美洲大蠊成虫提取物的制备方法.pdf

本发明涉及美洲大蠊成虫提取物的制备方法：将乙醇提取与水提取工艺相结合，总回收率达25.2％，比单纯的醇提取法得率高出一倍多，回收产品氨基酸含量高达58.5％。所述的制备方法步骤简单、所用溶剂价廉易得、提取时间短且提取完全。小鼠急性毒性试验表明本发明制得的提取物安全无毒副作用。

1、  美洲大蠊成虫提取物的一种制备方法，其特征在于按以下工艺步骤进行：
A水提取：
(1)粗提：选取一月内美洲大蠊成虫，转移至供水但撤食的玻璃缸内饲养5-6天，待成虫吐尽内容物后-20℃冷冻30min处死，75％乙醇快速清洗虫体表面，蒸馏水淋洗两遍，凉干，剪去翅、足、触须后称取10g放入研钵中，加入10ml蒸馏水研磨30min后置-20℃冰箱中冷冻15min，如此反复3次，直到虫体被充分磨成匀浆。将匀浆移入50ml离心管中，定容至40ml，4000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，10000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，-4℃冰箱静置过夜。
(2)浓缩、醇洗：在沸水浴中加热至沸腾蒸发，待上清液浓缩至原有体积1/4时生成大量棕灰色沉淀，冷却后10000rpm离心15min，弃去上层油状物和下层沉淀，取中间上清液。加热至60℃左右，趁热加入95％乙醇(2∶1)，不断搅拌，冷却至室温后，10000rpm离心15min除去上清液，得白色沉淀物，乙醇反复沉淀三次。
(3)精制：取白色沉淀物加热溶解，加入1/10-1/8体积活性碳后不断搅拌，80℃加热30min，趁热过滤，用少量蒸馏水洗活性碳二次，合并每次洗滤液，95％乙醇重结晶。
B：醇提取：
取水提取第一步分离得到的上层油状物和下层沉淀，加入2倍体积的85％乙醇，热回流抽提1-2小时，醇提取的全过程温度控制在75℃左右，将提取物在沸水浴中加热浓缩至原有体积1/4，冷却后10000rpm离心15min，弃去上层油状物和下层沉淀，加入活性炭吸附精制。
将水提取物与醇提取物等体积混合即得本发明的美洲大蠊成虫提取物。

美洲大蠊成虫提取物的制备方法
技术领域
本发明具体涉及美洲大蠊(Periplaneta americana)成虫提取物的制备方法。
背景技术
蜚蠊(Periplaneta)是一种古老的昆虫(蟑螂)，在地球上已生存了3.5亿年，千百年来一直被人类视为害虫而消灭之，然而面对人类最原始或最现代化的杀灭手段仍能顽强生存至今，可见其体内具有最优秀的生物活性物质和特殊的生理机制，以及超强的生命信息维护系统，从而才能使它成为世界上最古老，繁衍至今最成功的昆虫类群。《中国药学大辞典》、《中药大辞典》、《中国药用动物志》、《全国中草药汇编》等近、现代药学专著均记载蜚蠊有“活血、散瘀、化积、消疳、解毒、利尿、消肿”等功能，并用于治疗疔疮、喉蛾、痈肿、蛇虫咬伤等。姚廉等学者经考证认为，以上典籍中记载的药用蜚蠊，其基源及原动物应为蜚蠊目蜚蠊科大蠊属的美洲大蠊(Periplanetaamericana)、澳洲大蠊(P.australasiae)、褐色大蠊(P.brunnea)、黑胸大蠊(P.fuliginosa)等。
具活性组分的蜚蠊提取物可用于治疗外创伤面、妇女生殖道疾病、心血管疾病及乙型肝炎等。中国专利CN87100537公开了“一种治疗外创伤面药物的制备方法”，该方法为：将蜚蠊虫体干燥后粗粉碎，用乙醇溶液浸泡以提取其中药用有效成分，然后分离滤渣和滤液，并对滤渣进行反复提取，浓缩所得滤液得到粘稠状物，经处理制成一种治疗外创伤面药物。中国专利CN1135895A公开了“一种治疗妇女生殖道疾病的药物及其用途”，蜚蠊乙醇提取物加辅料可制成栓剂、泡腾片、片剂等，在治疗宫颈糜烂、阴道炎、宫颈癌等疾病方面，具有疗程短、疗效好、毒副作用少的优点。中国专利94118839公开了从蟑螂体内提取活性组分，采用乙醇提取后除去油脂，制得水溶性浸膏，与复合核苷配伍制成的药物对心血管疾病疗效显著。中国专利94108943公开了用乙醇提取、脱脂、活性炭吸附、分溶获得蟑螂体内的粘多糖缩氨基酸类化合物的混合物，主要用于乙型肝炎的治疗。国外对蟑螂的研究，也有利用corporacardiace治疗心脏病等。
有文献报道，美洲大蠊体内含有多种具药用价值的活性成分，其淋巴含海藻糖(trehalose)、肌醇(inositol)、原儿茶酸葡糖苷(protocatechuic acid glucoside)等糖蛋白；角皮和肌肉中含多种氨基酸，其中有苷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬酰氨等。此外还含有多种信息素、神经介质肽和神经色酮C、D，异黄蝶呤，黄蝶呤，5-羟色氨，多巴氨，r-氨基丁酸，软骨素(chondroitin)，皮肤素(dermantan)、硫酸角质素，透明质酸(hyaluromic)等。
现有的美洲大蜚蠊提取物制备方法多采用传统的乙醇提取法或单纯的水提取法，由此导致大量氨基酸未能有效提取出，总回收率不到10％，产品的氨基酸总含量仅30％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美洲大蠊成虫提取物的制备方法。该方法能快速有效的提取美洲大蠊的各种活性成分，作为动物的天然提取物，本发明的成虫提取物安全无毒副作用。
本发明按照以下技术方案实现：
A水提取：
1、粗提：选取一月内美洲大蠊成虫，转移至供水但撤食的玻璃缸内饲养5-6天，待成虫吐尽内容物后-20℃冷冻30min处死，75％乙醇短时间清洗虫体表面，蒸馏水淋洗两遍，凉干，剪去翅、足、触须后称取约10g放入碾钵中，加入10ml蒸馏水碾磨30min，置-20℃冰箱中冷冻15min，如此反复3次，直到虫体被充分磨成匀浆。将匀浆移入50ml离心管中，定容至40ml，4000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，10000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，-4℃冰箱静置过夜。
2、浓缩、醇洗：在沸水浴中加热至沸腾蒸发，待上清液浓缩至原有体积1/4时生成大量棕灰色沉淀，冷却后10000rpm离心15min，弃去上层油状物和下层沉淀，取中间上清液。加热至60℃左右，趁热加入95％乙醇(2∶1)，不断搅拌，冷却至室温后，10000rpm离心15min除去上清液，得白色沉淀物，乙醇反复沉淀三次。
3、精制：取白色沉淀物加热溶解，再加入1/10-1/8体积活性碳，不断搅拌，80℃加热30min，趁热过滤，用少量蒸馏水洗活性碳二次，合并每次洗滤液，95％乙醇重结晶。
B：醇提取：
取水提取第一步分离得到的上层油状物和下层沉淀，加入2倍体积的85％乙醇，热回流抽提3-5小时，醇提取的全过程温度控制在75℃左右，将提取物在沸水浴中加热浓缩至原有体积1/4，冷却后10000rpm离心15min，弃去上层油状物和下层沉淀，加入活性炭吸附精制。
将水提取物与醇提取物等体积混合即得本发明的美洲大蠊成虫提取物。
本发明的制备方法将醇提取与水提取工艺相结合，总回收率达25.2％，比单纯的醇提取法得率高出一倍多，回收产品氨基酸含量高达58.5％。所述的提取制备方法步骤简单，所用溶剂价廉易得，提取效果好且提取完全。小鼠急性毒性试验表明本发明制得的提取物安全、无毒副作用。
具体实施方式
实施例一：美洲大蠊成虫提取物制备方法
A水提取：
1、粗提：选取一月内美洲大蠊成虫，转移至供水但撤食的玻璃缸内饲养5-6天，待成虫吐尽内容物后-20℃冷冻30min处死，75％乙醇短时间清洗虫体表面，蒸馏水淋洗两遍，凉干，剪去翅、足、触须后称取约10g放入碾钵中，加入10ml蒸馏水碾磨30min，置-20℃冰箱中冷冻15min，如此反复3次，直到虫体被充分磨成匀浆。将匀浆移入50ml离心管中，定容至40ml，4000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，10000rpm离心15min，分离上层油状物和下层沉淀，取中间上清液，-4℃冰箱静置过夜。
2、浓缩、醇洗：在沸水浴中加热至沸腾蒸发，待上清液浓缩至原有体积1/4时生成大量棕灰色沉淀，冷却后10000rpm离心15min，弃去上层油状物和下层沉淀，取中间澄清液。加热至60℃左右，趁热加入95％乙醇(2∶1)，不断搅拌，冷却至室温后，10000rpm离心15min除去上清液，得白色沉淀物，乙醇反复沉淀三次。
3、精制：取白色沉淀物加热溶解，再加入1/10-1/8体积活性碳，不断搅拌，80℃加热30min，趁热过滤，用少量蒸馏水洗活性碳二次，合并每次洗滤液，95％乙醇重结晶。
B：醇提取：
取水提取第一步分离得到的上层油状物和下层沉淀，加入2倍体积的85％乙醇，热回流抽提3-5小时，醇提取的全过程温度控制在75℃左右，将提取物在沸水浴中加热浓缩至原有体积1/4，冷却后10000rpm离心15min，弃去沉淀，加入1/10-1/8体积活性炭吸附精制。
将水提取物与醇提取物等体积混合即得本发明的美洲大蠊成虫提取物。
实施例二：美洲大蠊提取物小鼠急性毒性试验
昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g，随机分成4组，每组10只。动物给药前隔夜禁食不禁水，编号后将雌虫提取物和若虫提取物经一次性灌胃给药。两种受试物各分四个剂量组，最大剂量组取原液，其他剂量组按1∶0.8设组间间距，灌胃量为0.25ml/10g体重，给药后至少间隔2小时进食，连续观察动物灌胃后14天的毒性反应，求出受试物对小鼠的半数致死量(LD₅₀)。
小鼠经灌胃给药后、连续观察14天未见小鼠死亡，且生长良好，外观、行为活动、精神状态、饮食、大小便及颜色、皮肤和皮毛等均未见异常，体重均有增加。处死动物后解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各内脏器官均无异常变化。受试物LD₅₀大于1260mg/kg，表明受试物无严重急性中毒的危险性，属于基本无毒的化合物测试结果见表一：
表一美洲大蠊提取物急性毒性测试结果