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肝活素制备方法
    所属技术领域

    本发明涉及一种生物药品的制备方法，尤指一种从江浙蝮蛇毒中提取精氨酸酯酶作为肝病治疗药的方法，利用这种方法可得高纯度的精氨酸酯酶，使更加适合于应用在肝病治疗药中。背景技术

    已知蝮蛇毒中含有具有药理活性的精氨酸酯酶，以前曾有精制蝮蛇抗栓酶获得过辽宁省药政批准文号，用于心、脑、血管性疾病的治疗，较常用药丹参的效果好。但该药因卫生部鉴于我国蛇毒抗栓酶的纯度不高，生产紊乱，1994年进行整顿，1997年停止原产生许可文号，以新产品“降纤酶”代替。经进一步的研究发现，蝮蛇毒中的精氨酸酯酶是专一性较高的酶，只作用于肽链中少数的精氨酸酯键，对组织没有损害，故其副作用较小。对病毒性肝炎、肝硬化、肝坏死等有疗效是一新的发现，临床观察结果有效率达80％以上。中国医科大学老年病研究中心曾以精制蝮蛇抗栓酶改用药名“疏肝特乐”用于临床治疗肝病，证明对急、慢性肝炎治疗确有显著疗效，特别适用于慢性肝炎、肝硬化的治疗，疗效满意，为现有临床常用药物所不及，已临床应用于治疗肝病上百例。在目前治疗肝病的药物中，属于疗效较好的新型药物，具有很好的临床应用前景，但其精氨酸酯酶的纯度没有提高，且无新药政批号，而蛇毒中含有二十多种酶类及毒蛋白，尤属其中的神经毒素和出血毒素对人体最为有害，所以为从根本上保证作为药品的安全性，必须从彻底去除这些有害物质，把精氨酸酯酶高度纯化是本发明的关键所在。发明内容

    为解决用现有从蝮蛇毒中提取精氨酸酯酶的方法所得到的精氨酸酯酶纯度不高，还含有大量有毒物质的技术问题，本发明提供一种从江浙蝮蛇毒中提取制备肝活素(也就是精氨酸酯酶)的方法，纯度可达90％以上，从而保证用药安全度。

    本发明的方法包括如下步骤：

    步骤a：取江浙蝮蛇毒冻干粉溶于0.05M Tris-HCl，pH7.8缓冲液中，4℃下离心除去不溶物，取上清液；

    步骤b：上清液先经DEAE纤维素DE-52柱层析，层析柱先用Tris-HCl缓冲液平衡后，用含NaCl的缓冲液从0至0.5M进行梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性地组分，浓缩，去盐后，进行下一步分离；

    步骤c：用CM-Sepharose柱层析分离，平衡液是0.05M醋酸钠pH5.0缓冲液，洗脱液含0至0.5M NaCl pH5.0的醋酸钠缓冲液梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性组分，浓缩，去盐后再做下一步分离；

    步骤d：用Sephadex-75柱层析凝胶过滤分离，洗脱液为0.05M NaHCO3含0.1M NaCl溶液，收集精氨酸酯酶组分，浓缩，去盐，冻干后得产品。

    所说的去盐是采用透析法，浓缩采用超滤浓缩法。

    利用上述方法所得到的产品经动物试验表明不含毒素及有害成分，纯度在90％以上(HPLC法检测)。

    蝮蛇毒中含有二十多种酶类及毒蛋白，要高度纯化其中一种成分的难度极大。本发明采用的三步层析分离法，能把精氨酸酯酶高度纯化，除掉毒性成分，保证用药的安全性。本发明的方法中首先经过初步除去不溶物后，即进行三步层析分离，第一步分离的目的在于初步纯化，把精氨酸酯酶与蛇毒的其他成分分开，适于大规模加工，每次可用蛇毒原料20克。第二步分离是用阴离子交换剂，与第一步的阳离子交换剂不同，再次把碱性蛋白质分离，使精氨酸酯酶的纯度进一步提高。第三步分离是按分子量的差异把残余的毒素蛋白除尽。因蝮蛇神经毒素的分子量为15000，出血毒素约50000至60000，而精氨酸酯酶的分子量在30000左右，分子量间的差别大，容易用凝胶过滤(即分子筛)法把它们分开达到高度纯化的目的，采用0.05M NaHCO3含NaCl的溶液作为洗脱液，可增加精氨酸酯酶的溶解度，从而获取最大收率。用以上方法从蝮蛇毒1克可得到产品约3毫克，可装针剂约30支，每支精氨酸酯酶为100单位。具体实施方式

    取江浙蝮蛇毒冻干粉20克，溶于20ml的0.05M Tris-HCl，pH7.8缓冲液，于冷冻离心机3000转/分离心10分钟，除去不溶物，将上清液加入DEAE纤维素DE-52层析柱，3×80cm，层析柱需先经Tris-HCl缓冲液平衡，洗脱液是以含NaCl的浓度0至0.5M进行梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性的组分(以紫外分光光度计在280nm波长检测)，合并收集液，经以截留分子量为1万以上的超滤膜超滤浓缩、透析去盐，再经CM-Sepharose柱层析分离，柱的大小为2×40cm；用0.05M pH5.0的醋酸钠缓冲液平衡，加入样品后，用含0至0.5M NaCl的醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶的组分，经透析，冻干，再经Sephadex-75柱层析分离，柱的大小为2×150cm，洗脱液为0.05M NaHCO3含0.1M NaCl的溶液，收集活性组分，去盐，冻干后得产品。经除菌，热源鉴定合格，装针为100单位/支。