3-羟基丙醛交联及消毒生物分子的用途和含交联生物分子的生物相容性植入 物、替代品或伤口敷料 本发明涉及一种生物相容性植入物、替代品或伤口敷料的制备，尤其指一种使用3-羟基丙醛来制备该生物相容性植入物、替代品或伤口敷料的用途。
Axelsson及其共事者报导了一种广谱抗微生物剂[Axelsson，L，Chung，T.C.，Dobrogosz，W.J.，Lindgren，L.E.，“Discovery of a new antimicrobialsubstance produced by Lactobacillus reuteri，”FEMS microbiol.Rev.，46，65，1987]，其系由乳酸菌Lactobacillus reuteri所产生，并命名为乳特宁(reuterin)。乳酸菌Lactobacillus reuteri生存于人类及动物的胃肠道，其在厌氧下代谢甘油可产生大量的乳特宁[Axelsson，L，Chung，T.C.，Dobrogosz，W.J.，Lindgren，L.E.，“Discoveryof a new antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri，”Microb.Ecol.，2，131-136，1989；Talarico，T.L.，Dobrogosz，W.J.，“Production and isolationof reuterin，a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri”，Antimicrob.Agents chemother.，32，1854-1858，1988]。乳特宁为3-羟基丙醛(3-hydroxypropino-aldehyde)，其为中性水可溶物质，能抑制细菌、酵母菌、霉菌及原虫活性(antiprotozoal activity)。目前，乳酸菌Lactobacillus reuteri及乳特宁仅用于食品的保存及灭菌。
各种固定剂包括甲醛、戊二醛、双醛淀粉和环氧化物已用于固定生物组织。临床上，最常使用的固定剂为戊二醛[Nimi，M.E.，Cheung，D.，Strates，B.，Kodama，M.，Sheikh，K.，“Bioprosthesis derived from cross-linked andchemically modified collagenous tissues，”in CollagenVol.III，M.E.Nimni(ed.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1988，pp.1-38]。戊二醛固定的生物组织已广泛用于制造修复心脏瓣膜的修复术、心脏修补、血管移植和韧带替代品。然而，戊二醛显著改变组织的刚性以及加速组织钙化的趋势是这种固定剂公认的缺点。
为了克服戊二醛(glutaraldehyde)固定的生物修复分子的缺点，本案发明人及共事者于公开号WO98/19718的PCT专利申请案或进入中国国家阶段的中国专利申请号97199454.4中揭示了适合作为植入物、伤口敷料和血液替代品的生物相容性、经交联的材料。该材料是如下制备的：用一种天然交联剂——京尼平(genipin)交联生物物质，如胶原(collagen)、脱乙酰壳多糖(chitosan)或血红蛋白(hemoglobin)。该交联剂的毒性比常规使用的试剂毒性低得多，而且所述经交联的产品具有良好的热和机械稳定性以及生物相容性。该专利内容在此作为参考引入。
本发明提供了一种使用3-羟基丙醛来交联一含胺生物分子以制备一生物相容性植入物、替代品或伤口敷料的用途。
本发明也提供了一种交联含胺生物分子的方法，包含将含胺生物分子与3-羟基丙醛接触一段时间。
本发明还提供了一种生物相容性植入物、替代品或伤口敷料，其中包含通过前述本发明方法进行交联所形成的交联的生物分子。
较佳地，该生物分子为结缔组织蛋白。更佳地，该结缔组织蛋白为胶原或胶原性物质衍生的明胶。
较佳地，该生物分子为脱乙酰壳多糖。
较佳地，该生物分子为血红蛋白，及该生物兼容性替代品为血液替代品。
于本发明地交联方法中，较佳地，该含胺分子及3-羟基丙醛在一含水介质中及4-50℃，较佳地25-45℃的温度下接触5-60小时，较佳地约48小时。
较佳地，该含水介质中3-羟基丙醛的浓度为0.01-1.0M，更佳地为0.03-0.2M。
较佳地，该含水介质的pH值为3-12，更佳地为4-10.5。
图1a和1b显示了3T3成纤维细胞的光密度(O.D.)读数，所述成纤维细胞是在MTT分析中得到的各种浓度的戊二醛(图1a)和乳特宁(图1b)作为药物的介质中培养而成。MTT50浓度根据测试试剂浓度来测定，所述测试试剂要求其光密度读数降至对照物的一半。
图2a和2b显示了不同固定持续时间下得到的戊二醛或乳特宁固定的组织的固定指数(图2a)和变性温度(图2b)，其中长方形点表示戊二醛固定的组织，圆点表示乳特宁固定的组织。
图3a和3b表示乳特宁固定的组织在不同pHs下的固定指数(图3a)和变性温度(图3b)。
图4a和4b表示乳特宁固定的组织在不同温度下的固定指数(图4a)和变性温度(图4b)。
图5a和5b表示乳特宁固定的组织在不同的起始固定剂浓度下的固定指数(图5a)和变性温度(图5b)。
如发明背景技术部分所涉及的文章中描述的，乳特宁具有抗细菌、霉菌及原虫活性。另外，还发现乳特宁、3-羟基丙醛能与游离含胺在生物组织内部发生反应，而且乳特宁可用作交联剂(固定剂)，并且临床上可用作生物组织、天然产物或合成聚合物的杀菌剂。乳特宁具有下述化学结构：HO-CH2-CH2-CH＝O，能由Lactobacillus reuteri在控制条件下制备。下述实施例中使用的乳特宁用高效液相色谱(HPLC)鉴定。
本发明研究了乳特宁的抗菌活性，其中戊二醛做对照。研究中测试用的微生物是Escherichia coli(ATCC 25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)，StapHylococcus aureus(ATCC25923)，和Bacillus subtillis(atcc 6633)。结果表明所有测试的微生物包括格兰氏阳性细菌(StapHy lococcus aureus和Bacillussubtillis)和格兰氏阴性细菌(Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa)对乳特宁都敏感。通常，25-35ppm的乳特宁能阻止所测试的微生物的生长，同时40-50ppm的乳特宁导致所测试的微生物死亡。然而，戊二醛的用量显著大于乳特宁的用量(大约高2-3倍)，这表明乳特宁的抗菌活性显著优于戊二醛。
本发明也研究了乳特宁的细胞毒性，其中戊二醛再次用作对照物。在体内，测试试剂(戊二醛相对于乳特宁)的细胞毒性使用来自老鼠的稳定的3T3成纤维细胞的细胞胞腔来评估，测试结果(光显微分析和MTT分析)用于测量在测试试剂处理过的培养基中的成活细胞的比例。
在测试中，3T3成纤维细胞种植在含10％羊胎血清(FCS，HycloneLaboratories，Logan，Ut.，USA)的1ml Dulbecco’s改性雕型介质(Dulbecco’smodified eagle medium)(DMEM，Gibco 430-2800EG，Grand Island，NY，USA)的24个井状容器盘中，每个井状容器内含有3×104个细胞。细胞培养环境维持在37℃含10％CO2空气的恒温潮湿环境中，在生长日志阶段的细胞然后暴露在各种浓度戊二醛或乳特宁作为药物的新的DMEM介质中。培养24小时后，井状容器中的生长介质移去，细胞用光学显微镜来照相。随后，细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次，然后存活的细胞数用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二酚基四唑溴(MTT，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)染料还原法间接测定。
MTT测试是基于MTT的还原进行的，所述MTT是一种黄色可溶染料，它通过线粒体琥珀酸盐脱氢酶来形成一种暗蓝色甲(formazan)产品。只有存活的活性线粒体细胞显著降低MTT的数量，变成甲。在测试中，20μlMTT溶液(0.5g/l在介质中，过滤杀菌的)添加到培养的井状容器中，在10％CO2氛围中37℃恒温3小时后，MTT反应介质除去，蓝色甲用100μl二甲基亚砜(DMSO)溶解。然后，光密度读数使用多井扫描分光光度计(MRX Microplate Reader，Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA，USA)在570nm波长下测量。
在介质中培养的无任何测试用交联试剂的3T3成纤维细胞的显微照片表明对照介质中培养的细胞融合在一起，所述细胞可用作评价戊二醛和乳特宁细胞毒性的对照物。在含各种浓度戊二醛和乳特宁作为药物的介质中培养的3T3成纤维细胞的显微照片表明：a)含浓度极低的戊二醛(0.05ppm)介质中培养的细胞融合在一起，b)戊二醛浓度增至5ppm，所有培养的细胞死亡，c)相比之下，乳特宁的浓度升到15ppm，细胞融合在一起。
图1a和1b阐明了3T3成纤维细胞的光密度读数，所述成纤维细胞是在MTT分析中得到的各种浓度的戊二醛和乳特宁作为药物的介质中培养而成。如图所示，随着测试试剂浓度的增加，用戊二醛作为药物介质培养的细胞，其光密度读数比用乳特宁作为药物介质培养的细胞读数降低得多得多。戊二醛的MTT50浓度大约为4ppm，比乳特宁的(约20ppm)低得多。
实施例1：生物组织的固定剂
材料和方法
在本实施例中，从屠宰场购得的猪心脏用作原材料，所购心脏在冷的生理盐水中运输。一旦到达，心脏首先用新鲜生理盐水去除组织上多余的血，附着的脂肪然后仔细地从心脏表面剔除。从回收到最初的组织固定，时间间隔最多不超过6小时。
在本实施例的第一部分，研究了乳特宁的组织固定速度，戊二醛作参照物。剔除过的心脏首先放置在室温(25℃)下的0.068M的戊二醛或乳特宁的磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH 7.4)一块6×6-cm的心脏，每次固定所使用的溶液量大约为100ml，每一被研究的样品组然后在不同的固定时间段(分别在最初的组织固定后5分、1h、4h、12h、24h、48h和72h)取出。乳特宁的组织固定速率通过控制固定指数的变化和固定过程中固定组织的变性温度来测定。
在本实施例的第二部分，研究了固定条件(pH、温度和起始固定剂的浓度)在组织固定程度的影响。乳特宁的组织固定程度通过测量固定组织的交联特性(固定指数和变性温度)来测定。为了阐明pH值对乳特宁的组织固定程度的影响，0.068M的乳特宁溶液在室温下(25℃)用下述溶液缓冲：柠檬酸/柠檬酸钠(pH 4.0)，PBS(pH 7.4)、硼酸钠(pH 8.5)或碳酸钠/碳酸氢钠(pH 10.5)。温度对乳特宁的组织固定程度的影响用下述温度：4℃、25℃、37℃或45℃以及用pH为7.4缓冲的0.068M的乳特宁水溶液来评价。为了阐明起始固定剂浓度对乳特宁的组织固定程度的影响，使用25℃下的pH为7.4缓冲的0.034M、0.068M、0.1M或0.2M的乳特宁水溶液，每次固定时间为72h。
由茚三酮分析而得的固定指数的定义为组织中的游离胺基与测试的交联剂反应，随后再固定的百分数。在茚三酮分析中，测试组织首先水解24h，然后称重，随后水解组织用茚三酮溶液加热20分钟。在与茚三酮加热后，溶液的光学吸光度用分光光度计(UV-150-02型，Shimadzu，Corp.，Kyoto Japan)记录，并使用各种已知浓度的甘氨酸作为标准。现已知道，在与茚三酮加热后，测试组织中的游离含胺数量与溶液的光学吸光度成正比。
每一被研究组的变性温度用Peerkin-Elmer差热分析仪(DSC 7型，Norwalk，Connecticut)测量。该技术广泛用于研究胶原组织的热转变。
结果
图2a和2b比较了在不同固定持续时间下得到的戊二醛或乳特宁固定的组织的固定指数和变性温度。如图2a和2b所示，固定开始时，戊二醛固定的组织的固定指数和变性温度都比乳特宁固定的组织增加得快得多。然而，固定48小时后，两个被研究组的固定指数和变性温度相类似。
固定使用的缓冲液的pH值对影响乳特宁固定的组织的交联特性起了重要作用。不同pHs下乳特宁固定的组织其固定指数和变性温度。通常，乳特宁固定的组织其固定指数随固定剂pH值的升高而增加。在pH值为7.4或8.5时，乳特宁固定的组织其变性温度比pH值为10.5时相对要大，而在pH值为4.0时，固定的组织其固定指数和变性温度最低。
固定温度显著影响乳特宁固定的组织的交联特性。温度对乳特宁固定的组织的固定指数和变性温度的影响在显示。图4a和4b表明，在37℃或45℃下固定的组织有类似的固定指数和变性温度。相比之下，4℃下固定的组织在所有不同温度下的被研究组中其固定指数和变性温度最低。
起始固定剂的浓度对乳特宁固定的组织的交联特性的影响在图5a和5b中给出，如图5a和5b所示，固定指数随起始固定剂浓度的增加而增大，乳特宁固定的组织在不同起始固定剂的浓度下的变性温度基本上相同。
实施例2：生物相容性研究和皮下研究
为了评价用乳特宁固定的生物组织的生物相容性，使用了一正在生长的老鼠原形进行皮下研究，新鲜的戊二醛固定的相应物作为参照。
材料和方法
新鲜的猪心用作原材料，并用如实施例1的方法处理。
剔除过的心脏用0.068M的戊二醛或京尼平溶液在37℃下固定3天。对每一块6-×6-cm的猪心来说，每一固定过程使用的溶液量大约为200ml，乳特宁溶液用硼酸钠(PH 8.5)缓冲，而戊二醛溶液用磷酸盐(0.01M，PH 7.4)来缓冲。固定后，测试样品分成两组。对第一组，用变换溶液的灭菌磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，时间大约为5h；对第二组，固定的心脏用一系列浓度递增的乙醇溶液(20％-75％)灭菌大约5h。
随后，测试样品在无菌条件下植入一生长中的老鼠原形皮下(6周，雄性，Winstar)。植入样品按下述方法修复3天和1、4、12周，修复样品的变性温度用差热分析仪(DSC 7型，Norwalk，Connecticut)测量。每一修复样品上沉积的钙浓度用原子吸收光谱分析。
结果
在整个测试中，发现新鲜样品比其它植入1周的其它固定样品瘦。手术4周后，新鲜样品完全降解，而其它固定样品保持完整。
在不同时间植入的相同被研究组的变性温度本质上相同。在固定的样品中，乳特宁固定的样品的变性温度和相应的戊二醛固定的样品相类似。固定的样品的变性温度为85℃，显著高于新鲜的样品(62℃)。
在所有的被研究组中，手术后修复3天的新鲜的用H&E染色的戊二醛和乳特宁固定的组织的显微照片表明，新鲜的组织有最显著的炎症。在这段时间修复的戊二醛和乳特宁固定的组织的炎症并非显著不同。手术4周后，每一被研究组比相应的手术后修复3天的相应物要严重。术后3天观察到的戊二醛和乳特宁固定的组织的炎症程度并非显著不同。
戊二醛和乳特宁固定的组织术后修复12周的显微照片也进行了拍摄，应该注意的是，由于新鲜组织的完全降解，不能拍摄到这一时间段修复的组织的显微照片。从显微照片中可观察到，所有固定样品的炎症程度比术后修复1和4周的样品要轻。引起注意的是，环绕乳特宁固定的组织的细胞炎症轻于戊二醛固定的组织。
新鲜的戊二醛和乳特宁固定的组织中钙的含量在植入前和术后修复3天、1和4周的结果列于表1中。应该注意的是，术后修复4周的新鲜组织由于完全分解而得不到数据。如表所示，对所有的被研究组来说，植入前和修复不同时间的样品中钙的含量的差别并不重要。
表1每一被研究组在植入前和在不同植入时间修复后的钙含量(μg/mg干组织的重量)*植入时间 鲜样 戊二醛 乳特宁0周(n＝4) 1.2±0.1 1.4±0.1 1.5±0.33天(n＝4) 1.3±0.1 1.5±0.3 1.5±0.21周(n＝4) 1.9±0.2 2.1±0.9 1.6±0.34周(n＝4) N/A# 1.8±0.6 1.7±0.5*所列数字是平均数±标准偏差。#N/A：由于新鲜组织在术后4周完全降解，得不到数据。另外，每一修复样品的拉伸强度用英斯特朗万能测试机(4302型)以50mm/min的恒定速度来测量。结果表明乳特宁固定的和戊二醛固定的样品的拉伸强度在植入前和术后修复不同时间段的拉伸强度相类似。
虽然本发明已参照较佳实施例披露于上，然而并非用于限定本发明。任何熟悉该领域者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作出各种变更与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求所界定的为准。