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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410839344.1(22)申请日 2014.12.30C07D 487/08(2006.01)A61P 39/06(2006.01)A61P 35/00(2006.01)(71)申请人 郑州大学地址 450001 河南省郑州市高新技术开发区科学大道 100 号(72)发明人 张静 何婷 张晓磊 苏丽(74)专利代理机构 郑州优盾知识产权代理有限公司 41125代理人 郑园 孙诗雨(54) 发明名称一种富勒烯双加成氨基酸及其合成方法(57) 摘要本发明公开了一种富勒烯双加成氨基酸及其合成方法，将富勒烯双加成吡咯烷与带有保护基的氨基。
2、酸溶于DCM/DMF混合液中，然后加入HOBT、DCC 和 DMAP，在常温下反应 20100 小时，柱层析分离后得到带有保护基的富勒烯双加成氨基酸 ；将得到的带有保护基的富勒烯双加成氨基酸加入TFA/DCM 混合液中进行保护基的脱除，反应 1 10小时，加入冰乙醚，得沉淀离心干燥后得到富勒烯双加成氨基酸。本发明的富勒烯双加成氨基酸具有良好的水溶性和生物相容性，大大提高了富勒烯在极性溶液中的溶解度，并具有良好的抗癌活性 ；优良的去除自由基方面性能 ；本发明的合成方法可适用于很多种氨基酸，进而得到多种富勒烯双加成氨基酸衍生物。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明。
3、专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图5页(10)申请公布号 CN 104478886 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104478886 A1/1页21.一种富勒烯双加成氨基酸，其特征在于结构式如下：其中，A为天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或胱氨酸。2.根据权利要求1所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于步骤如下：（1）将富勒烯双加成吡咯烷与带有保护基的氨基酸溶于DCM/DMF混合液中，然后加入HOBT、DCC和 DMAP，在常温下反应 20100小时，柱层析分离后得到带有保护。
4、基的富勒烯双加成氨基酸；（2）将步骤（1）中得到的带有保护基的富勒烯双加成氨基酸加入TFA/DCM混合液中进行保护基的脱除，反应1 10小时，加入冰乙醚，-4过夜，得沉淀，离心干燥后得到富勒烯双加成氨基酸；上述步骤均在无水无氧的条件下进行。3.根据权利要求2所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤（1）中富勒烯双加成吡咯烷、带有保护基的氨基酸、HOBT、DCC和DMAP的物质的量之比为 1：14 0 ：1 4 0 ：1 40：0.11。4.根据权利要求2所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤（1）中DCM/DMF混合液中DCM 和DMF的体积比为110：1。5。
5、.根据权利要求2所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中TFA/DCM混合液中TFA 与DCM的体积比为0.510：1。6.根据权利要求2所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中所需冰乙醚的体积为TFA/DCM混合液体积的120倍。7.根据权利要求2或3所述的富勒烯双加成氨基酸的合成方法，其特征在于：所述的氨基酸为：所述的带有保护基的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或胱氨酸。权 利 要 求 书CN 104478886 A1/6页3一种富勒烯双加成氨基酸。
6、及其合成方法技术领域0001 本发明属于医药领域，具体涉及一种富勒烯双加成氨基酸的合成方法。背景技术0002 自从1985年英国的Kroto教授等在对石墨进行激光蒸发时发现富勒烯以来，特别是1990年Krabtscher和Hufman等用电弧法制备了克量级富勒烯获得成功后，由于其独特结构而引起了极大的关注。富勒烯的60个p轨道构成的大键共轭体系使得它更兼具有给电子和受电子的能力，这一独特的电子特性使得它在诸如光电转换、非线性光学、有机存储器件、自组装膜和生物医学化学等领域表现出良好的应用前景。C60可以发生氢化、氧化、卤化、亲核加成、自由基加成、环加成以及配合等一系列的化学反应。0003 目前。
7、富勒烯衍生物在药物化学和其他学科领域有很重要的应用价值，由于富勒烯本身不溶于水，而富勒烯的生物学效应一般是在水环境体系下检测的，所以将富勒烯引入水体系是研究其生物学效应的一个首要前提。采用的主要方法是将富勒烯球进行化学修饰使产物具有水溶性，目前已经报道了各种不同结构的富勒烯衍生物的合成方法。合成的一个重要策略是将富勒烯与各种生物分子进行连接，这样得到的化合物具有富勒烯与生物分子的双重特性，因而可能改善生物分子的原有功能或者产生一些新的生物活性。0004 但是，简单地引入亲水链的富勒烯衍生物在极性溶剂中会造成C60球体的聚集，为此，我们需要设计合成出水溶性更好、生物相容性更高、毒性更小的富勒烯衍。
8、生物。发明内容0005 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术制备的富勒烯氨基酸衍生物可溶性差，生物相容性差及单加成氨基酸衍生物易聚集等问题，提供一种富勒烯双加成氨基酸及其合成方法，得到的富勒烯双加成氨基酸具有良好的水溶性和生物相容性，并且具有较好的自由基清除效应。0006 为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：一种富勒烯双加成氨基酸，结构式如下：说 明 书CN 104478886 A2/6页4一种富勒烯双加成氨基酸的合成方法，步骤如下：（1）将富勒烯双加成吡咯烷（合成方法见专利201410114391.X）与带有保护基的氨基酸溶于二氯甲烷（DCM）和N,N 二甲基甲酰胺（DMF）混合液中，。
9、然后加入二环己基碳二亚胺（DCC）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、4-二甲氨基吡啶（DMAP），在常温下反应20 100小时，柱层析分离后得到带有保护基的富勒烯双加成氨基酸；（2）将步骤（1）中得到的带有保护基的富勒烯双加成氨基酸加入三氟乙酸（TFA）和二氯甲烷（DCM）混合液中进行保护基的脱除，反应110小时，加入冰乙醚，-4过夜，得沉淀，离心干燥后得到富勒烯双加成氨基酸；上述步骤均在无水无氧的条件下进行。0007 所述步骤（1）中富勒烯双加成吡咯烷、带有保护基的氨基酸、HOBT、DCC和DMAP的物质的量之比为1：4 0 ：1 4 0 ：1 40：0.11。0008 所述步骤（1）中DCM。
10、/DMF 混合液中DCM和DMF的体积比为110：1。0009 所述步骤（2）中TFA/DCM 混合液中TFA与DCM的体积比为0.510：1。0010 所述步骤（2）中所需冰乙醚的体积为TFA/DCM 混合液体积的120倍。0011 所述的带有保护基的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或胱氨酸。0012 本发明的有益效果：（1）本发明通过酯化反应得到富勒烯双加成吡咯烷氨基酸，使富勒烯上带有更多活性基团；（2）本发明得到的富勒烯双加成氨基酸具有良好的水溶性和生物相容性，大大提高了富勒烯在极性溶液中的溶。
11、解度，并具有良好的抗癌活性；（3）本发明制备的富勒烯双加成氨基酸去除自由基方面性能优异；（4）本发明的合成方法可适用于很多种氨基酸，进而得到多种富勒烯双加成氨基酸衍生物；（5）本发明的富勒烯双加成吡咯烷氨基酸在生物医学领域有很多良好的应用，通过超氧阴离子自由基清除实验和羟基自由基清除实验等一系列生物学实验，可以得到富勒烯双加成在自由基清除方面有着较强的作用。0013 说明书附图图1为实施例1富勒烯双加成天冬氨酸的红外光谱图；图2为实施例1富勒烯双加成天冬氨酸的质谱图；说 明 书CN 104478886 A3/6页5图3为实施例2富勒烯双加成谷氨酸的红外光谱图；图4为实施例2富勒烯双加成谷氨酸的。
12、质谱图；图5富勒烯双加成天冬氨酸和富勒烯双加成谷氨酸清除自由基的能力图。具体实施方式0014 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0015 实施例1本实施例的富勒烯双加成天冬氨酸的合成路线为：本实施例的富勒烯双加成天冬氨酸的合成方法如下;（1）带有保护基的富勒烯双加成天冬氨酸（BFD1）的合成取一个 25mL 的单口圆底烧瓶，置于冰水浴中，称量 0.24mmol Boc-Asp(Otbu)-OH，0.32mmol 1- 羟基苯并三唑（HOBT），0.32mmol 二环己基碳二亚胺（DCC）放入其中，加入4mL 二氯甲烷（DCM）和 N,N 二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶液中 (。
13、V(DCM):V(DMF)=5:1)，反应0.5h，然后将产生的沉淀二环乙基脲（DCU）滤除掉，将滤液转移至25ml三口圆底烧瓶，再加入 0.008mmol 富勒烯双加成吡咯烷，0.0016mmol 4- 二甲氨基吡啶（DMAP），氮气保护，避光反应24h，TLC监控反应进程，旋蒸后用柱层析分离纯化，过柱纯化分离 ：产物进行硅胶（SiO2）柱层析分离，用甲苯/乙酸乙酯（v/v=2:1）进行洗脱，旋蒸后真空干燥得深棕色粉末产物；（2）富勒烯双加成天冬氨酸（BFD）的合成将0.003mmol 带有保护基的富勒烯双加成天冬氨酸溶解于 2ml三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷(DCM)（v/v=9：1）的混。
14、合溶液中，反应 h后，加入20ml冰乙醚，看到有棕褐色絮状沉说 明 书CN 104478886 A4/6页6淀出现，置于-4冰箱中过夜后，看到底部有棕色沉淀析出，离心后真空干燥，得到棕色粉末。0016 图1为富勒烯双加成天冬氨酸的红外谱图：max/(cm-1)：3421.82 为 -OH 的伸缩振动，2925.04，2856.02 为 CH2中 C-H 的拉伸振动峰，1654.31 为 C=O 的伸缩振动吸收，1389.26，1125.50，719.41 及 629.25 处为 C60 特征吸收峰，51556 为取代 C60 的标志。图2为富勒烯双加成天冬氨酸的高分辨质谱MALDI-TOF：理。
15、论分子量为1212.0，图中1213.5M+H+。0017 实施例2（1）带有保护基的富勒烯双加成谷氨酸（BFG1）的合成取一个 25mL 的单口圆底烧瓶，置于冰水浴中，称量 0.16mmol Boc-Glu(Otbu)-OH，0.16mmol HOBT，0.16mmol DCC 放入其中，加入 4mL 二氯甲烷和 DMF 的混合溶液中(V(DCM):V(DMF)=1:1)，反应0.5h，然后将产生的沉淀DCU滤除掉，将滤液转移至25ml三口圆底烧瓶，再加入 0.008mmol 富勒烯双加成吡咯烷，0.0016mmol DMAP，氮气保护，避光反应40h，TLC监控反应进程，旋蒸后用柱层析分离。
16、纯化，过柱纯化分离：产物进行硅胶（SiO2）柱层析分离，用甲苯/乙酸乙酯（v/v=2:1）进行洗脱，旋蒸后真空干燥得深棕色粉末产物；（2）富勒烯双加成谷氨酸（BFG）的合成将0.003mmol 带有保护基的富勒烯双加成谷氨酸溶解于2ml三氟乙酸/二氯甲烷（v/v=4：1）的混合溶液中，反应6h后，加入6ml冰乙醚，看到有棕褐色絮状沉淀出现，置于-4冰箱中过夜后，看到底部有棕色沉淀析出，离心后真空干燥，得到棕色粉末。0018 图3为富勒烯双加成谷氨酸的红外谱图：max/(cm-1)：3421.82 为 -OH 的伸缩振动，2922.92，2856.90为CH2中C-H的拉伸振动峰，1668.96。
17、为 C=O的伸缩振动吸收，1520.24为 N-H 面内弯曲振动峰，1136.28 及 720.91 处为 C60 特征吸收峰，519.54 为取代 C60 的标志。0019 图4为富勒烯双加成谷氨酸的高分辨质谱MALDI-TOF：理论分子量为1239.0，图中1239.0。0020 实施例3（1）带有保护基的富勒烯双加成苯丙氨酸的合成取一个 25mL 的单口圆底烧瓶，置于冰水浴中，称量 0.08mmol Boc-D-Phe-OH，0.08mmol HOBT，0.08mmol DCC 放入其中，加入 4mL 二氯甲烷和 DMF 的混合溶液中(V(DCM):V(DMF)=1:1)，反应0.5h，。
18、然后将产生的沉淀DCU滤除掉，将滤液转移至25ml三口圆底烧瓶，再加入 0.008mmol 富勒烯双加成吡咯烷，0.0024mmol DMAP，氮气保护，避光反应80h，TLC监控反应进程，旋蒸后用柱层析分离纯化，过柱纯化分离：产物进行硅胶（SiO2）柱层析分离，用甲苯/乙酸乙酯（v/v=2:1）进行洗脱，旋蒸后真空干燥得深棕色粉末产物；（2）富勒烯双加成苯丙氨酸的合成将0.003mmol 带有保护基的富勒烯双加成苯丙氨酸溶解于2ml三氟乙酸/二氯甲烷（v/v=5：1）的混合溶液中，反应8h后，加入4ml冰乙醚，看到有棕褐色絮状沉淀出现，置于-4冰箱中过夜后，看到底部有棕色沉淀析出，离心后真空。
19、干燥，得到棕色粉末。0021 实施例4（1）带有保护基的富勒烯双加成丙氨酸的合成说 明 书CN 104478886 A5/6页7取 一 个 25mL 的 单 口 圆 底 烧 瓶，置 于 冰 水 浴 中，称 量 0.008mmol Boc-Ala-OH，0.008mmol HOBT，0.008mmol DCC 放入其中，加入 4mL 二氯甲烷和 DMF 的混合溶液中(V(DCM):V(DMF)=1:1)，反应0.5h，然后将产生的沉淀DCU滤除掉，将滤液转移至25ml三口圆底烧瓶，再加入 0.008mmol 富勒烯双加成吡咯烷，0.0008mmol DMAP，氮气保护，避光反应20h，TLC监控。
20、反应进程，旋蒸后用柱层析分离纯化，过柱纯化分离：产物进行硅胶（SiO2）柱层析分离，用甲苯/乙酸乙酯（v/v=2:1）进行洗脱，旋蒸后真空干燥得深棕色粉末产物；（2）富勒烯双加成丙氨酸的合成将0.003mmol 带有保护基的富勒烯双加成丙氨酸溶解于2ml三氟乙酸/二氯甲烷（v/v=0.5：1）的混合溶液中，反应10h后，加入2ml冰乙醚，看到有棕褐色絮状沉淀出现，置于-4冰箱中过夜后，看到底部有棕色沉淀析出，离心后真空干燥，得到棕色粉末。0022 实施例5（1）带有保护基的富勒烯双加成缬氨酸的合成取 一 个 25mL 的 单 口 圆 底 烧 瓶，置 于 冰 水 浴 中，称 量 0.32mmol。
21、 Boc-Val-OH，0.32mmol HOBT，0.32mmol DCC 放入其中，加入 4mL 二氯甲烷和 DMF 的混合溶液中(V(DCM):V(DMF)=10:1)，反应 0.5h，然后将产生的沉淀 DCU 滤除掉，将滤液转移至 25ml 三口圆底烧瓶，再加入0.008mmol富勒烯双加成吡咯烷，0.008mmol DMAP，氮气保护，避光反应100h，TLC监控反应进程，旋蒸后用柱层析分离纯化，过柱纯化分离：产物进行硅胶（SiO2）柱层析分离，用甲苯/乙酸乙酯（v/v=2:1）进行洗脱，旋蒸后真空干燥得深棕色粉末产物带有保护基的富勒烯双加成缬氨酸；（2）富勒烯双加成缬氨酸的合成将0。
22、.003mmol 带有保护基的富勒烯双加成缬氨酸溶解于2ml三氟乙酸/二氯甲烷（v/v=10：1）的混合溶液中，反应 h后，加入20ml冰乙醚，看到有棕褐色絮状沉淀出现，置于-4冰箱中过夜后，看到底部有棕色沉淀析出，离心后真空干燥，得到棕色粉末。0023 本发明傅利叶红外光谱采用 IR-200 Spectrometer 红外光谱仪，溴化钾 KBr 压片法制样；质谱采用Bruker Daltonics Inc. BIFLEX 型 MALDI-TOF质谱仪。0024 本发明通过超氧阴离子自由基清除实验验证了富勒烯双加成氨基酸良好的自由基清除效应。0025 纳米溶液的制备：取160L的富勒烯双加成天。
23、冬氨酸的DMSO溶液，用微量进样器滴加，滴入20mL 45正在超声的三蒸水中，滴完后再超声30min，然后45旋转蒸发20分钟，待溶液体积为18mL时，向其中补加4mL三蒸水，重复三次，最后溶液终体积定为20mL，制得纳米水悬液的浓度为20mol/L。可用该纳米水悬液做清除自由基实验实验步骤如下：在 5mL 的 EP 管（离心管）中，加入 1500l 的 0.01 mol/L pH=8.00 的 Tris-HAc（2 mmol/L EDTA）缓冲液及1400L三蒸水，于25干燥箱中20min。后将预热25的15mmol/L焦性没食子酸100L与其迅速混匀，立即倒入4m L石英比色杯中，此为对照。
24、管；将对照管中的100L焦性没食子酸用100L的10mmol/L HAc溶液代替，此为标准管；将标准管中的1400L三蒸水用1400L待测样品，此为样品管。将石英比色杯中的溶液迅速混匀以后，用紫外可见分光光度计在320 nm处每隔15s测一次吸光度。具体加样情况如下表 ：说 明 书CN 104478886 A6/6页8图5富勒烯双加成天冬氨酸和富勒烯双加成谷氨酸清除自由基的能力图，从图5可以看出，富勒烯双加成天冬氨酸（BFD）和富勒烯双加成谷氨酸（BFG）均可以使邻苯三酚自氧化速率减慢，这说明两种物质均具有超氧阴离子自由基清除作用，且富勒烯双加成天冬氨酸的清除作用要强于富勒烯双加成谷氨酸。说 明 书CN 104478886 A1/5页9图1说 明 书 附 图CN 104478886 A2/5页10图2说 明 书 附 图CN 104478886 A。