SARS冠状病毒中的功能蛋白质技术领域
本发明涉及一种蛋白质，具体涉及SARS冠状病毒中的一种功能蛋白质。
背景技术
严重急性呼吸系统综合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)
是一种急性呼吸道传染病，我国称之为非典型肺炎。自从2002年11月在我
国广东首次发现SARAS病例以来，已经有许多国家和地区的人们受到这种
病毒的威胁。该病可通过人与人的密切接触和短距离接触传染性飞沫感染，
而且起病急、传播快、致死率较高，因此对人民的健康危害很大。找出非典
型肺炎的致病病原体，是开展有针对性的诊断、预防与治疗的基础。经过全
世界科学家的共同努力，探明这种疾病为一种变异的冠状病毒所致。随后，
加拿大(Marco A.Marra，et al.，The Genome Sequence of the SARS-Associated
Coronavirus，SCIENCE VOL 300，1399)、美国(Paul A.Rota，Characterization of
a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory Syndrome
SCIENCE VOL 300，1394-1398)、中国香港和中国军事医学科学院和中国科
学院的科学家(QIN E’de，ZHU Qingyu，YU Man，et al.，A complete sequence and
comparative analysis of SARS-associated virus(isolate BJ01)Chinese science
bulletin.2003 941-948)陆续测定并公开了该病毒的基因组序列。2003年4月
16日，世界卫生组织(WHO)正式宣布，一种新型的冠状病毒为此次非典型
肺炎的病原体，并将其命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。但是，对该病
毒的致病机制、传播途径还不十分清楚，这直接影响到该病的诊断试剂、防
治药物和疫苗的研制，因此，对SARS冠状病毒的蛋白质组进行研究很有必
要。最近，加拿大的研究小组(Oleg kronkhin，Yan Li，Anton Andonov，et al，Mass
Spectrometric Characterization Of Protein From The SARS Virus：a Preliminary
Report(E-pub)，molecular and cellular proteomics)表征了SARS冠状病毒蛋白
质组中N蛋白质和S蛋白质的一些特征，但未测定出N蛋白质的相对分子量，
也未对其降解和修饰进行研究。
发明内容
本发明公开了三种SARS冠状病毒中的蛋白质，分别为N蛋白质、S蛋
白质和M蛋白质。进一步研究表明，其中的N蛋白质的测定分子量为45930，
理论分子量为45935，具有序列表所示的氨基酸序列。
基于本发明的蛋白质的氨基酸序列，本技术领域的中等技术人员不难获
得编码该蛋白质的基因及其核苷酸序列。
本发明的蛋白质可通过以下方法获得：用分析型高效液相色谱对SARS
冠状病毒攻击的无血清培养细胞裂解液的分离制备、浓缩和酶切以及毛细管
反相LC-ESI-Q-TOF-MS体系对不同馏分、酶切所得混合肽段进行分离鉴定。
已报道，加拿大、美国和我国香港和大陆所获得的SARS冠状病毒基因
组序列基本一致，因此，本发明中的SARS冠状病毒可以是SARS冠状病毒
的任意分离株。通过常规技术可以获得其无血清培养细胞。
免疫印记技术检测SARS-CoV相关蛋白的免疫原性结果表明，N蛋白是
SARS冠状病毒蛋白中免疫原性最强的蛋白，揭示N蛋白作为主要的致病抗
原刺激机体产生抗体，并且参与体液免疫反应的不仅仅是N蛋白的原型分子，
其一系列降解产物也存在较强的免疫反应。此外，M蛋白与Spike蛋白原型
存在的条带未发现抗体反应，仅有二者共同存在的部位发现一定反应。揭示
SARS-CoV侵染宿主细胞时，二者可能形成攻膜复合物攻击宿主细胞，同时
揭示M蛋白与Spike蛋白可能存在一定的相互作用。
附图说明
图1为SARS病毒攻击细胞裂解液中N蛋白质的反相色谱图，图中标号
1为降解的N蛋白质，2为未降解的N蛋白质。
图2为N蛋白质相对分子量谱图。
图3为SARS冠状病毒攻击vero E6细胞裂解液(S)和模拟攻击vero E6
细胞裂解液(V)经13％SDS-PAGE电泳分离后的免疫印记分析。A组与SARS
恢复期患者抗血清反应；B组与正常对照血清反应。
图4为SARS恢复期患者血清抗体的间接免疫荧光检测。
图5为SARS冠状病毒攻击vero E6细胞裂解液(S)和模拟攻击vero E6
细胞裂解液(V)经13％SDS-PAGE电泳分离后的免疫印记分析。
本发明的蛋白质及其编码基因在SARS诊断试剂、防治药物和疫苗的研
制中具有重大实际应用价值。例如，本发明的蛋白质有可能用作SARS防治
药物的靶点。
具体实施方式
实施例一、液相色谱-质谱联用方法用于SARS
相关蛋白质组中N蛋白质的研究
一、材料方法
1、仪器和试剂
230型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)包括两台P230
高压恒流泵、一台UV230紫外-可见检测器和EC2000色谱数据处理系统V1.0；
FC-95自动馏分收集器(北京新技术应用研究所)；毛细管高效液相色谱-电喷
雾-四极杆-飞行时间质谱(CapLC-ESI-QTOF MS，Micromass，Manchester，UK)
主要包括一台毛细管高效液相色谱系统、一台电喷雾-四极杆-飞行时间质谱和
MassLynx v.3.5软件；REFLEXTMIII基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质
谱(MALDI-TOF MS，Bruker，Daltonics Germany)；HoeferminiVE垂直电泳
系统(amersham pharmacia biotech，瑞典)；SARTORIUS BP211D分析天平；
超纯水由Millipore纯水系统(Millipore公司，美国)制备；乙腈(HPLC级)
购自美国J.T.Baker公司；三氟乙酸和碘乙酰胺(iodoacetamide)购自利时
ACROS公司；胰蛋白酶(trypsin，bovine pancrease)和二硫苏糖醇(DTT，
dithiothreithol)为美国Promega公司产品；牛血清白蛋白质(BSA)和碳酸
氢氨购自美国Sigma公司；PVDF膜：Hybond-P，Amersham Pharmacia Biotech；
无血清培养的细胞由军事医学科学院五所提供。
2、样品制备和试剂配制
收集SARS冠状病毒攻击的无血清细胞和培养液，经过70℃灭活2小时
后，经过反复冻融破裂细胞。通过4000g离心分离除去细胞碎片后，用切割
分子量为3000的透析膜氯化钠降梯度透析直至去离子水进行除盐后，冷冻干
燥后，根据不同实验方案进行分离制备和胰蛋白酶酶切。
酶切条件：在含有冷冻干燥样品的1.5ml的小管中，加入25μl 8M尿，
使DTT终浓度达到10mM，在37℃孵育4h，使蛋白质充分变性溶解；按碘
乙酰氨与DTT的比例为5∶1加入碘乙酰氨，在暗处放置1h，封闭多余的DTT；
加入50mmol/L碳酸氢氨溶液并使尿的最终浓度小于1.0M，再按蛋白质与酶
的比例为1∶50重量比加入胰蛋白酶，在37℃水浴中孵育10-16h，冷冻干燥
浓缩后进行质谱分析。
抗血清制备：取10名临床确诊为SARS的患者恢复期(发病接受治疗
40～60日)血样，随即加入蛋白酶抑制剂，静置1h后，在4000×g条件下
离心10min，吸取上层血清，分装后于-80℃保存。对照正常血清取自6名健
康志愿者同样处理。利用间接免疫荧光法鉴定患者抗血清反应为阳性，而对
照正常血清反应为阴性。
TBST缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.5，140mM NaCl，包含0.05％
Tween-20；
Tris-甘氨酸电转液：Tris 25mM，甘氨酸192mM，甲醇20％(v/v)；
封闭液：TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5，140mM NaCl，0.05％Tween-20)
含有5％脱脂奶粉；
辣根过氧化物酶连接羊抗人IgG抗体：horseradish peroxidase-linked
anti-human IgG antibody；
增强化学发光试剂盒：Enhanced Chemiluminescence Kit(ECL Santa Cruz
Biotechnology，Inc)；
X-医用感光胶片：X-Omat K film(Kodak)。
间接免疫荧光法检测SARS冠状病毒抗体试剂盒(indirect
immunofluorescence assay，IFA)
3、色谱条件
3.1分析型色谱柱为50mm×4.6mm i.d.Hypersil C18反相柱，内装填料颗
粒直径为5μm，孔径为300；流动相A为5％乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B为95％乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液；流速1.0mL/min；蛋白质混合物
分离时波长为280nm；色谱洗脱梯度：10～90％B，60min，90～100％B，5min，
100％B洗脱5min后，切换到100％A平衡色谱系统；样品收集用所自动馏分
收集器进行，所有实验在室温条件下进行。
3.2毛细管反相柱为150mm×75μm i.d.二氧化硅玻璃管，其中装填
PepMap C18，3μm，100填料(LC Packings，Amsterdam，The Netherlands)；
设定流速为2.0μl/min，在毛细管反相柱前分流成约0.15μl/min的流速；用
辅助泵C以30μl/min的流速首先进样到预柱上(320μm×5mm，填料为
PepMap C18，颗粒直径：3μm，孔径：100，LC Packings，Amsterdam，The
Netherlands)，除盐后，切换到分析柱进梯度洗脱。流动相A：水/乙腈(95/5，
v/v)，加入0.1％FA；流动相B：水/乙腈(5/95，v/v)加入0.1％FA；分离
时采用非线性梯度：4％B，0.1～3.5min，进样；4～50％B，3.5～63.5min；
50～100％B，63.5～73.5min；100％B，73.5～80min；100～4％B，80～85min。分离后
的馏分通过ESI源直接进行串联质谱分析和MASCOT数据检索。
4、质谱条件
4.1 ESI-QTOF MS
ESI源流速约0.15μl/min，Cone电压45V，毛细管电压3000V，飞行管
电压5630V，MCP电压2500V，碰撞电压35V，碰撞气体为高纯氩气，雾化
气为高纯氮气。
4.2 REFLEXTMIII基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱
N蛋白质相对分子量的测定在Reflex III MALDI TOF MS上进行。该仪
器所用激光器为N2激光器(LaserScience Inc.，发射波长337nm)，线性飞行
管长1.6m，加速电压20Kv，Scout 384型靶，MCP电压1.6kV。谱图采
集采用正离子方式，信号为300次单次扫描的累加。样品用1％TFA溶解后，
取1μL与1μL芥子酸(SA，sigma，美国)混合、离心后，取上清夜点靶。在
所选定仪器条件下用1pmol的BSA仪器进行校正。
5、免疫印记检测与SARS相关抗原蛋白的检测
在免疫印记(western blotting)实验中，设计样品(SARS冠状病毒攻击
vero细胞裂解液，A组)及对照(模拟攻击vero细胞裂解液，B组)组，分
别取100μg两样品的冻干品溶于15μL 1×SDS电泳上样缓冲液中。加入1M
DTT 2μL，95℃水浴10min充分还原。样品进行13％SDS-PAGE分离。电
泳完毕，取下凝胶，浸泡于Tris-Glycine电转液中。按胶面积裁剪PVDF膜与
滤纸，于电转液中浸泡片刻，放置各层并排除膜间气泡，装入电转槽中，在
60mA恒流条件下进行湿法转膜2～3小时，转磨转膜完毕，将膜和凝胶取出。
凝胶进行考马斯亮蓝染色，4℃保存，备用鉴定蛋白。电转后PVDF膜浸泡于
封闭液中4℃过夜，进行封闭。按照血清∶封闭液＝1∶1000的比例分别配制
抗血清和正常血清的一抗工作液，将A组膜转移至抗血清工作液中，B组转
移至对照血清工作液中，室温下摇床振荡2h。之后取出PVDF膜，用PBST
浸洗10min，共洗三次。按照辣根过氧化物酶连接羊抗人IgG抗体的工作浓
度配制二抗工作液(1∶10000)，将膜分别转移至二抗工作液中，室温摇床振
荡1h。取出PVDF膜，用PBST浸洗10min，共洗三次。最后，按照增强化
学发光免疫印记试剂盒的说明配制化学发光反应液，使膜浸入反应液中与之
充分接触。反应3min后，使用医用X光胶片显影0.5～5min，冲洗底片，凉
干备用。对照胶片与凝胶相对位置，切下与抗血清发生强烈反应的条带，4℃
保存，进行胶上酶切和质谱鉴定。
二、结果
如图1所示，通过用分析型高效液相色谱对SARS冠状病毒攻击的无血
清培养细胞裂解液的分离制备、浓缩和酶切以及毛细管反相
LC-ESI-Q-TOF-MS体系对不同馏分酶切所得混合肽段的分离鉴定，发现了三
种与SARS相关的蛋白质，分别为N蛋白质、S蛋白质和M蛋白质。其中N
蛋白质的覆盖率达到了90％以上。用Reflex III MALDI TOF MS对色谱图1
中色谱峰2馏分的N蛋白质的相对分子量进行了测定，如图2所示，相对分
子量为45930，与理论分子量45935比较，相对误差为1/10000。由SARS冠
状病毒攻击的无血清培养细胞裂解液中整体分子色谱分离图1进一步看出，
色谱峰1和2两个色谱峰表明这两个色谱峰中的溶质的疏水性不同，一般应
为两种不同的溶质，但经过对色谱峰l和2相应馏分的质谱鉴定，色谱峰1
和2中主要为N蛋白质，初步表明N蛋白质有降解现象。
通过免疫印记阳性反应条带(1-7)的酶切质谱鉴定，发现条带1-2中含
有SARS冠状病毒中Spike蛋白和M蛋白；3-7条带鉴定为N蛋白。其中3-7
条带蛋白与SARS患者抗血清反应最为强烈，说明N蛋白是SARS冠状病毒
蛋白中免疫原性最强的蛋白。提示N蛋白作为主要的致病抗原刺激机体产生
抗体，参与体液免疫反应。
实施例二、SARS-CoV相关蛋白免疫原性的鉴定
1.研究目的与意义
1.1研究目的 利用间接免疫荧光技术(indirect immunofiuorescence
assay，IFA)检测临床SARS恢复期患者血清抗体滴度；并使用Western blotting
技术检测SARS-CoV相关蛋白的免疫原性。
1.2研究意义 SARS-CoV中具免疫原性相关蛋白的确定为SARS疾病
治疗研究，包括确定药物靶蛋白，设计安全合理的疫苗以及病毒攻击宿主细
胞和致病的机制研究提供了线索。
2.实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1病毒样品与细胞株对照
非洲绿猴胚肾细胞传代vero E6细胞为病毒攻击的宿主细胞。采用病毒攻
击宿主细胞后期，被攻击细胞阳性率90％以上的培养细胞裂解液为样品；模
拟攻击细胞培养物裂解液为对照。
2.1.2药品与试剂
间接免疫荧光法检测SARS冠状病毒抗体试剂盒(indirect immuno-
fluorescence assay，IFA)；
PVDF膜：Hybond-P，Amersham Pharmacia Biotech；
TBST缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.5，140mM NaCl，包含0.05％
Tween-20；
Tris-甘氨酸电转液：Tris 25mM，甘氨酸192mM，甲醇20％(v/v)；
封闭液：TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5，140mM NaCl，0.05％Tween-20)
含有5％脱脂奶粉；
辣根过氧化物酶连接羊抗人IgG抗体：horseradish peroxidase-linked
anti-human IgG antibody；
增强化学发光试剂盒：Enhanced Chemiluminescence Kit(ECL Santa Cruz
Biotechnology，Inc)；
X-医用感光胶片：X-Omat K film(Kodak)；
2.1.3抗血清
经11名临床确诊为SARS的患者同意，于恢复期(发病接受治疗14～
28日)取血，同时加入蛋白酶抑制剂以防蛋白降解，混合10名患者血清。4
静置1h 4000×g离心10min后吸取上层血清，分装后-80℃保存。对照正常血
清取自6名健康志愿者。
2.2实验方法
2.2.1 SARS恢复期患者血清的间接免疫荧光法抗体检测实验
分别取待测病人血清与正常对照血清标本各5μl，用血清标本稀释液进
行1∶10稀释，然后在56℃灭活30min。将SARS病毒抗原片取出，放置5min
平衡至室温。将灭活后的血清再倍比稀释成1∶20的样品。每份标本血清取两
个稀释度各10μl滴加在抗原片相应位置的孔中。置抗原片于湿盒中，37℃度
作用30min。将玻片取出，自来水冲洗，凉干。用荧光抗体稀释液将抗人IgG
荧光抗体以1∶40比例稀释，然后滴加10μl到相应的抗原片孔中。置抗原片
于湿盒中，37℃度作用30min，冲洗凉干。三色荧光显微镜(Olympus IX70，
Japan)和SPOT数字图像处理系统(Diagnostic instrument.inc，USA)观察分析
染色结果。
2.2.2 SARS-CoV相关蛋白免疫原性的western blotting检测实验
设计包括样品(SARS冠状病毒攻击vero细胞裂解液)和对照(模拟攻击
vero细胞裂解液)的三组实验组(A，B，C)，分别取100μg(A组)和两组
50μg(B和C组)的两样品冻干粉溶于18μL 1×SDS电泳上样缓冲液中。加入
1M DTT 2μL，95℃水浴10min充分还原。样品全部上样进行13％SDS-
PAGE分离。电泳完毕，取下凝胶，浸泡于Tris-Glycine电转液中。按胶面积裁
剪PVDF膜与滤纸，于电转液中浸泡片刻，按“阳极/吸水材料/滤纸/PVDF膜/
凝胶/滤纸/吸水材料/阴极”的次序放置各层并排除膜间气泡，装入电转槽中开
始转膜。100mA恒流转膜3小时，之后将膜和凝胶取出。凝胶进行考马斯亮
蓝染色，4℃保存，备用鉴定蛋白。电转后PVDF膜浸泡于封闭液中4℃过夜，
进行封闭。按照血清∶封闭液＝1∶1000的比例分别配制抗血清和正常血清的
一抗工作液，将A、B组膜分别转移至单一和10名患者来源的抗血清工作液中，
C组转移至对照血清工作液中，室温下摇床振荡2h。之后取出PVDF膜，用
PBST浸洗10min，共洗三次。按照辣根过氧化物酶连接羊抗人IgG抗体的工
作浓度配制二抗工作液(1∶10000)，将膜分别转移至二抗工作液中，室温摇
床振荡1h。取出PVDF膜，用PBST浸洗10min，共洗三次。最后，按照增强
化学发光免疫印记试剂盒的说明配制化学发光反应液，使膜浸入反应液中与
之充分接触。反应3min后，使用医用X光胶片显影0.5～5min，冲洗底片，凉
干备用。对照胶片与凝胶相对位置，切下与抗血清发生强烈反应的条带，4℃
保存，进行胶上酶切和质谱鉴定。
3.实验结果
3.1间接免疫荧光法抗体检测
如图4所示，间接免疫荧光检测患者血清抗体反应均为阳性，正常志愿
者血清为阴性。混合患者血清反应最强烈，单一患者血清较阳性对照反应略
弱。正常志愿者血清反应为阴性。
检测依照试剂盒说明进行，使用三色荧光显微镜(Olympus IX70，Japan)
和SPOT数字图像处理系统(Diagnostic instrument.inc，USA)观察分析。图
中绿色荧光显示了感染SARS-CoV的vero E6细胞；红色荧光为未被攻击vero
E6细胞。A)单一患者抗血清(入院21天)；B)10名患者混合血清(入院
14～28天)；C)6名正常志愿者混合血清；D)试剂盒阳性对照。
3.2 Western blotting检测
结果如图5所示。经过阳性反应条带(1-9)的酶切质谱鉴定，获得如
下结果：条带1-3均同时检测到SARS-CoV中Spike蛋白和M蛋白；4-9条
带鉴定为N蛋白。其中4-7条带N蛋白与SARS患者抗血清反应最为强烈，
其次为Spike蛋白和M蛋白共存的3号条带。图中A组与SARS恢复期患者
抗血清反应；B组与正常对照血清反应。结果显示病毒攻击细胞裂解液与患
者抗血清发生强烈反应(如箭头所示)；与正常血清无反应。vero E6细胞裂
解液与两种血清均无明显反应。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所
<120>SARS冠状病毒中的功能蛋白质
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>421
<212>PRT
<213>
<400>1
Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg
20 25 30
Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu Leu
50 55 60
Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Glu
115 120 125
Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly
180 185 190
Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala
405 410 415
Asp Ser Thr Gln Ala
420