抑制VEGF表达的mRNA反义核酸及其应用 技术领域：本发明涉及反义核酸及其应用，尤其涉及血管内皮生长因子(VEGF)的反义核酸及其在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是与血管新生相关的特异性生长因子，它与特异性受体结合刺激内皮细胞增殖、移行，增加血管通透性，促进血管形成。VEGF在实体瘤的发生、发展及转移过程起重要作用，最新研究发现恶性血液病细胞亦高表达VEGF蛋白，并不同程度表达VEGF受体，即VEGF和受体共表达现象，提示有VEGF自分泌机制存在。VEGF以自分泌方式作用于白血病细胞表面VEGF受体，促进白血病细胞增殖，维持白血病细胞存活，并且阻止放射线和化疗药物诱导的白血病细胞凋亡，增强白血病细胞耐药性。VEGF及受体已成为血液恶性肿瘤治疗的理想靶点。
以VEGF及受体为靶点药物中，最有应用前景的可能是反义核酸药物，因为它可以直接、特异性地封闭某种基因的表达，并且少有毒副作用，价格适宜，与化疗药物联合作用，可能会降低耐药性，减少毒副作用，提高缓解率，改善预后，甚至达到根治效果。
过去几十年来，尽管在癌症的分子研究包括癌基因和抑癌基因的研究方面取得了巨大的成就，但目前癌症的治疗主要以手术治疗、放疗和化疗为基础，辅以某些生物治疗。传统的化疗药物以转录抑制或DNA损伤为作用机制，缺乏特异性，对人体正常细胞也有严重的毒性作用。核酸化学和生物化学领域的发展及对肿瘤发生的认识进一步加深，使设计出以寡核苷酸为基础的治疗药物成为现实。但是反义硫代寡脱氧核糖核苷酸(ASODN)单独应用剂量较高时，也会产生一些非序列特异性地副作用。在不同疾病模型的临床前期研究中已证实，利用反义寡核苷酸联合化疗治疗癌症，不仅可以提高疗效，同时还可以降低两者单独使用时的副作用。反义核酸联合化疗至少有以下3个优点：(1)防止肿瘤细胞耐药性的形成；(2)与化疗药物联合，可增加抗癌疗效，并且能降低药物剂量和毒性；(3)特异性强，特异性地攻击靶细胞，对正常细胞几乎无影响(Citro G，D’Agnano I，Leonetti C et al.c-mycantisense oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanomachemotherapy in vitro and in nude mice.Cancer Res.1998；15；58：283-289.)。
发明内容：本发明的目的是提供一种抑制VEGF表达的mRNA反义核酸及其应用。
为达上述目的，发明人设计并筛选了两条VEGF mRNA反义核酸序列A6、A7，分别为：
A7：5’-GGGTGCAGCCTGGGACCACT-3’；和
A6：5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’
所述每一条链条均对其进行全硫代修饰。
本发明的上述两条反义核酸链条用于制备治疗白血病的药物，可下调VEGF蛋白和VEGF mRNA的表达，有效抑制白血病细胞生长。
本发明的反义核酸与化疗药物联用所制备的治疗白血病的药物，可增强白血病细胞对化疗药物的敏感性，有效促进白血病细胞凋亡。
为了验证上述两条反义核酸序列抑制VEGF表达的作用，发明人对VEGF反义核酸抑制HL60、K562细胞生长及机理、VEGF反义核酸对HL60、K562细胞药物敏感性的影响及VEGF反义核酸对急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)原代白血病细胞存活和药物敏感性的影响等各方面进行了研究，进行了一系列的实验。
附图说明：下面结合附图和附表对本发明的实验结果作进一步的具体分析。
图1是HL60、K562细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中的生长曲线图。
图2是各条序列的反义核酸对HL60细胞生长的影响对照图。
图3是各条序列的反义核酸对K562细胞生长的影响对照图。
图4是各条序列的反义核酸对HL60细胞VEGF蛋白表达的影响对照图。
图5是各条序列的反义核酸对K562细胞VEGF蛋白表达的影响对照图。
图6是A7、A6分别对HL60细胞生长的抑制效应图。
图7是A7、A6分别对K562细胞生长的抑制效应图。
图8是A7、A6分别对HL60细胞的VEGF蛋白表达抑制效应图。
图9是A7、A6分别对K562细胞的VEGF蛋白表达抑制效应图。
图10是A7、A6分别对HL60细胞生长的时效关系图。
图11是A7、A6分别对K562细胞生长的时效关系图。
图12是.RT-PCR分析A7作用48小时，HL60细胞VEGF mRNA表达图。
图13是.RT-PCR分析A7作用48小时，K562细胞VEGF mRNA表达图。
图14显示了A7、A6分别和As2O3联用对HL60、K562细胞VEGF蛋白表达的影响。
图15显示了A7、A6分别和H联用对HL60、K562细胞VEGF蛋白表达的影响。
图16显示了A7、A6分别和DNR联用对HL60、K562细胞VEGF蛋白表达的影响。
图17A、17B是化疗药物作用前后HL60细胞的形态学改变Giemsa染色图。A为未经处理的HL60细胞；B为2μmol/LAs2O3处理48小时的HL60细胞。
图18A、18B是化疗药物作用前后K562细胞的形态学改变Giemsa染色图。A为未经处理的K562细胞；B为2μmol/L As2O3处理48小时的K562细胞。
图19显示了A7、A6分别与As2O3联用时对AML细胞存活的影响。
图20显示了A7、A6分别与H联用时对AML细胞存活的影响。
图21显示了A7、A6分别与DNR联用时对AML细胞存活的影响。
图22显示了A7、A6分别与As2O3联用时对CML细胞存活的影响。
图23显示了A7、A6分别与H联用时对CML细胞存活的影响。
图24显示了A7、A6分别与DNR联用时对CML细胞存活的影响。
表1显示了A7、A6分别作用于HL60细胞各组化疗药物的半数抑制浓度(IC50)。
表2显示了A7、A6分别作用于K562细胞各组化疗药物的半数抑制浓度。
表3显示了A7、A6对As2O3诱导白血病细胞凋亡百分数的影响。
表4显示了A7、A6对H诱导白血病细胞凋亡百分数的影响。
表5显示了A7、A6对DNR诱导白血病细胞凋亡百分数的影响。
表6显示了A7、A6与As2O3联用时AML、CML细胞培养液中VEGF蛋白的表达。
表7显示了A7、A6与H联用时AML、CML细胞培养液中VEGF蛋白的表达。
表8显示了A7、A6与DNR联用时AML、CML细胞培养液中VEGF蛋白的表达。
表9显示了A7、A6与As2O3联用时AML、CML细胞凋亡百分率。
表10显示了A7、A6与H联用时AML、CML细胞凋亡百分率。
表11显示了A7、A6与DNR联用时AML、CML细胞凋亡百分率。
各图表中：
AS：反义核酸组；
S：正义核酸组；
B：空白对照组；
M：φX174HaeIIIdigest
As2O3/S：三氧化二砷与正义核酸联用；
As2O3/AS：三氧化二砷与反义核酸联用；
H/S：高三尖杉酯碱与正义核酸联用；
H/AS：高三尖杉酯碱与反义核酸联用；
DNR/S：柔红霉素与正义核酸联用；
DNR/AS：柔红霉素与反义核酸联用；
从各图表中可见：
1、HL60和K562细胞的生长曲线：
见图1：两种细胞株培养初浓度均为2×104个细胞/mL，细胞在第1～5天呈指数生长。作直线回归方程分析得HL60细胞倍增时间为24.6小时，K562细胞为22.85小时。
2、各条序列的反义核酸对HL60、K562细胞生长的影响对照：
见图2、图3：发明人以A0(B)为空白对照，A1(S)为随机对照组，A2是选自美国专利作阳性对照；设计了7条VEGF mRNA反义核酸链条，即A3至A9，A3和A5是根据起始位点作靶点设计，其余针对编码区设计。将反义寡核苷酸处理HL60细胞24小时、48小时，细胞计数与对照组无显著差异，72小时用0.4％台盼蓝进行细胞计数如图2所示，A3与空白及随机对照组无显著差异，其余6条均有显著差异(p＜0.01)，A5、A6、A7、A8组优于阳性对照A2，其中A7为最优序列，A6次之。A7与随机对照组A1相比，细胞生长抑制率达36.6％。反义寡核苷酸处理K562细胞72小时，活细胞计数如图3所示，A3与对照组无显著差异，其余6条均有显著差异(p＜0.01)，并且优于阳性对照A2，其中A7为最优序列，A6次之。A7与随机对照组相比，抑制率达31.9％。
3、各条序列的反义核酸对HL60细胞VEGF蛋白表达的影响对照：
见图4：经反义寡核苷酸处理72小时HL60细胞，7条反义寡核苷酸(除A3外)均能有效抑制VEGF蛋白表达，与空白对照组均有显著差异，并且均优于阳性对照A2，最佳序列亦是A7，A6次之。与空白对照组相比，A7蛋白表达抑制率达47.81％；与随机对照组A1相比，A7蛋白表达抑制率达42.73％。
4、各条序列的反义核酸对K562细胞VEGF蛋白表达的影响对照：
见图5：经反义寡核苷酸处理72小时K562细胞，7条反义寡核苷酸与空白对照组和随机对照组均有显著差异，并且A6和A7优于阳性对照，其中亦是A7组最低，与随机对照组相比，抑制率达51.4％。
5、A6、A7对HL60、K562细胞生长的影响：
见图6、图7：经不同浓度反义核酸A7(或A6)分别处理72h，HL60、K562细胞在0.2μmol/L以上被有效抑制，并且呈剂量依赖关系，与随机对照组相比呈显著差异(0.2μmol/L，p＜0.05；0.4μmol/L、0.6μmol/L，p＜0.01)，A7(A6)组和随机对照组(S)作用于HL60细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别是0.401μmol/L和0.89μmol/L；A7(A6)组和随机对照组作用于K562细胞的IC50值分别是0.421μmol/L和0.953μmol/L。
6、A6、A7抑制HL60、K562细胞VEGF蛋白表达的测定：
见图8、图9：A7(或A6)反义核酸按不同浓度在无血清状况下，经脂质体转染8小时，换成含10％胎牛血清的DMEM培养基培养64小时后，用ELSA法检测培养液中VEGF蛋白含量(pg/ml)，并设立随机对照组，结果，HL60、K562细胞蛋白表达在0.2μmol/L以上反义核酸作用下被有效抑制。
7、反义核酸抑制HL60、K562细胞作用持续时间测定：
见图10、图11：经反义核酸A7(或A6)0.3μmol/L分别处理HL60、K562细胞，在无血清状况下，经脂质体转染8小时，换成含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，每24小时进行活细胞计数，设立空白对照和随机对照，从72小时始，HL60、K562细胞生长被明显抑制，与随机对照组相比呈显著差异(72小时、96小时，p＜0.05)。
8、反义核酸对HL60、K562细胞VEGFmRNA表达的影响：
见图12、图13：反义核酸A7(或A6)按0.3μmol/L作用于HL60、K562细胞，每个浓度3孔，设置空白对照组和随机对照，转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养40小时，.RT-PCR分析VEGFmRNA表达，反义核酸组VEGFmRNA表达显著减少。
细胞形态学观察：
经反义核酸A7(A6)分别处理72小时，经Giemsa染色，HL60、K562细胞未出现凋亡特征形态，对照组HL60、K562细胞亦未出现凋亡特征形态。
流式细胞术测定：
经反义核酸A7(A6)处理72小时，FCM检测HL60细胞凋亡率为3.4％，空白对照组与随机对照组HL60细胞凋亡率分别为4.2％和4.8％；K562细胞凋亡率5.1％，空白对照组与随机对照组K562细胞凋亡率分别为4.2％和4.6％。未出现凋亡现象。
9、反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响：
见表1、表2：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L，在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、柔红霉素(DNR)(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于AML、CML，继续培养48小时(共72小时)，测定光吸收A值，Probit法(概率单位法)求各组化疗药物半数抑制浓度(IC50)。结果，A7(A6)分别与As2O3、H、DNR联用能有效抑制AML、CML细胞存活，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，IC50有显著性差异，p＜0.01。
10、反义核酸和化疗药物联用对白血病细胞VEGF蛋白表达的影响：
见图14、图15、图16：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、DNR(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于HL60、K562，继续培养48小时(共72小时)，ELASA法检测培养液中VEGF蛋白，结果，A6、A7分别与As2O3、H、DNR联用能有效抑制HL60、K562细胞蛋白表达，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，有显著性差异，p＜0.01。
11、反义核酸对化疗药物诱导白血病细胞凋亡的影响：
见图17A、图17B、图18A、图18B及表3、表4、表5：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、DNR(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于HL60、K562，继续培养48小时(共72小时)，ELASA法检测培养液中VEGF蛋白，结果，A7(A6)分别与As2O3、H、DNR联用能有效促进HL60、K562细胞凋亡，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，有显著性差异，p＜0.01。
12、反义核酸对AML及CML细胞药物敏感性的影响：
见图19、图20、图21、图22、图23、图24：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L，在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、柔红霉素(DNR)(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于AML、CML，继续培养48小时(共72小时)，分别于24小时、48小时、72小时，用0.4％台盼蓝拒染法活细胞计数，结果，A7(A6)分别与As2O3、H、DNR联用能有效抑制AML、CML细胞存活，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，有显著性差异，48小时，p＜0.05；72小时，p＜0.01。
13、反义核酸和化疗药物联用对原代AML、CML细胞VEGF蛋白表达的影响：
见表6、表7、表8：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L，在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、柔红霉素(DNR)(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于AML、CML，继续培养48小时(共72小时)，ELASA法检测培养液中VEGF蛋白，结果，A7(A6)分别与As2O3、H、DNR联用能有效抑制AML、CML细胞蛋白表达，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，有显著性差异，p＜0.01。
14、反义核酸和化疗药物联用对原代AML、CML细胞凋亡的影响：
见表9、表10、表11：反义核酸A7(A6)0.3μmol/L，在低血清(2％)状态下，经脂质体转染8小时，换含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，继续培养16小时(共24小时)，开始将化疗药物As2O3(2μmol/L)、高三尖杉酯碱(H)(0.2μmol/L)、柔红霉素(DNR)(0.2μmol/L)，加入相应实验组，作用于AML、CML，继续培养48小时(共72小时)，ELASA法检测培养液中VEGF蛋白，结果，A7(A6)分别与As2O3、H、DNR联用能有效促进AML、CML细胞凋亡，与随机寡核苷酸(S)与化疗药物联用组相比，有显著性差异，p＜0.01。
综上所述，本发明的A6、A7两条VEGF反义核酸均具有如下的优点：
1、VEGF反义核酸可有效抑制HL60、K562细胞生长，下调VEGF蛋白和VEGFmRNA的表达，VEGF反义核酸对HL60、K562细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性。
2、VEGF反义核酸抑制HL60、K562细胞生长的机理是抑制细胞增殖，而不是促进细胞凋亡。
3、VEGF反义核酸可提高HL60、K562细胞对As2O3、H、DNR的敏感性，促进化疗药物诱导的HL60、K562细胞凋亡。
4、VEGF反义核酸能有效抑制原代白血病细胞存活，提高原代白血病细胞对化疗药物的敏感性，促进化疗药物诱导的原代白血病细胞凋亡。
5、内源性VEGF具有促进白血病细胞增殖，降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。
具体实施方式：
实施例一：
合成序列为5’-GGGTGCAGCCTGGGACCACT-3’(A7)的反义核酸，全硫代修饰。A7分别与化疗药物三氧化二砷(As2O3)、高三尖杉酯碱(H)或柔红霉素(DNR)联合用于制备治疗白血病的药物。所述反义核酸A7的终浓度为0.2～0.6μmol/L。
实施例二：
合成序列为5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’(A6)的反义核酸，全硫代修饰。A6分别与化疗药物三氧化二砷(As2O3)、高三尖杉酯碱(H)或柔红霉素(DNR)联合用于制备治疗白血病的药物。所述反义核酸A6的终浓度为0.2～0.6μmol/L。
核苷酸序列表：
一、人类VEGF基因序列：来自GeneBank
1：X62568.H.sapiens vegfge...[gi：37658]
LOCUS HSVEGF 649 bp mRNA linear PRI
30-JUL-1996
DEFINITION H.sapiens vegf gene for vascular endothelial growth factor.
ACCESSION X62568
VERSION X62568.1 GI：37658
KEYWORDS vascular endothelial growth factor；vegf gene.
SOURCE Homo sapiens(human)
ORIGIN
1 tcgggcctcc gaaaccatga actttctgct gtcttgggtg cattggagcc ttgccttgct
61 gctctacctc caccatgcca agtggtccca ggctgcaccc atggcagaag gaggagggca
121 gaatcatcac gaagtggtga agttcatgga tgtctatcag cgcagctact gccatccaat
181 cgagaccctg gtggacatct tccaggagta ccctgatgag atcgagtaca tcttcaagcc
241 atcctgtgtg cccctgatgc gatgcggggg ctgctgcaat gacgagggcc tggagtgtgt
301 gcccactgag gagtccaaca tcaccatgca gattatgcgg atcaaacctc accaaggcca
361 gcacatagga gagatgagct tcctacagca caacaaatgt gaatgcagac caaagaaaga
421 tagagcaaga caagaaaatc cctgtgggcc ttgctcagag cggagaaagc atttgtttgt
481 acaagatccg cagacgtgta aatgttcctg caaaaacaca gactcgcgtt gcaaggcgag
541 gcagcttgag ttaaacgaac gtacttgcag atgtgacaag ccgaggcggt gagccgggca
601 ggaggaagga gcctccctca gcgtttcggg aaccagatct ctcaccagg
二、反义核酸序列：
A1(随机对照序列S)：
5’-CACCCCAATTCTTCCGCC-3’
A2(阳性对照序列，选自美国专利，专利号5641756)：
5’-GTGCAGCCTGGGACCACTTG-3’
A3：5’-GTTCATGGTTTCGGAGGC-3’
A4：5’-CCCGGCTCACCGCCTCGGCT-3’
A5：5’-TTCATGGTTTCGGAGGCCCG-3’
A6：5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’
A7：5’-GGGTGCAGCCTGGGACCACT-3’
A8：5’-GCCCACAGGGATTTTCTTGT-3’
A9：5’-GGTGAGGTTTGATCCGCATA-3’