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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410373621.4(22)申请日 2014.08.01C12N 5/077(2010.01)(71)申请人 广西医科大学地址 530021 广西壮族自治区南宁市双拥路22 号广西医科大学医学科学实验中心(72)发明人 郑立 雷丹青 陆真慧 卢海庆刘琴 赵劲民(74)专利代理机构 广西南宁明智专利商标代理有限责任公司 45106代理人 黎明天(54) 发明名称眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法(57) 摘要本发明涉及一种眼镜蛇毒神经生长因子将骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，它包括 ：从眼镜蛇毒中分离纯化 NG。
2、F ；从 SD 乳鼠的四肢骨髓中分离出间充质干细胞 ；将一定数目的干细胞悬液加入到含有 NGF 的培养基中进行诱导培养，诱导 7、14、21 天后，通过免疫组化、糖胺多糖定量检测以及聚合酶链式反应等技术手段研究自提取的蛇毒 NGF 对大鼠骨髓间充质干细胞的软骨诱导作用。实验结果表明眼镜蛇毒 NGF 能促进该细胞向软骨方向分化，说明眼镜蛇毒 NGF 是一种有潜力的治疗软骨缺损的生长因子，经本发明方法的诱导，所产生的软骨细胞可用于大规模的体内移植治疗软骨缺损，有利于软骨组织工程的临床推广和应用。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书6页。
3、 附图6页(10)申请公布号 CN 104480064 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480064 A1/2页21.一种眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征是：（1）从眼镜蛇毒中分离并纯化神经生长因子NGF；（2）采用PC12神经细胞株进行NGF的活性鉴定；（3）用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行NGF的纯度鉴定；（4）无菌条件下，从SD乳鼠的四肢骨头的骨髓中分离出大鼠骨髓间充质干细胞，放入含有15%FBS、1%青链霉素的-MEM培养基中；（5）体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；（6）选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24。
4、孔板中，浓度为每孔2104个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度，即3g/ml，6g/ml，12g/ml的NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天；阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子1、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% 胎牛血清；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% F。
5、BS；（7）诱导7、14、21天后，通过免疫组化检测型胶原的表达情况，苏木精-伊红染色观察各组细胞形态，DNA检测考察细胞增殖情况，利用二甲基亚甲基蓝检测细胞分泌的糖胺多糖含量，通过实时聚合酶链式反应检测软骨特异蛋白的表达量，从而鉴定自提取的蛇毒神经生长因子冻干粉对rBMSCs的软骨诱导作用。2.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：所述步骤（1）是称量眼镜蛇毒2g，在4环境下完全溶于10ml 1% 乙酸，12000 转/分钟，4，离心10分钟，收集上清液；将收集的上清液缓慢通过准备好的葡聚糖凝胶G-75凝胶柱中，层析仪设置流速1ml/分钟，每管10。
6、分钟，用1%HAC溶液进行洗脱，收集具有NGF活性的各峰段洗脱液，得到55ml；将得到的洗脱液透析过夜，期间换3-4次蒸馏水； 将透析后液体通过准备好的CM Sepharose CL-6B 离子胶，1mol/L NaCl和0.025mol/L、pH 为5.8的NaAC-HAC混合液进行线性洗脱，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。3.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：所述步骤（2）是将各峰冻干品配成2.0g/ml并作用于PC12细胞；24小时后，可见第三个峰样品组细胞长出多个神经纤维样突触，有长有短，突触数目不等，有部分甚至交织成网状，。
7、其他各峰样品组PC12细胞体积缩小，呈球形，无突起；表明第三峰为目的蛋白；步骤（2）的结果显示所提蛋白呈单一条带，说明所提的神经生长因子纯度较高。4.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：所述步骤（3）是将出生3-7天的SD乳鼠，无菌条件下取下乳鼠胫骨和股骨，在无菌培养皿中切除两端干骺端, 显露骨髓腔；然后用1ml无菌注射器吸取含15%FBS、1%青链霉素的-MEM基础培养基，将骨中的骨髓冲出，直至骨头发白；然后将含骨髓的培养基吹打均匀，分到培养瓶中。权 利 要 求 书CN 104480064 A2/2页35.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因。
8、子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：所述步骤（4）是将细胞培养瓶放入37、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，23天换液一次；细胞长至80%左右融合度，采用胰蛋白酶进行消化传代。6.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：所述步骤（5）诱导液可按分组进行配置，分组：空白组；阳性对照组，用含TGF-1的软骨诱导液培养；NGF浓度组包括：N1组，NGF终浓度3g/ml； N2组，NGF终浓度6g/ml和N3组，NGF终浓度12g/ml；N1、N2、N3组中的NGF都配制成各自浓度的诱导液，除TGF-1外，其他成分和软骨诱导液相同；每隔三天换液一次，。
9、7、14、21天后分别收集细胞。权 利 要 求 书CN 104480064 A1/6页4眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法技术领域0001 本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及眼镜蛇毒神经生长因子的制备和应用，及其诱导干细胞向软骨分化的方法和用途。背景技术0002 关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有血供，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复，这样就使得即使是极小的软骨缺损也无法自然修复。当关节软骨小面积的全层损伤后，软骨下骨髓可产生纤维软骨样修复。但这种修复产生的软骨细胞无论是形态还是功能特性与正常软骨相差甚远。事实上，损。
10、伤的关节会加速关节的骨化，细胞外基质降解的速率大于新基质的合成，从而导致关节炎。传统的治疗方法包括：关节内清理和灌洗术、关节削软骨磨成形术、软骨下骨钻孔术、关节面钻孔和微骨折法、截骨术等。此类方法可以部分减轻疼痛，有一定短期疗效，但都是以纤维软骨修复软骨组织为主，缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性，通常不能长期维持关节功能，而且还经常加速受损区域组织的进一步退行性变，难以获得满意的临床效果。0003 组织工程技术通过分离及培养所需的种子细胞、选择适合的支架材料、最后构建组织工程化软骨植入到缺损部位而完成治疗目的，一度成为软骨损伤修复研究的热门。组织工程研究涉及到种子细胞、支架材料和包括多种生长。
11、因子在内的生长环境3种基本要素。种子细胞主要包括软骨细胞和干细胞等。由于自体、异体或异种软骨细胞作为组织工程细胞存在来源以及免疫排斥等众多难以克服的限制性因素，因此，近年来，大量研究开始将注意力集中到干细胞研究领域。所谓干细胞，是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。来源于骨髓、肌肉、脂肪、骨膜及软骨膜等的干细胞，经一定条件的培养，均能够转化为软骨细胞。其中骨髓来源的间充质干细胞，即骨髓基质干细胞(BMSCs)具有较强的增殖能力，易从骨髓中分离和体外扩增纯化，便于自体移植，目前己经成为关节软骨组织工程研究的最重要的种子细胞来源之一。0004 现行的已得到普。
12、遍认可的BMSCs体外软骨定向诱导方案主要采用外加生长因子，在体外培养中添加转化生长因子（TGF-）、骨形态发生蛋白（BMP）等生长因子或活性大分子可诱导干细胞向软骨方向分化。生长因子在软骨组织工程中被广泛采用，可用于诱导间充质干细胞向软骨方向分化，在软骨损伤修复中发挥着重要的作用，促进软骨细胞的增殖、迁移、向软骨细胞分化和基因的表达。但是目前常用的生长因子存在提取工艺复杂、价格昂贵、容易降解等诸多弊端，不利于广泛的临床应用。因此，急需开发和寻找更易提取，成本低廉，同时具有软骨诱导活性的生长因子用于软骨缺损修复。0005 神经生长因子(NGF)是一类神经营养因子，价格低廉且提取工艺简便，如果能。
13、有效诱导干细胞成软骨分化，必将为关节患者带来福音。眼镜蛇毒资源丰富，且随着人工饲养技术的逐渐成熟，蛇毒的获取更为便利，为降低成本提供了空间。蛇毒中蕴藏着大量极具价值的活性物质，其中包括NGF。NGF是能够促进神经细胞生长的生物活性复合蛋白，也是迄说 明 书CN 104480064 A2/6页5今为止研究得最清楚的一个神经营养因子。它具有十分广泛的作用，NGF在轴突的生长、神经元的发育、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用，能够促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活及分化，营养成熟的神经元，维持其正常的生物学功能，并参与神经元的损伤修复等，NGF的非神经作用也日益引起人们的关注。已有研究。
14、表明，NGF对BMSCs有成骨诱导的作用，对骨缺损修复有积极的促进作用。0006 目前尚无报道有NGF对BMSCs有软骨诱导作用，且NGF应用软骨修复领域的报道也极少。但种种迹象表明NGF可能会对软骨修复有促进作用。有研究表明，NGF可能会在对抗关节炎中起作用，这在关节炎软骨中观测到有NGF表达。NGF还有可能与促血管因子生成相关，从而与骨关节炎有一定关系。进而有研究发现，NGF及其两个受体在透明软骨、纤维软骨和弹性软骨中均有表达，说明NGF及其受体可能参与软骨代谢过程。其他类似的研究表明，与NGF相近的神经蛋白分子也能促进软骨细胞增殖及软骨特异基质的分泌，可作为间接证据证明NGF会对软骨再生。
15、与代谢产生作用。0007 因此，为解决本领域面临的难题，使组织工程化软骨摆脱生长因子难以提取、价格昂贵、不易推广应用的限制，急需开发和寻找更易提取，成本低廉，同时具有软骨诱导活性的生长因子用于软骨缺损修复。发明内容0008 本发明的目的在于提供一种能诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的价格低廉、功能较强的诱导因子。0009 为完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：(1)从眼镜蛇毒中分离并纯化神经生长因子NGF；(2)采用PC12神经细胞株进行NGF的活性鉴定；(3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行NGF的纯度鉴定；(4)无菌条件下，从SD乳鼠的四肢骨头的骨髓中分离出大鼠骨髓间充质干细胞，放入含有。
16、15%FBS、1%青链霉素的-MEM 培养基中；(5)体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；(6)选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24孔板中，浓度为每孔2104个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度，即3g/ml，6g/ml，12g/ml的NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天；阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子1、50mg/m。
17、L胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% 胎牛血清；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS；(7)诱导7、14、21天后，通过免疫组化检测型胶原的表达情况，苏木精-伊红染色观察各组细胞形态，DNA检测考察细胞增殖情况，利用二甲基亚甲基蓝检测细胞分泌的糖胺多糖含量，通过实时聚合酶链式反应检测软骨特异蛋白的表达量，从而鉴定自提取的蛇毒神经生长因子冻干粉对rBMSCs的软骨诱导作用。0010 具体方法步骤如下：说 明 书CN 104480064 A3/6页6步骤1、称量眼镜蛇毒2g，在4环境下完全溶于10ml 1%。
18、 乙酸，12000 转/分钟，4，离心10分钟，收集上清液。将收集的上清液缓慢通过准备好的葡聚糖凝胶G-75凝胶柱中，层析仪设置流速1ml/分钟，每管10分钟，用1%HAC溶液进行洗脱，收集具有NGF活性的各峰段洗脱液，得到55ml；将得到的洗脱液透析过夜，期间换3-4次蒸馏水；将透析后液体通过准备好的CM Sepharose CL-6B离子胶，1mol/L NaCl和0.025mol/L、pH为5.8的NaAC-HAC混合液进行线性洗脱，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。0011 步骤2、将各峰冻干品配成2.0g/ml并作用于PC12细胞。24小时后，可见第三个峰样品组细胞长出多。
19、个神经纤维样突触，有长有短，突触数目不等，有部分甚至交织成网状，其他各峰样品组PC12细胞体积缩小，呈球形，无突起；表明第三峰为目的蛋白。0012 步骤2的结果显示所提蛋白呈单一条带，说明所提的神经生长因子纯度较高。0013 步骤3是将出生3-7天的SD乳鼠，无菌条件下取下乳鼠胫骨和股骨，在无菌培养皿中切除两端干骺端, 显露骨髓腔；然后用1ml无菌注射器吸取含15%FBS、1%青链霉素的-MEM基础培养基，将骨中的骨髓冲出，直至骨头发白。然后将含骨髓的培养基吹打均匀，分到培养瓶中。0014 步骤4是将细胞培养瓶放入37、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，23天换液一次；细胞长至80%左右融。
20、合度，采用胰蛋白酶进行消化传代。0015 步骤5：诱导液可按分组进行配置，分组：空白组；阳性对照组，用含TGF-1的软骨诱导液培养；NGF浓度组包括：N1组，NGF终浓度3g/ml； N2组，NGF终浓度6g/ml和N3组，NGF终浓度12g/ml。N1、N2、N3组中的NGF都配制成各自浓度的诱导液，除TGF-1外，其他成分和软骨诱导液相同；每隔三天换液一次，7、14、21天后分别收集细胞。0016 本发明的优点：本发明首次对眼镜蛇毒神经生长因子成软骨诱导作用进行了研究，实验表明，眼镜蛇毒NGF对rBMSCs无增殖活性，但它能促进rBMSCs成软骨分化，具有与TGF-1的作用效果相当的软骨诱。
21、导作用。眼镜蛇毒NGF以其提取工艺简单，成本较低，成软骨诱导效果良好的特点，有望作为TGF-1的替代生长因子用于软骨缺损修复。本发明提供了一种诱导成体间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，采用的诱导剂价格低廉，且诱导效果良好，经本发明方法的诱导，所产生的软骨细胞可用于大规模的体内移植治疗软骨缺损，有利于软骨组织工程的临床推广和应用。附图说明0017 图1蛇毒NGF的Sephadex G-75凝胶过滤图2眼镜蛇毒NGF的 CM Sepharose CL-6B离子交换分离图3 PC12 细胞检测NGF活性（分别采用NGF浓度a:2g/ml，b:4g/ml，c:6g/ml，d:8g/ml 对PC12细胞。
22、进行活性检测）图4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 NGF冻干品的纯度图5 HE染色图片图6型胶原免疫组化图片图7 DNA检测结果图8 GAG检测结果说 明 书CN 104480064 A4/6页7图9 Real-time PCR结果。具体实施方式0018 一、眼镜蛇毒NGF 的分离纯化和鉴定：（1）从眼镜蛇毒中分离并纯化神经生长因子NGF：通过葡聚糖凝胶G-75（sephadex G-75）凝胶柱和CM Sepharose CL-6B离子胶两步法，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。0019 （2）采用PC12神经细胞株进行NGF的活性鉴定：将各峰冻干品作用于神经细胞株PC12细胞，。
23、检验目的蛋白活性。结果表明第三峰为目的蛋白所在。0020 （3）用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行NGF的纯度鉴定：结果显示所提蛋白的呈单一条带，说明所提的神经生长因子纯度较高。0021 二、大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的培养（1）rBMSCs的提取：无菌条件下，从SD乳鼠的四肢骨头的骨髓中分离出大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs），放入含有15%胎牛血清（FBS）、1%青链霉素的-MEM培养基中。即无菌条件下取下SD乳鼠胫骨和股骨，用1ml无菌注射器吸取含15% FBS、1%青链霉素的-MEM基础培养基，将骨中的骨髓冲出，直至骨头发白。然后将含骨髓的培养基吹打均匀，分到培养。
24、瓶中；（2）rBMSCs的培养及扩增：体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；将细胞培养瓶放入37、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，23天换液一次；细胞长至80%左右融合度，采用胰蛋白酶进行消化传代。0022 三、NGF 诱导rBMSCs分化成为软骨细胞：（1）选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24孔板中，浓度为每孔2104个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度（3g/ml，6g/ml，12g/ml）NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物（ITS）、100nmol/L地塞米松、50g/。
25、ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清（FBS），每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天。阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子1（TGF-1）、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白 /硒混合物 ITS、100nmol/L 地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS。0023 （2）诱导7、14、21天后，通过免疫组化检测型胶原的表达情况，苏木精-伊红（HE）染色观察各组细胞形态，DNA检测考察细胞增殖情况，利用二甲基亚甲基蓝（DMMB）检测细胞分泌的糖胺多糖（GAG）含量，。
26、通过实时聚合酶链式反应（Real time PCR）方法检测各组软骨特异蛋白的表达量，从而鉴定自提取的蛇毒神经生长因子冻干粉对rBMSCs的软骨诱导作用。0024 本发明是一种将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的新方法，包括：a)称量眼镜蛇毒2g，在4环境下完全溶于10ml 1% 乙酸（HAC），4离心10分钟，收集上清液。将收集的上清液缓慢通过准备好的sephadex G-75凝胶柱中，层析仪设置流速1ml/分钟，每管10分钟，用1%HAC溶液进行洗脱，收集具有NGF活性的各峰段洗脱液，得到55ml。将得到的洗脱液透析过夜，期间换3-4次蒸馏水；将透析后液体通过准备好的CM 说 明 书。
27、CN 104480064 A5/6页8Sepharose CL-6B 离子胶，1mol/L NaCl和0.025mol/L NaAC-HAC（PH5.8）混合液进行线性洗脱，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。经sephadex G-75凝胶柱分离后，目的蛋白在第II峰，见图1。经CM Sepharose CL-6B离子胶分离，目的蛋白在第III峰，见图2。0025 b) 通过PC12细胞鉴定NGF活性试验：将各峰冻干品配成2.0g/ml并作用于神经细胞株PC12细胞。24小时后，可见第三个峰样品组细胞长出多个神经纤维样突触，有长有短，突触数目不等，有部分甚至交织成网状，其他各峰样品。
28、组PC12细胞体积缩小，呈球形，无突起。表明第三峰为目的蛋白。随NGF浓度增加，可见PC12细胞突触增多、变长，甚至成网状，说明效果提升。见图3。0026 c)NGF纯度鉴定及分子量的测定：所分离得到的具有生物学活性的NGF是在第峰，在还原条件下，经过浓度12.5SDS-PAGE电泳发现此峰只有一条带，为电泳纯，见图4。以标准蛋白的迁移率为横坐标，相应分子质量的对数值为纵坐标制作标准曲线，所得公式为Y=1.7913X+2.3365 ，R=0.0306。目的蛋白NGF换算后测定其分子量为14.5KD。0027 d) 将出生3-7天的SD乳鼠，无菌条件下取下乳鼠胫骨和股骨，在无菌培养皿中切除两端干。
29、骺端, 显露骨髓腔。0028 e) 用1ml无菌注射器吸取含15%FBS、1%青链霉素的-MEM基础培养基，将骨中的骨髓冲出，直至骨头发白。然后将含骨髓的培养基吹打均匀，分到培养瓶中，放入37、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。0029 f)选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24孔板中，浓度为每孔 2104个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度NGF（分为三组：N1组，NGF终浓度3g/ml； N2组，NGF 终浓度 6g/ml 和 N3 组，NGF 终浓度 12g/ml）、50mg/mL ITS。
30、、100nmol/L 地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天，14 天和 21 天。阳性对照组 (T 组 ) 采用的诱导液为：10ng/ml TGF-1、50mg/mL ITS、100nmol/L地塞米松、50g/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS；阴性对照组(K组)采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS。0030 g)HE染色：将细胞爬片取出，0.01mol/L PBS洗2次，1分钟/次；95%酒精固定20分钟，PBS洗2次，1分钟/次；苏木素染色23分钟，自来水洗两次；加自来水返蓝；若细胞核染色太。
31、深，可用1%盐酸酒精分色数秒，然后用水洗两次；伊红染色1分钟，水洗两次；脱水（80% 酒精 23分钟；95%酒精5分钟；无水乙醇5分钟）；二甲苯透明10分钟；吹干或自然晾干后，中性树胶封片。未添加NGF组绝大多数细胞为梭形，没有形成软骨陷窝样结构。诱导组中，TGF-组及N2浓度组，诱导7天后，就能看到许多细胞呈圆形或者椭圆形，与软骨细胞形态特征相似，还出现明显软骨陷窝样结构；诱导14天、21天后，软骨样细胞增多，软骨陷窝也增多。而N1和N3组相似，大多细胞呈梭型。7天时，有少量软骨样细胞呈现，无软骨陷窝样结构；14天时，软骨样细胞无明显增多，软骨陷窝也不明显；21天软骨样细胞增多，呈现软骨陷窝。
32、样结构。见图5。0031 h)细胞爬片免疫组化染色 ：将细胞爬片取出，0.01mol/L PBS洗3次，3分钟/次；95%酒精固定30分钟，PBS洗3次，3分钟/次；3% H2O2处理15分钟，PBS洗3次，3分钟/次；用山羊血清封闭15分钟；去掉血清（不要洗）后，滴加II型胶原一抗，置于湿盒37，说 明 书CN 104480064 A6/6页923小时；去掉一抗，PBS洗3次，3分钟/次；滴加二抗，室温孵育30分钟，PBS洗3次，3分钟/次；滴加现配的3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液，显微镜下观察显色35分钟；蒸馏水洗3次，3分钟/次，苏木素复染15秒，自来水返蓝，干燥，最后用中性。
33、树胶封片。检测各组型胶原的表达情况。诱导7天的各组，均未见型胶原阳性表达。而诱导14天，空K组型胶原免疫组化为阴性，表明未表达型胶原；TGF-1组及各NGF处理组，均有型胶原阳性表达，其中TGF-1组及N2浓度组表达较为显著。诱导21天后，空白组II型胶原表达较低，而TGF-1组及各NGF处理组，均有型胶原阳性表达，其中TGF-1组及N2浓度组表达较为显著。见图6。0032 i)DNA检测：吸掉24孔板中培养基，PBS洗一次，胰蛋白酶消化，离心收集细胞。弃去上清液后，加1mlPBS重悬细胞。然后加入5l 20mg/ml 蛋白酶K，58水浴过夜。采用Hoechst33528法，采用分光荧光计36。
34、5nm : 440 nm测定OD值，计算各组细胞DNA总量，以牛胸腺DNA为参照。7天、14天、21天可见添加NGF组较空白组均有显著性差异，表明NGF对细胞具有增殖活性。见图7。0033 j)GAG 检测：硫酸软骨素（CS）标准曲线绘制：分别取 CS 工作液 20l、40l、60l、80l、100l再分别加入2.5ml DMMB，混匀后，吸入96孔板中，每个浓度3个复孔。525nm检测光密度（OD）值，对应浓度，绘出标准曲线。样品GAG检测：吸掉24孔板中培养基，PBS洗一次，胰蛋白酶消化，离心收集细胞。弃去上清液后，加1mlPBS重悬细胞。然后加入5l 20mg/ml 蛋白酶K，58水浴过。
35、夜。取100l 样品，加2.5ml DMMB，混合均匀后，加入96孔板中，每组做4个复孔，525nm检测OD。结合CS标准曲线，计算出各组GAG的含量。每组测定5个样品的DNA和GAG总量，计算出单位DNA的GAG含量，用SPSS统计软件进行数据结果分析，P值小于0.01为特别显著差异（用*表示），小于0.05为显著差异（用*表示）。诱导7天、14天、21天，相比空白组，NGF各浓度组和TGF-1组细胞分泌的GAG含量均有所提高（p0.01），其中TGF-1组变化最为显著，N2-7 组其次。见图8。0034 按照总RNA小量制备试剂盒(Axygen，杭州)的方法提取总RNA，再采用反转录反应试。
36、剂盒（Fermentas公司，美国）进行逆转录。具体方法参照试剂盒说明。样本相对表达量的测定：按摸索好的条件和体系，分别测定蛋白多糖（Acan）、II型胶原（COL II）、I型胶原（COL I）、 X型胶原（COL X）、SOX9五个基因不同样品的Ct值，2- Ct计算基因表达的差异。用SPSS统计软件进行数据结果分析，P值小于0.01为特别显著差异（用*表示），小于0.05为显著差异（用*表示）。诱导7天后，各组中均检测不到COL II、COL X，而Acan、SOX9和COL I均有表达，T组最高，N2组其次。诱导14天后，各组仍然未检测到 COL X的表达 ；除 K 组外，其他各组均检测到 COL II 的表达，N2 组与 T 组表达最高；Acan、SOX9 和 COL I的表达，T组最高，N2组其次。诱导21天后，各组仍然未检测到COL X的表达 ；K 组COL II的表达极低，T组最高，N2组其次；Acan、SOX9和COL I 的表达，T组最高，N2 组其次。见图9。说 明 书CN 104480064 A1/6页10图1图2说 明 书 附 图CN 104480064 A。