新的转基因斑马鱼、基因片段和转基因斑马鱼的生产方法 【技术领域】
本发明涉及一种生产新的转基因金色斑马鱼(golden zebra danio)的方法。本发明也涉及新的基因片段和新的转基因金色斑马鱼。
背景技术
装饰类鱼是水产生意的一部分，它属于有着全球化产业的娱乐工业。因此，利用重组DNA和转基因技术来改良装饰类鱼能带来好的经济效益。
然而，传统的转基因技术只能生产表达发射镶嵌性的或弱的荧光的转基因鱼。这些鱼只能在具有特定波长的荧光显微镜下被发现。归咎于其不具实用性以及各种困难，先前的荧光鱼鱼种不能被消费者很好地接受且不具有装饰鱼的商业价值。
【发明内容】
本发明的目的是将重组DNA技术应用于商品化可获得的质粒构建体，如来自Clontech的pDsRed2-1以及p-αEGFPITR，来建立带有需要的转基因的幼苗地稳定来源。
本发明的另一个目的涉及基因片段，其包括(1)金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子；(2)荧光基因；(3)腺相关病毒的反向末端重复；和(4)来自pUC的一基础部分，该基因片段可产生一种骨骼肌肉发射红色荧光的新的金色斑马鱼鱼种。
本发明的另一个目的还涉及一种基因工程方法，其可产生带有荧光转基因并在其全身的骨骼肌中表达荧光蛋白的新的金色斑马鱼。
【附图说明】
图1说明了质粒构建体p-αEGFPITR及其限制性酶切位点。
图2说明了质粒构建体pDsRedITR及其限制性酶切位点。
图3说明了质粒构建体p-αDsRedITR及其插入的基因片段和限制性酶切位点。
图4是DNA片段p-αDsRedITR和限制性酶切位点的线性图示。
图5是DNA片段p-αEGFPITR和限制性酶切位点的线性图示。
图6是成功地转染了本发明的DNA三天后的金色斑马鱼胚胎(F1代)的照片，显示出红色荧光的表达。照片暴光时间为1/4秒。
图7是成功地转染了本发明的DNA三天后的金色斑马鱼胚胎(F1代)的照片，显示出绿色荧光的表达。照片暴光时间为2秒。
图8显示了新的金色斑马鱼(带有p-αDsRedITR转基因)在不同世代(F0、F1、和F2代)的遗传/表达率。
【具体实施方式】
为了避免现有技术的缺点，本发明的设计十分充分和严格，并有着概念上的突破。也就是说，金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子被引入如pDsRedITR，以得到新的质粒构建体p-αDsRedITR。然后，p-αDsRedITR被微注射到金色斑马鱼的受精的卵(第一次分裂前)的细胞浆中。这些卵将被用于筛选带有表达于鱼全身的骨骼肌的荧光转基因的后代。带有荧光转基因的后代将被用于进一步的繁殖。
与其他已有的方法相比，本发明的方法具有以下五个方面的提高：
1.主要材料构建体是质粒构建体p-αEGFPITR和如pDsRedITR，它们有着稳定和经济的来源。
2.新的DNA片段能使得金色斑马鱼全身的骨骼肌发射荧光。
3.微注射进受精卵的新的DNA片段能使金色斑马鱼全身骨骼肌发射更高比例和更高质量的荧光。
4.异源的转基因能被稳定地传递到下一代，因此能够应用经济而天然的繁殖方法。
5.在新的突变的金色斑马鱼鱼种，它的体内骨骼肌将发射一种荧光，容易被肉眼看见。在更短波长的光源下，鱼的红色荧光将被强化产生特殊的特征和美感。这将增加装饰鱼的附加价值。
本发明使用的荧光基因可以是红色荧光基因如DsRed，它能从Clontech的pDsRed2-1中获得，或者能是绿色荧光基因如GFP，它能从Amersham Bioscience购得。
如上所说，本发明提供了一种生产带有体内荧光得金色斑马鱼的方法，其包括：
(a)构建质粒，其从上游到下游包括ITR、CMV启动子、荧光基因、S40 polyA(聚腺苷酸)和ITR；
(b)用金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子(全身骨骼肌肌动蛋白基因表达)取代CMV启动子形成一个新的质粒构建体；
(c)线性化此新的质粒构建体；
(d)将此线性化的质粒构建体微注射到金色斑马鱼的受精卵中；
(e)选择具有荧光的卵；以及
(f)培育卵以产生带有全身荧光的金色斑马鱼。
线性化的质粒优选地选自
如图4所示的p-αDsRedITR(8.0千碱基对)
或
如图5所示的p-αEGFPITR(8.1千碱基对)
本发明的方法中使用的优选的荧光基因是来自pDsRed2-1的红色荧光基因或来自pEGFP-1的绿色荧光基因。
本发明也提供了从发明的方法中生产的全身带有荧光的金色斑马鱼。优选的金色斑马鱼全身有着红色或绿色荧光。
实施例
以下的实施例是非限制性的且仅仅是本发明的不同方面和特点的代表。
生产带有红色荧光的金色斑马鱼的方法
1.选择一种商品化可获得的质粒构建体pDsRed2-1以及p-αEGFPITR作为基础材料。质粒构建体pDsRed2-1能购自Clontech。质粒构建体p-αEGFPITR能根据相关的文献的描述(如“在F0代转基因鳉鱼(medaka，学名Oryzias latipes)中的恒定的GFP表达”，Chi-Yuan Chou等，转基因研究10：303-315，2001)生产。
2.从质粒pDsRED2-1中剪切出DsRed片段。然后，如图2所描述的，CMV启动子和两个腺相关病毒的反向末端重复(ITR)被连接到DsRed片段生成质粒构建体pDsRedITR。质粒构建体pDsRedITR获得了更大程度的表达稳定性。
3.新的质粒构建体p-αDsRedITR的形成
如图1描述的，通过用限制酶Nco I和Sal I消化的途径可以从质粒构建体p-αEGFPITR中获得金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子。Nco I首先被用于消化质粒构建体，补平酶切末端，继而用Sal I完全消化获得3.86千碱基对的片段。
如图2描述的，通过用限制酶Bam HI和Sal I消化，将CMV启动子从质粒构建体pDsRedITR中剪切。Bam HI被首先用于消化质粒构建体，补平酶切末端，继而用Sal I完全消化获得4.2千碱基对的片段。然后，金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子(全身骨骼肌肌动蛋白基因表达)在CMV启动子被剪切的位点被连接于质粒构建体pDsRedITR。获得的质粒构建体有着两个145碱基对的腺相关病毒的反向末端重复(ITR)。一个ITR是位于SV 40 poly A的3’末端。另一个是位于α-肌动蛋白基因启动子的5’末端。
如图3描述的，制备得到了全长为8.0干碱基对的质粒构建体p-αDsRedITR。质粒构建体p-αDsRedITR具有(1)金色斑马鱼α-肌动蛋白基因启动子(全身基因表达)；(2)海珊瑚红色荧光蛋白；(3)腺相关病毒的反向末端重复；和(4)pUC质粒构建体基础。
质粒构建体p-αDsRedITR被引入大肠杆菌5α以被大量的无性生产。
4.质粒构建体的线性化：
如图4描述的，来自p-αDsRedITR的适量的DNA被相应比例量的Not I限制酶所消化，少量的消化产物用于琼脂糖凝胶电泳分析，以确定其线性，所需的片段长度确实的8千碱基对。然后，消化的DNA产物被用相同体积的苯酚∶氯仿(1∶1)溶液提取，用乙醇沉淀，空气干燥，然后按10μg/ml浓度溶解在PBS中，以备用于细胞浆的微注射。
5.细胞浆的微注射
a.收集受精卵：在微注射前夜的11pm，且在孵育器进入暗周期前，鱼被收集在盒状的空间，用分离网分开。在下一个早晨和亮周期开始后，每15-20分钟收集鱼卵。每次微注射期间，30-40个卵被注射，和在每个试验中，250-300个卵被注射。
b.微注射：线性化的DNA被定量并溶解在含有稀释的酚红的5XPBS中以得到需要的浓度。用金色斑马鱼的微注射器(Drummond)的微毛细管拾起DNA，其中微毛细管的注射针头的大小为近10μm。当微针头进入细胞的细胞浆时，注射进的DNA是近乎为约2，3nl。
c.受精卵的培育：注射的卵被用无菌溶液清洗，培育在孵卵器中，其中温度被确定在28.5℃。24小时后在发育的胚胎中能观察到荧光。
6.荧光显微镜观察：
注射的胚胎被放置在含有水的器皿中。红色荧光的分布和特征能被在荧光显微镜(Leica MZ-12；荧光系统：光源Hg100W；主发射波长558nm，和主吸收波长583nm，过滤设定RFP-Plus；照相系统MPS60)下观察到。
7.转基因的生殖线传递
如图8描述的，产自用p-αDsRedITR片段微注射过的并有着全身性表达红色荧光蛋白的骨骼肌的胚胎的突变的新金色斑马鱼(F0)，与野生型杂交，生成表达同样荧光的F1后代。然后，有着荧光表达的F1再次与野生型杂交生成F2后代，后者均呈现红色荧光表达，并能被迅速地从没有荧光表达的鱼中区别开。转基因地金色斑马鱼和野生型之间的差别在蓝光下甚至可以被更好地区别。
本发明的DNA片段可以被改造成携带其他的荧光基因，和因此可以产生带有不同荧光的鱼。
其他的荧光转基因可以被引入到带有红色荧光的金色斑马鱼中而使得鱼有着不同的体色。
本发明的金色斑马鱼能被广泛地应用于医学和各种生命科学的研究，如细胞融合、克隆、核转移、细胞运动、细胞靶向和胚胎发育研究。
本发明已经结合实施例被充分详尽地描述，从而使得本领域人员能够实施，在无需脱离于本发明的精神和范围情况下，对本发明的各种变更、修改和改进应当是显而易见的。
本领域人员易于理解，本发明很适合去实施上述目的并得到上述的结果和优点，以及其内在固有的结果和优点。胚胎、动物、及其生产过程及方法是优选实施方案的代表，是示范性的，并不意味着对本发明内容的限定。本领域人员对其可以进行修改并有其他的用途。这些修改被包含在本发明的精神内并被所附权利要求书的内容所限定。
显而易见的是，本领域人员无需脱离于本发明的范围和精神，可以对在此阐述的发明做出不同的替代和修改。
在此所述的本发明可以在缺少未在此特别说明的任何成分和限定的情况下被实施。在此所采用的术语和表述方式是用做描述性的术语而不是限制性的，且不意味着使用这些名词和表达就不包括任何所示或所述的特性的等价物或其部分，但是要认识到在要求保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此，应当了解尽管本发明已经被优选的实施方案和任选的特征所特别地阐述，但本领域人员可对在此所阐述的概念做出修改和变更，而这些修改和变更被认为是在所附权利要求书所确定的本发明的范围内。
其他实施方案如以下的权利要求书所示。