醇提取三次，每次所用乙醇重量分别为葡萄籽重量的4倍、3倍和2倍，每次提取时间为1.5小时；
b.合并提取液，过滤，取滤液，在83℃时回收乙醇，将残留液减压浓缩至相对密度为1.12，向所得浓缩液中加入体积为其5倍的去离子水，过滤除去不溶物；
c.取上清液，用盐酸调节pH值为4，分离沉淀，取滤液；
d.向所得滤液中加入体积为其5倍的95％乙醇，放置14小时，过滤，加去离子水，浓缩至没有乙醇味道，200目网过滤；
e.将所得滤液喷雾干燥，喷雾干燥器进口温度为170℃、出口温度为90℃，水分低于5％，所得物质为葡萄籽的提取物，备用；
f.称取红曲2200g、脱乙酰甲壳素1900g和上述葡萄籽提取物200g，按药物粉末450mg/片的标准使用本领域的常规方法制成片剂。
实施例3
a.葡萄籽除去杂质、洗净，烘干，粉碎，在温度为79℃时用73％乙醇提取三次，每次所用乙醇重量分别为葡萄籽重量的3、2倍和2倍，每次提取时间为0.5小时；
b.合并提取液，过滤，取滤液，在79℃时回收乙醇，将残留液减压浓缩至相对密度为1.12，向所得浓缩液中加入体积为其3倍的去离子水，过滤除去不溶物；
c.取上清液，用盐酸调节pH值为4.5，分离沉淀，取滤液；
d.向所得滤液中加入体积为其7倍的95％乙醇，放置16小时，过滤，加去离子水，浓缩至没有乙醇味道，200目网过滤；
e.将所得滤液喷雾干燥，喷雾干燥器进口温度为170℃、出口温度为90℃，水分低于5％，所得物质为葡萄籽的提取物；
f.将所得葡萄籽提取物进行辐照灭菌后备用；
g.称取红曲2600g、脱乙酰甲壳素1700g和上述葡萄籽提取物170g，将其混合均匀，按药物粉末450mg/片的标准使用本领域的常规方法制成丸剂。