一种治疗炎症性肠病的药物——羊表皮生长因子的提取、纯化工艺 技术领域
本发明涉及一种治疗炎症性肠病的药物——羊表皮生长因子的提取、纯化工艺。
背景技术
炎症性肠病(IBD)的发病率在我国有明显增高的趋势，已受到国内医学界的普遍重视。由于现有的IBD药物疗效欠佳，副作用多，因此新的治疗药物不断出现。表皮生长因子(EGF)首先由美国化学家Cohen从小鼠颌下腺提取，并于1962年被提纯，1995年1月12日被基因库注册。EGF是最早用于临床治疗胃肠道溃疡的细胞因子，能加速胃溃疡的治疗和抑制胃酸的分泌。对人和动物的胃和十二指肠溃疡研究表明，EGF聚集在溃疡区域，直接与溃疡边缘的细胞结合，使溃疡区有高浓度EGF，有利于溃疡愈合。EGF其他的生物学作用还包括促进人皮肤上皮细胞、角膜上皮细胞和哺乳动物上皮细胞的生长等。并且在国内外，天然与重组的EGF已应用于角膜、皮肤损伤和胃肠溃疡的临床试验。因此EGF的研究开发有重要的应用前景和经济价值，但目前普遍存在着投资大、收益率低等缺陷，使其不能完全产业化。生产EGF有三种方法：化学合成法，其合成的产物的纯度及产率度都无法满足工业化生产要求；基因工程法，但其制成的EGF价格昂贵；生物合成法，主要来源于小鼠颌下腺，而小鼠颌下腺来源有限。山羊颌下腺含有丰富EGF。143.0g山羊颌下腺冻干粉纯化可以得到EGF约为96.0mg，而山羊颌下腺制成冻干粉的得率为10％，这样总地得率为0.067mg/g腺体。每只山羊颌下腺约重10g，且山羊颌下腺为宰杀后废弃产品，因此有丰富的来源。其制作成本低、得率高适应于我国临床治疗的需要。
最初EGF的分离纯化有1972年Savage用酸抽提、BIO-纤维柱和DEAE-纤维柱制备。而后有1975年Cohen、Carpenter于从预处理的浓缩尿液中分离的5步法：Bio-Rex70柱吸附、Bio-GelP10柱过滤、Sephadex G-75柱过滤、DE-52、CM-52柱层析分离[10]。不管从天然还是基因工程，EGF的初始浓度总是偏低，需要经过较长时间的分离和纯化过程，才能得到相对较纯的EGF，工艺较复杂，而且成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、提取纯化周期短的羊表皮生长因子的提取、纯化工艺。
由于EGF是一种耐酸、热稳定的阳离子蛋白质，针对其特殊的理化性质，我们采用酸抽提法除去了绝大部分的杂蛋白，再经具分子筛效应的Sephadex G15凝胶层析及与阳离子不结合的DEAE Sphaeel层析柱，经SDS-PAGE电泳分析其相对分子量为6kDa，与人EGF的分子量相近，再经ELISA法、MTT法及小鼠睁眼、萌齿试验证明羊颌下腺冻干粉经纯化后为EGF。
本发明羊表皮生长因子的提取、纯化的步骤如下：
(1)、取羊颌下腺冻干粉，加入稀醋酸，混匀，制成匀浆液；
(2)、将匀浆液置于高速离心机中离心，取上清液；
(3)、将上清液的PH值调至6.5，置于4℃冰箱8～12小时；
(4)、置于高速离心机中离心，得到沉淀物；
(5)、在沉淀物中加入缓冲液，得到悬浮液；
(6)、将悬浮液装入Sephadex G15柱进行层析洗脱，然后用ELISA法检测活性洗脱峰；
(7)、将洗脱液过DEAE Sphacel阴离子交换柱，截留活性峰进行冷冻干燥即得。
其中，所述的稀酸可以是0.05N的醋酸；高速离心机的离心速度为15000rpm；调PH时用0.05N的NH4OH。
经ELISA法、MTT法及小鼠睁眼、萌齿试验证明羊颌下腺冻干粉经纯化后为EGF。
本发明EGF的提取、纯化工艺简单、提取纯化周期短，而且为今后建立一条适合国内条件的相对简单、高效的纯化途径。
试验：EGF对炎症性肠炎的药效学研究
一、材料与方法
(一)主要实验试剂及材料
1.十二烷基硫酸钠(SDS)：美国SERVE公司
2.16.7％邻联二茴香胺(O-dianisidine dihydrochloride)：美国Sigma公司
3.十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethylammonium Bromide，HTAB)：北京西中化工厂
4.其余试剂均为国产分析纯
(二)实验动物
健康、性成熟、一级质量标准的SD大鼠，雄性，体重250g～280g，由浙江大学医学院动物实验中心提供。全部采用架式笼养，自由食用全价营养饲料，每日晨8时清笼，饲养温度为20±1℃，湿度50～60％，光照每12小时明暗交替，通风8～15次/小时，单独空调。
(三)IBD制模法
在大鼠适应性喂养一周后，随机分为3组，即单纯造模组、生理盐水治疗对照组及EGF治疗组。每组10只。大鼠禁食24小时后用7％乙酸2ml经自制聚乙烯灌肠器(直径约2mm)灌肠，灌肠器插入深度为距肛缘8cm，倒提大鼠准确定时15秒后，经灌肠器再以同一深度用生理盐水5ml冲洗一次，24小时后即成模。
(四)给药方法
1.EGF治疗组，在造模成型后每日晨起空腹用纯化鉴定后的羊EGF270μg/次/只，用生理盐水2ml溶化后灌肠，疗程7天。
2.生理盐水治疗对照组在造模成型后每日晨起空腹给与生理盐水2ml每日灌肠。
3.单独造模组，造模后不灌肠饲养7天。
(五)标本制备：所有实验动物在疗程7天后禁食不禁水24小时，予乙醚麻醉处死，破腹暴露全肠，在距肛8cm处离断，取出肠段，沿肠系膜剪开并用生理盐水冲洗干净后，将肠粘膜平铺于泡沫板上，用大头针固定，肉眼观察肠粘膜的病理改变，计算粘膜损伤指数，并数码相机摄片，然后立即用10％的中性甲醛溶液固定，送浙大医学院病理室，石蜡包埋，每份蜡块制成厚度5μm的切片HE染色，镜下评价粘膜损伤指数。
(六)髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)检测方法：主要步骤如下：取大鼠肠组织300mg称重，于小烧杯中加磷酸缓冲溶液2.0ml，用剪刀剪碎，转移至试管中，于组织匀浆仪上匀浆10s，4℃20kg冷冻离心4000rpm×15min，弃去上清液，按50mg(组织)/1.0ml比例加入上述HTAB溶液，匀浆30s，超声匀浆10s，上述条件冷冻离心15min，转移上清液进行比色测定。取上清液0.1ml加O-dianisidine溶液(含0.0005％H2O2)2.9ml，在460nm处测定3min，计算每分钟吸光度的变化(ΔA460nm·min-1)。
(七)观察指标
1.一般情况：大鼠在饲养过程中的精神状态，活动情况，毛发光泽度，食欲，大便情况(血便、腹泻、大便次数增多等)，体重等。
2.肠标本大体观：肠粘膜的色泽、溃疡、出血点、充血等情况，其观察和评分标准如下[6](见表4)
表4 大鼠结肠粘膜肉眼评分标准：
分数 肉眼观察结肠
0分 无损伤，无充血水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡
1分 粘膜充血、水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡
2分 粘膜充血、水肿，粘膜粗糙，呈颗粒样，轻度糜烂，无溃疡
3分 粘膜充血、水肿，中度糜烂有单个溃疡
4分 粘膜充血、水肿，高度糜烂，有多处溃疡
5分 粘膜充血、水肿，重度糜烂，有＞1cm溃疡
3.肠标本镜下观：判定标准：低倍镜下取10个视野，按炎症细胞侵润的程度分成0、1、2、3四个级别。评分标准具体如下：(见表5)
表5 大鼠结肠组织病理评分标准
分数 镜下观
上皮及腺体的破坏
0分 正常
1分 上皮局部破坏
2分 上皮带状破坏或带状隐窝消失
3分 弥散和/或粘膜溃疡累及粘膜下和/或隐窝缺失
腺隐窝扩张
0分 正常
1分 局灶扩张
2分 条状扩张
3分 弥散扩张
杯状细胞耗竭及缺失
0分 正常
1分 轻度耗竭
2分 条状或中度耗竭
3分 弥散或完全耗竭
炎性细胞浸润
0分 无
1分 局限于上皮下，固有层或隐窝基层
2分 浸润粘膜基层
3分 严重广泛浸润达粘膜下和/或累及固有基层
水肿
0分 无
1分 局灶
2分 带状或/和中度弥散
3分 广泛及严重
血管充血
0分 无
1分 局灶
2分 带状
3分 弥散
隐窝脓肿
0分 无
1分 局灶
2分 条状
3分 弥散
萎缩
0分 无
1分 局灶
2分 条状
3分 弥散
4.MPO活性单位(U)定义为25℃时每分钟分解1μmol过氧化物的量。1μmolH2O2的吸光度改变为0.13×10-2/min，0.1ml样品单位组织的酶活性为：MPO(×103U)·ng-1组织＝ΔA460nm·min-1/1.13×10-2)÷5[7]。
二、结果
1.大鼠一般情况
造模组大鼠在灌肠后第15～24h起出现腹泻，表现为黄色或血性稀便和/或肛周体毛被稀便沾染，精神萎靡，喜拱背扎堆，活动量少，食欲减退，毛发欠光泽，体重增长较慢等。
生理盐水对照组在生理盐水灌肠后一直有稀便，肛周体毛不洁，精神差，活动少，食欲差，类似于造模组。
EGF治疗组在EGF灌肠后稀便于第三天起开始好转，肛周体毛逐渐变干净，精神状况好转，食欲好转，毛发光泽度好转，体重增加。(附图2、3)
2.大鼠肠粘膜肉眼改变(见表6)
造模组全部大鼠24h成模后均可见溃疡多而大、严重充血水肿、糜烂出血点、穿孔肠粘连等。
生理盐水对照组亦可见溃疡多而大、充血水肿、糜烂出血点、穿孔等。
EGF治疗组在第一天有1只大鼠肠穿孔死亡，剩余9只治疗后见有个别小溃疡、充血水肿、糜烂出血较上述两组明显好转，未见穿孔。(附图4、5、6)
表6 大鼠结肠粘膜肉眼评分结果
组别 动物数 组织损伤积分( x±S)
模型对照组 10 4.20±0.92
空白对照组 10 2.70±1.06
EGF组* 9 0.67±1.00
*与模型组比较P＜0.01，*与生理盐水对照组比较P＜0.05
3.大鼠肠粘膜组织病理变化(见表7)
造模组大鼠结肠粘膜可见粘膜上皮脱落、糜烂、炎症可累及肠壁全层，主要表现为中性粒细胞侵润，亦可见数量不等的巨噬细胞和嗜酸性细胞，另可见增生的纤维母细胞，溃疡周围可见隐窝变形。腺体增生，排列紊乱。肉芽组织增生，杯状细胞减少。粘膜及粘膜下充血、水肿及典型溃疡病形成。
生理盐水对照组粘膜充血水肿，可见典型溃疡，腺体增生，杯状细胞减少，炎症细胞浸润，腺隐窝扩张及隐窝脓肿。
EGF组结肠粘膜可见溃疡修复迹象，如溃疡边缘上皮修复，肉芽组织形成等。
表7 大鼠结肠组织病理评分结果
组别 动物数 病理损伤积分( x±S)
模型对照组 10 15.80±3.82
生理盐水对照组 10 9.90±1.85
EGF组* 9 6.67±2.29
*与模型组比较P＜0.01，*与生理盐水对照组比较P＜0.05
4.MPO值(见表8)
表8 各组大鼠MPO值(U/mg)
组别 动物数 MPO值( x±S)
模型对照组 10 2.16±0.39
空白对照组 10 1.93±0.63
EGF组* 9 0.97±0.12
*与模型组比较P＜0.01，*与生理盐水对照组比较P＜0.01
说明书附图
图1：本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明实施例进一步的说明。
实施例1：本实施例羊表皮生长因子的制备工艺如下：
(1)、取羊颌下腺冻干粉50g，加入0.05N的醋酸，混匀，制成匀浆液；
(2)、将匀浆液置于高速离心机中离心，离心速度为15000rpm，取上清液；
(3)、将上清液用0.05N的NH4OH调PH至6.5，置于4℃冰箱8～12小时；
(4)、置于高速离心机中，用15000rpm的速度离心，得到沉淀物；
(5)、在沉淀物中加入缓冲液Tris.HCL，得到悬浮液；
(6)、将悬浮液装入Sephadex G15层析柱进行层析洗脱，然后用ELISA法检测活性洗脱峰；
(7)、将洗脱液过DEAE Sphacel阴离子交换柱，截留活性峰进行冷冻干燥即得。
实施例2：EGF的鉴定
将实施例1所得到的EGF进行以下鉴定：
(一)、ELISA法：
在有EGF或EGF相同的抗原样品孔中，ELISA反应显色较深。结果见表1。
表1 纯化的山羊颌下腺EGF不同浓度ELISA测定OD值比较
稀释倍数 1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32
OD值* 0.687 0.577 0.452 0.427 0.312 0.254
OD值** 0.449 0.489 0.482 0.426 0.403 0.304
对照组 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002
*与对照组比较P＜0.01；**为重复测试的OD值，与对照组比较P＜0.01。两者差异均有显著性。
(二)、MTT法结果见表2
表2 纯化的山羊颌下腺对小鼠肾细胞的生长促进率(MTT法)
A值( x±S) 促进率(％)
空白组 0.141±0.02
羊-EGF* 0.265±0.02 87.94
h-EGF 0.268±0.02 90.07
*与对照组比较P＜0.01，差异有显著性；与h-EGF组比较P＞0.05，差异无显著性。空白对照为无ELISA反应的洗脱液EGF
(三)、小鼠萌齿和睁眼试验，结果见表3。
表3 山羊颌下腺EGF对新生小鼠睁眼、萌齿试验的观察(附图1)
空白组 EGF组*
(170μg/只/天)
萌齿时间 12天 11天
睁眼时间 14天 13天
*与对照组比较分别提前1天